Medición de Ca intracelular 2 + Cambios en el esperma humano mediante cuatro técnicas: Fluorometría convencional, se detuvo Fluorometría Flow, citometría de flujo y Single imágenes de células

Summary

Intracelular de Ca ^{2 +} Dinámicas son muy importantes en la fisiología de esperma y Ca ^{2 +} Delicados tintes fluorescentes constituyen una herramienta versátil para su estudio. Experimentos Población (fluorometría y dejó de fluorometría de flujo) y los experimentos de células individuales (citometría de flujo y la imagen única célula) se utilizan para realizar un seguimiento espacio-temporal [Ca ^{2 +}] Los cambios en los espermatozoides humanos.

Abstract

Los espermatozoides son las células reproductoras masculinas, especialmente diseñados para alcanzar, reconocer y fusionarse con el óvulo. Para realizar estas tareas, los espermatozoides deben estar preparados para enfrentarse a un entorno en constante cambio y superar varias barreras físicas. Siendo en esencia transcripcional y traduccional en silencio, estas células móviles dependen profundamente de diversos mecanismos de señalización para orientarse y nadar de una manera dirigida, y para lidiar con las difíciles condiciones ambientales durante su viaje para encontrar el huevo. En particular, Ca ^{2 +-señalización} mediada es fundamental para varias funciones espermáticas: la activación de la motilidad, la capacitación (un proceso complejo que se prepara esperma para la reacción del acrosoma) y la reacción acrosómica (un evento de exocitosis que permite la fusión esperma-óvulo). El uso de colorantes fluorescentes para rastrear las fluctuaciones intracelulares de este ión es de notable importancia debido a su facilidad de aplicación, la sensibilidad, y la versatilidad de detexión. Utilizando un protocolo de tinte de carga solo utilizamos cuatro técnicas diferentes para controlar fluorométricas espermatozoides Ca ^{2 +} dinámica. Cada técnica proporciona información distinta que permite la resolución espacial y / o temporal, la generación de datos tanto en una sola célula y los niveles de población de células.

Introduction

Ca ^{2 +} es un segundo mensajero universal de las vías de transducción de señales en las células eucariotas. Intracelular de Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +} _i) participa en la regulación de muchos procesos fisiológicos fundamentales tanto en células excitables y no excitables. La importancia y la universalidad de la Ca ^{2 +} como segundo mensajero en la transducción de señales se deriva de su versatilidad espacio-temporal en la transmisión de información dentro de la célula. Mientras Ca ^{2 +} no puede ser sintetizado de novo o degradada dentro de la célula, su concentración intracelular ^{([Ca2 +]} _i)

Protocol

En este trabajo se reporta el uso de las cuatro técnicas antes mencionadas para medir la [Ca ^{2 +]} _i los cambios en los espermatozoides humanos. Se utilizó progesterona para desencadenar una respuesta de Ca ^{2 +,} ya que está bien establecido que este esteroide produce un transitorio ^{[Ca2 +]} _i aumentar en los espermatozoides. Particularmente, en el esperma humano, la progesterona activa directamente un canal de ^{Ca2 +} (es decir, CatSper) expresado exclusivamente en la membrana plasmática de las células de esperma ^10,11. También se midió en reposo [Ca ^{2 +]} _i antes y después ....

Results

Figura 1. Diagrama esquemático del protocolo experimental para la preparación de la muestra de esperma por el método de la piscina. Los pasos principales para la separación de espermatozoides móviles y para el ajuste de su concentración se ilustran. La última etapa de incubación sólo se realiza cuando se requiere capacitaci.......

Discussion

Señalización intracelular es vital para la mayoría de las actividades celulares; Ca ^{2 +} es un mensajero ubicuo que acompaña a las células de mamíferos a lo largo de toda su vida útil, desde su origen en la fecundación, hasta el final de su ciclo de vida. En respuesta a diferentes estímulos, [Ca ^{2 +]} i, oscila aumenta y disminuye con codificación espacio-temporal, en consecuencia, se activan diversos procesos, moduladas o terminado por Ca ^{2 +} mensajes codificados. Intracelular de Ca ^.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ham's F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A-7906
Cloruro de calcio dihidratado aprox. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler Cámara de recuento	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 viales/50 μ g cada uno
Ionomicina	Alomone	I-700
Progesterona	Sigma-Aldrich	P0130
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S-9888	Reactivos para medio de esperma humano (HSM)
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	P-3911	Reactivos para medio de esperma humano (HSM)
Bicarbonato de sodio	JT Baker	3506	Reactivos para medio esperma humano (HSM)
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	M-2670	Reactivos para medio esperma humano (HSM)
Cloruro de calcio anhidro	Sigma-Aldrich	C-1016	Reactivos para medio esperma humano (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Reactivos para medio esperma humano (HSM)
D-Glucosa	JT Baker	1906-01	Reactivos para esperma humano medio (HSM)
Piruvato de sodio	Sigma-Aldrich	P-2256	Reactivos para medio espermática humana (HSM)
L-lactato de sodio (aprox. 99%)	Sigma-Aldrich	L- 7022	Reactivos para medio esperma humano (HSM)
Yoduro de propidio	Invitrogen	L-7011	Componente B
Triton X-100 (t-octilfenoxipolietoxietanol)	Sigma- Aldrich	X-100 Solución de	2,4 mM en agua
Cubreobjetos redondos	VWR	48380 080	25 mm
de diámetro Solución de poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P8920
Cloruro de manganeso	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Cámara celular, para microscopía	Life technologies	A-7816
Sulfuro de dimetilo	Sigma-Aldrich	D2650	5x5 ml