Un método de alto rendimiento para la medición de la tasa de filtración glomerular en ratones conscientes

Resumen

La medición de la tasa de filtración glomerular (TFG) es el estándar de oro para la evaluación de la función renal. Aquí se describe un método de alto rendimiento que permite la determinación de la tasa de filtración glomerular en ratones conscientes mediante el uso de una sola inyección en bolo, la determinación de isotiocianato de fluoresceína (FITC) de la inulina en plasma y el cálculo de la TFG por un modelo de decaimiento exponencial de dos fases.

Resumen

La medición de la tasa de filtración glomerular (TFG) es el estándar de oro en la evaluación de la función renal. Actualmente, los investigadores determinar la TFG midiendo el nivel del biomarcador de creatinina endógena o exógena aplicada radiactivo inulina marcada ⁽³ H o ¹⁴ C). La creatinina tiene el inconveniente sustancial de que las cuentas de la secreción tubular proximal para obtener ~ 50% del total de la excreción de creatinina renal y por lo tanto, la creatinina no es un marcador fiable TFG. Dependiendo del experimento llevado a cabo, la depuración de inulina puede ser determinada por una inyección única en bolo o infusión intravenosa continua (minibomba osmótica o intravenosa). Ambos enfoques requieren la recogida de plasma o plasma y orina, respectivamente. Otros inconvenientes de inulina marcado radiactivo incluyen el uso de isótopos, consume mucho tiempo la preparación quirúrgica de los animales, y el requisito de un experimento de terminal. Aquí se describe un método que utiliza una única inyección en bolo deisotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con inulina y la medición de su fluorescencia en 1-2 l de plasma diluido. Mediante la aplicación de un modelo de dos compartimentos, con 8 colecciones de sangre por ratón, es posible medir la tasa de filtración glomerular en un máximo de 24 ratones por día utilizando un protocolo especial de flujos de trabajo. Este método sólo se requiere breve anestesia con isoflurano con todas las muestras de sangre que se recoge en un ratón que no sea sobrio y despierto. Otra ventaja es que es posible seguir los ratones durante un período de varios meses y tratamientos (es decir, haciendo experimentos emparejados con cambios en la dieta o aplicaciones de drogas). Esperamos que esta técnica de medición de la TFG es útil para otros investigadores que estudian la función del riñón del ratón y sustituirá a los métodos menos precisos para estimar la función renal, como la creatinina plasmática y urea en la sangre.

Introducción

La tasa de formación de ultrafiltrado de plasma en el glomérulo se ha convertido en la base para la evaluación de la función renal (filtrado glomerular TFG). El marcador ideal para determinar la TFG debe ser filtrada libremente, ni secretado o reabsorbido y no metabolizada. Tal comportamiento se encontró que era cierto para la inulina, y la depuración de inulina se ha convertido en un estándar de oro para la determinación de la TFG ^3. Mientras que el aclaramiento de creatinina se utiliza ampliamente como una medida de la tasa de filtración glomerular en los seres humanos y los animales, la creatinina no cumple los requisitos de un marcador ideal TFG. Alrededor de 10 - 40% de la depuración de creatinina en los seres humanos es la consecuencia de la secreción tubular activa ^{1, 11,} y la secreción renal de creatinina también es prominente en ratones y ratas ^{4, 7, 9, 22.} La disfunción renal se sabe que aumenta la secreción tubular de creatinina que limita su valor como un marcador de la TFG ^{1, 2.} Hemos demostrado previamente que el transportador de aniones orgánicos isoforma3 (OAT3) contribuye a la secreción de creatinina renal murina ^22. Sin embargo, la depuración de inulina normalmente requiere el uso de inulina marcado radiactivo ⁽³ H o ¹⁴ C). La determinación radiactiva de inulina puede ser utilizado tanto en los ratones anestesiados y consciente, pero alberga las desventajas de numerosas normas de seguridad estrictas y las cuestiones de manipulación inherentes con el uso de isótopos radiactivos. En ese sentido, los preparativos de remoción quirúrgica para la determinación de la TFG son mucho tiempo, así como de terminales en la naturaleza. En 1999. Lorenz et al ¹² introdujo FITC-inulina como un marcador de un solo nefrona TFG en ratones anestesiados. Cinco años más tarde Qi et al. ¹⁵ determina toda renal TFG en ratones conscientes utilizando FITC-inulina. Protocolos alternativos están utilizando FITC-inulina como un marcador exógeno para medir la TFG en ratones conscientes y anestesiados. Estos protocolos conservan la sensibilidad de inulina radiactivo mediante el uso de fluorescencia DETECTIy en eludir las desventajas de trabajar con un marcador marcado radiactivo. El ensayo de FITC-inulina fue modificado por otros ^{7, 8} y ^22, somos ²³ para tomar ventaja de la capacidad de microvolumen de la NanoDrop 3300 fluorospectrometer. Esto permite reducir el volumen total de la muestra necesario para <100 l de sangre por medición TFG.

Con el método y el protocolo de alto rendimiento proporcionada en esta publicación, se demuestra la factibilidad de medir la TFG en un máximo de 24 ratones conscientes por día. Esta técnica podría ser útil para otros investigadores que estudian murino TFG y esperamos que sustituirá a los métodos menos precisos como los índices de la función renal, como la creatinina y nitrógeno de urea en sangre.

Protocolo

1. Soluciones

1. 0,85% de NaCl: 8,5 g de NaCl / 1 l ddH ₂ O (8,5 g / L).
2. 0,5 mol / L de HEPES pH 7,4 (disolver 59,6 g de HEPES en 0,5 l de ddH ₂ 0 y ajustar el pH a 7,4 usando NaOH 10 N).

2. Preparación de la solución de inyección con FITC-inulina

1. Pesar con FITC-inulina para preparar una solución al 5% y se disuelven en 0,85% de NaCl (generalmente 100 mg / 2 ml de 0,85% de NaCl) por calentamiento a 90 ° C hasta que esté completamente disuelto.
2. Pesar disuelto solución de FITC-inulina y peso nota.
3. Corte un pedazo de 20 cm de la membrana de diálisis (peso molecular de corte: 1000) y poner en ddH ₂ O durante 30 minutos para retirar los residuos de NaN ₃ de la membrana y enjuague varias veces después.
4. Llenar disuelto FITC-inulina en membrana de diálisis y sellar adecuadamente con cierres.
5. Pesar la membrana entera de diálisis.
6. Coloque la membrana de diálisis en 1 l de solución de NaCl 0,85% y revuelva lentamente protegido de la luz durante 24 horas a rotemperatura de OM.
7. Pesar la membrana entera de diálisis nuevo y calcular la nueva concentración (agua osmóticamente mover en la membrana y FITC no unido, o unido con FITC-inulina <1.000 peso molecular se moverá fuera de la membrana, por lo que la concentración de FITC-inulina disminuirá sustancialmente) .
8. La nueva concentración de FITC-inulina (c) se calcula utilizando la siguiente fórmula: C = N / V, donde n = cantidad de FITC-inulina inicial, V = volumen nuevo (diferencia en el peso de un tubo de diálisis antes y después de la diálisis más el volumen inicial de solución de FITC-inulina).
9. Antes de su uso esterilizar solución dializada FITC-inulina por filtración a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras.
10. Mantenga FITC-inulina protegido de la luz (papel de aluminio) a 4 ° C. Dializada y esterilizado FITC-inulina se puede utilizar durante un máximo de 2 semanas. Participó FITC-inulina puede ser disuelto por re-calentamiento a 90 ° C durante unos pocos minutos.

Nota: si se utilizaFITC-sinistrina ^16-18, que no requiere diálisis, todos los pasos necesarios para la diálisis pueden ser omitidos.

3. Inyección y extracción de sangre

1. Tome el peso corporal (pc) de los ratones antes del experimento.
2. Anestesie ratones brevemente con isoflurano.
3. Para alto rendimiento de 6 ratones por favor siga el protocolo proporcionado en la Figura 3.
4. Inyectar 2 l / g de peso corporal de dializado con FITC-inulina en el plexo retroorbital, ²⁴ mediante el uso de una aguja G30 ½ (eliminar burbujas de aire de 100 l jeringa Hamilton por primera usando una aguja G26 en ½ y luego cambiar a un G30 ½ en la aguja para inyección).
5. Cortar 1 mm de la cola del ratón con tijeras una vez y recoger la sangre a los 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 y 75 min después de la inyección en Na-Heparina minicapillaries. Seal minicapillaries después de la extracción de sangre con el cha-sello.
6. Mantener las muestras protegidas de la luz.
7. Ponga sellada minicapillaries dentro hematocapilares crit y centrifugar durante 5 min.
8. Romper minicapillaries usando un cortador de diamantes y toda transferencia de plasma con la pipeta en un tubo de 0,2 ml.
9. Hacer una dilución 1:10 mediante el uso de 2 l de plasma y 18 l 0,5 mol / L de HEPES (pH 7,4) en el nuevo tubo de 0,2 ml (muestras podrían ser almacenados durante la noche a 4 ° C durante las mediciones de fluorescencia).
10. Mida 2 l de muestra diluida con NanoDrop 3300 por duplicado. La descripción y el uso del instrumento se describe aquí ^5.

4. Elaboración de Normas

1. Recoger la sangre de los ratones de la misma cepa de fondo en heparina recubierto capilares hematocrito, girar hacia abajo y se diluye 1:10 con 0,5 mol / L de HEPES (pH 7,4), por lo general 80 l de plasma + 720 l de HEPES.
2. Diluir solución inyectable FITC-inulina con plasma de ratón diluido para obtener las siguientes diluciones estándar:
   01:10: 10 l sin diluir solución de FITC-inulina + 90 l plasma de ratón diluido
   1:100: 10 y mu; L (01:10) + solución de 90 l de plasma de ratón diluido
   1:1.000: 10 l (1:100) + solución de 90 l de plasma de ratón diluido
   1:2.000: 30 l (01:01) + solución de 30 l de plasma de ratón diluido
   1:10.000: 10 l (01:05) + solución de 40 l de plasma de ratón diluido
   1:20.000: 20 l (01:01) + solución de 20 l de plasma de ratón diluido
   1:100.000: 10 l (01:05) + solución de 40 l de plasma de ratón diluido
   La concentración de los estándares dependerá de la diálisis y siempre será diferente para cada preparación de FITC-inulina. Es necesario introducir la concentración para la curva estándar nuevo cada vez.
3. Analizar los datos para calcular la tasa de filtración glomerular con el software apropiado (por ejemplo, GraphPad Prism) mediante el uso de una función de decaimiento exponencial de dos fases como se describe aquí en ^{15, 20} y se muestra en la sección de resultados Representante.

Resultados

FG se calcula utilizando la siguiente fórmula:

TFG = n / (A/K1 + B/K2), donde

n = cantidad inyectada (n = c • V, donde c = concentración de FITC-inulina, V = volumen inyectado)
A = casilla de verificación Período1, intersección y de la eliminación
K1 = constante para la eliminación de la caries
B = Span2, intersección y de distribución
K2 = constante de desintegración para la distribución

Nota: A, K1, K2 y B son abreviaturas dadas por GraphPad Prism, cada software capaz de analizar dos fases de decaimiento exponencial se puede utilizar, sin embargo, otro software científico podría utilizar diferentes abreviaturas.

Mediante el empleo de un ajuste de la curva de decaimiento exponencial de dos fases, que se basa en las concentraciones de FITC-inulina en plasma, se debe obtener una curva similar a la mostrada en la Figura 1. Cálculo de FG por la fórmula anterior se muestra (y como se describe en aquí ^{20) permite detectar el deterioro de la función renal 15 o hiperfiltración glomerular 8, 23 tal como se encuentra en ratones con diabetes mellitus tipo 1 (Figura 2).}

Figura 1. Para medir la TFG en ratones conscientes, se utiliza la cinética plasmática de FITC-inulina después de una inyección intravenosa de una dosis única. Para el cálculo de la TFG, se emplea un modelo de dos compartimentos. En el modelo de dos compartimentos, la fase inicial de la decadencia rápida representa la redistribución de FITC-inulina desde el compartimiento intravascular al fluido extracelular. La fase más tarde, con lenta decadencia de la concentración de FITC-inulina, refleja predominantemente aclaramiento sistémico del plasma.

Figura 2. Detection de hiperfiltración diabética en ratones de tipo salvaje. diabetes mellitus tipo I fue inducida por la aplicación intraperitoneal de estreptozotocina (STZ, 50 mg / kg durante 5 días consecutivos). TFG se determinó antes (basal) y 5 semanas después de la inducción de la diabetes. Debido a la retroalimentación túbulo glomerular, un aumento en la reabsorción proximal principal causa hiperfiltración diabética temprana ²¹ un hallazgo que se puede reproducir en los ratones de tipo salvaje (n = 10, p <0,01 vs basal mismo ratón).

Figura 3. Diagrama de flujo para la medición de la TFG en un conjunto de 6 ratones. Para medir toda renal TFG por el método de inyección de bolo único, 8 muestras de sangre debe ser recogido en 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 y 75 min después de la inyección de FITC-inulina. Los números indican los puntos de tiempo. Los números entre paréntesis indican el número de muestras. Los puntos del tiempo la izquierda de la línea vertical de color rojo indican la inyecciónpuntos de tiempo (a los 0, 11, 22, 33, 44 y 55 min). Cada ratón se marca con un color diferente. Para extracciones de sangre secuenciales seguir las flechas. Los recuadros grises indican cuando el siguiente ratón debe estar preparado para la anestesia con isoflurano antes de la inyección. El uso de este protocolo el tiempo mínimo entre 2 colecciones de sangre de diferentes ratones es de 1 min.

Discusión

El presente trabajo describe una técnica para la determinación de la tasa de filtración glomerular en ratones conscientes por inyección de un solo bolo y el análisis de fluorescencia en 8 muestras de sangre de dos fases de decaimiento exponencial. Una medición de la TFG en 1 ratón toma 75 min. Mediante el uso de un diagrama de flujo especial, es posible medir la tasa de filtración glomerular de 6 ratones en 130 min. Es factible que repetir este protocolo de diagrama de flujo de hasta 4 veces por día y medir la TFG en 24 ratones. Hemos modificado este método de manera que es posible recoger la sangre de un pequeño recorte de cola en lugar de punción vena de la cola, que es más rápido y más fácil para los investigadores para llevar a cabo en comparación con la punción vena de la cola. Mediante el uso de 10 l capilares hematocrito y una dilución 1:10, es posible reducir la cantidad total de sangre necesaria a <100 l. Por último, se mide la fluorescencia utilizando un NanoDrop 3300 fluorospectrometer, que permite la determinación de la fluorescencia en 1-2 l de muestra diluida. Este método le dará al interesado investigatora verdadero valor del FG. En contraste, las mediciones de creatinina en ratones tienen varias debilidades incluyendo "gama ciega creatinina" y las dificultades relacionadas con la determinación específica y sensible. El "rango ciego de creatinina" limita su función como un marcador para la TFG porque la creatinina sérica se mantiene en el intervalo normal hasta 50% de la función renal se pierde ^19. Dado que varios investigadores utilizan ratones modificados genéticamente en sus investigaciones para estudiar la fisiología renal y la fisiopatología, esto lleva al siguiente problema: suponiendo un ratón knockout de genes X tendría una tasa de filtración glomerular significativamente menor (un 40%) en comparación con un ratón de tipo salvaje, un de detección sencilla mediante la comparación de la creatinina plasmática no detectar esta diferencia. La necesidad de un buen método preciso de la determinación de la TFG se hace más crítica cuanto más pequeña de las diferencias en la tasa de filtración glomerular convertirse.

Los ratones tienen altas concentraciones de cromógenos no-creatinina en su plasma y orina que interfieren con la comercialmenteensayos de creatinina disponibles. Como consecuencia de ello, los ensayos que se basan en la reacción de Jaffé picrato alcalino sobreestimación concentración de creatinina en el plasma en comparación con la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) determinación ^{6, 13.} Otra limitación es que la creatinina en suero está por debajo de los límites de detección de los varios ensayos disponibles comercialmente en comparación con determinación por HPLC. Sin embargo, mediante el uso de reacciones enzimáticas investigadores fueron capaces de determinar la creatinina plasmática en ratones ^{10, 22.}

TFG en un rango similar se encontraron en ratones conscientes usando un método de inyección de un solo bolo similar así como aclaramiento urinario FITC-inulina ^14. En contraste con su protocolo, el protocolo de uso de recorte cola no requiere precauciones especiales para preservar la integridad de los vasos en comparación con vena de la cola o punción de la vena safena. Para el aclaramiento urinario / plasma basado FITC-inulina es necesario implantar quirúrgicamente dos millas osmóticanipumps. Dos bombas son necesarias para alcanzar suficientes altas concentraciones de estado estacionario en plasma FITC-inulina que se distinguen claramente del fondo. Esto también requiere el uso de jaulas metabólicas para una recolección de orina completa y cronometrada. Las jaulas deben ser enjuagados para dar cuenta de una pérdida de 25-37% de FITC-inulina, que se produce de otro modo sin enjuagar.

Los peligros de la utilización de este método FITC-inulina son limitadas. Los investigadores deben ser conscientes de los siguientes: (i) asegurar que no haya burbujas de aire en la jeringa usada para la inyección de la solución de FITC, (ii) la inyección retrobulbar completa debe lograrse porque la cantidad inyectada determina la tasa de filtración glomerular calculada, y ( iii) ratones serán más probable orinar durante el experimento de 75 min TFG, por lo que evitar la contaminación de las muestras de sangre con la orina, que tendrá una muy alta concentración de FITC-inulina como consecuencia de la capacidad de concentración de los riñones.

Ventajas generales of este método FITC-inulina incluyen los siguientes: (i) es una técnica no radiactivo, (ii) es posible repetir las mediciones varias veces en el mismo ratón, (iii) el ensayo puede llevarse a cabo en ratones conscientes, ( iv) no se requiere ninguna muestra de orina, y (v) una opción de alto rendimiento se puede utilizar. Desventajas de la sola inyección en bolo incluyen la necesidad de diálisis de FITC-inulina, que puede ser superado mediante el uso de una mejor FITC-marcador, FITC-sinistrina, que está disponible ahora y puede ser medida transcutánea usando un dispositivo miniaturizado especial ^18. A pesar de que la TFG se mide, no es posible medir excreciones fraccionales de fluido o iones con este método.

Tomados en conjunto, este método proporciona la viabilidad de un método de alto rendimiento para la medición de la TFG en ratones conscientes. Por lo tanto, esta técnica podría ser de interés para otros investigadores que están interesados ​​en la determinación de la función renal en ratones.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
FITC-inulina	Sigma-Aldrich	F3272
HEPES	Sigma-Aldrich	H7706
Isoflurano	Webster Membrana	de
(MWCO 1000)	Spectrum Laboratorios	132636
Cierre de membrana	Spectrum Laboratorios	132736
80 μ l Capilares de hematocrito	Drummond Scientific	22362566
centrífuga de hematocrito	IEC	Micro-MB
10 μ l Na+-Heparina minicápsulas	Hirschmann	9000210
Jeringa (100 μ l)	Hamilton	80601
Fluoroespectrómetro	Thermo-Fisher Scientific	NanoDrop 3300
Filtro (0.22 μ m)	Spectrum Laboratories	880-26464-UE
Sellador	Châ-sello	510
Agujas (G26 ½ y G30 ½)	Becton Dickinson	305111 & 305106