El aislamiento, tratamiento y análisis de células gingivales murinos

Resumen

Este estudio describe una técnica eficiente para aislar y procesar los tejidos gingivales de la cavidad oral del ratón con el fin de producir un cultivo de una sola célula. Las células resultantes pueden ser utilizados además para el análisis de citometría de flujo y los estudios moleculares.

Resumen

Hemos desarrollado una técnica para aislar y procesar precisamente tejido gingival murino para citometría de flujo y los estudios moleculares. La encía es un tejido único e importante para estudiar los mecanismos inmunes, ya que está implicado en la respuesta inmune del huésped contra la biopelícula oral que podría causar enfermedades periodontales. Por otra parte, la estrecha proximidad de la encía al tejido óseo alveolar también permite el estudio de la remodelación ósea en condiciones inflamatorias. Nuestro método produce gran cantidad de células inmunes que permite el análisis de incluso poblaciones de células raras, tales como las células de Langerhans y células T reguladoras como hemos demostrado previamente ^1. El empleo de los ratones para estudiar las respuestas inmunes locales implicadas en la pérdida de hueso alveolar durante enfermedades periodontales es ventajoso debido a la disponibilidad de diversas herramientas inmunológicas y experimental. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño y el acceso relativamente inconveniente para la encía murino, muchos estudios evitarse examen de thitejido crítico s. El método descrito en este trabajo podría facilitar el análisis gingival, los que podrán aumentar nuestro subestimando sobre el sistema inmune oral y su papel durante las enfermedades periodontales.

Introducción

Encía es el tejido blando que rodea la porción cervical de los dientes y cubre el proceso alveolar (Figura 1). La encía es un tipo de la mucosa masticatoria que se puede separar más a fondo en epitelio de la mucosa y tejido conectivo (también conocido como submucosa o lámina propia). La estructura anatómica de la encía y los dientes adyacentes permite que las bacterias residen y desarrollan la placa (biopelícula) que desafía continuamente el sistema inmune local. Como resultado, la respuesta inflamatoria se desarrolla en la encía, lo que en ciertas circunstancias se convierte en destructivo - una condición denominada enfermedades periodontales ^2. Básicamente, patologías periodontales inducidas por placa se pueden dividir en la gingivitis y la periodontitis. Gingivitis representa una condición reversible de la respuesta inflamatoria local que se limita a la encía. La periodontitis, en el otro lado, es un proceso destructivo irreversible en la cual el aparato de inserción (hueso alveolar, periodontalligamento, cemento y encía) se destruye ^3.

La encía se propuso servir a los sitios, tanto como efectores e inductivo en enfermedades periodontales ^4. Los estudios en humanos han sugerido que, en respuesta a la placa dental, células efectoras inmunes y las moléculas se infiltraron en la encía o de salida ^5-7 dinámicamente. Esta actividad ha demostrado desempeñar un papel importante en la destrucción periodontal ^8,9. Considerando que los datos generados por los estudios proporcionaron información valiosa con respecto a este proceso patológico, que trabaja con tejidos humanos poseen importantes limitaciones éticas, técnicas y experimentales. El desarrollo de modelos experimentales animales experimentos de causa-efecto mediante el empleo de ratones transgénicos y en las intervenciones in vivo ^10. Como resultado, nuestro conocimiento de los mecanismos implicados en la enfermedad periodontal aumentó considerablemente durante las últimas dos décadas. Aún así, debido a la complejidad de las enfermedades periodontales, hayun debate sobre la naturaleza de la respuesta inmune local para facilitar la destrucción del tejido. Hay también una falta en nuestra comprensión de la función de las células inmunes centrales en la encía durante enfermedades periodontales. Es por lo tanto esencial para estudiar eventos inflamatorios patológicos que se producen en el tejido diana de la enfermedad, la encía.

Protocolo

Preparar de antemano:

• PBS + 2% de FCS
• PBS + 2% de FCS con 2 mg / ml de colagenasa tipo II y 1 mg / ml de DNasa tipo I (1 ml por muestra)
• Instrumentos quirúrgicos esterilizados
• Solución de EDTA 0,5 M

1. Técnica de escisión gingival superior

1. La eutanasia a los ratones con orientación IACUC aprobado.
2. Corte ambos lados de la cavidad oral, incluyendo las mejillas y la línea de la mandíbula con rectas / romas tijeras rectas.
3. Tire hacia abajo la mandíbula.
4. Cortar los tejidos blandos y duros en una línea imaginaria 1 mm por detrás de los molares tercios con unas tijeras estándar. Dirigir las tijeras perpendiculares al plano del hueso palatino (Figura 2A, las líneas azules).
5. Una incisión en los tejidos blandos y duros 2 mm por detrás de los incisivos (Figura 2A, las líneas azules).
6. Tire hacia abajo la parte anterior de la boca. La cavidad nasal es observable después de este paso.
7. Coloque las tijerasparalelo al paladar, puso una hoja en la cavidad nasal, la otra cuchilla debe incidir en el vestíbulo. Corte hasta que la incisión posterior (Figura 2A, línea verde). Repita este paso en ambos lados del maxilar. Al final del maxilar superior se separa del resto del cráneo (Figura 2B).
8. Retire el maxilar, se corta en la sutura media (Figura 2, línea de trazos negro) y recortar el tejido palatino de cada hemi-maxilar hasta alcanzar el hueso alveolar.
9. Pelar los tejidos gingivales (ambos hemi-maxilares) a partir de su borde anterior con Adson fórceps (sin dientes).
10. Coloque la encía extirpado en una placa con PBS + 2% FCS.

2. Gingival Procesamiento

1. Ponga la encía extirpado en una placa de cultivo de tejido (35 x 10 mm) con 1 ml de PBS + 2% de FCS, 2 mg / ml de colagenasa tipo II y 1 mg / ml de DNAsa I. Tipo
2. Picar bien el tejido con una cuchilla de 15 ° N quirúrgico estéril.
3. Transfer el tejido de la placa a un ml tubo de ensayo cónico de 15.
4. Lavar las células de los tejidos / restantes en la placa con 1 ml de PBS + 2% de FCS y la transferencia al mismo tubo de ensayo.
5. Incubar en un agitador incubador durante 20 min a 37 ° C, 200 rpm (recomendación: precalentar el incubador).
6. Añadir 20 l de EDTA 0,5 M y se incuba durante otros 10 min a 37 ° C, 200 rpm.
7. Llenar el tubo de ensayo hasta 12 ml con PBS + 2% de FCS y se centrifuga a 4 ° C, 400 xg durante 8 min (recomendación: pre-enfriamiento de la centrífuga).
8. Retire las células sobrenadante y resuspender con 2 ml de PBS + 2% de FCS.
9. Filtrar la muestra con una célula de 70 micras-colador y guardar el flujo a través.
10. Se centrifuga a 4 ° C, 320 xg durante 5 min.
11. Eliminar las células sobrenadante y resuspender con 300 l de PBS + 2% FCS.
12. Contar las células (células de aproximadamente 5-10 x 10 ⁵ Se espera que a partir de un solo maxilar).

3. Anticuerpo extracelulares e intracelularesLa tinción para el Análisis de Citometría de Flujo

Se recomienda para trabajar dentro de una campana, con las luces apagadas. Es crítico para mantener las células en ambiente frío constante, así como todos los materiales necesarios.

1. Mancha de las células contra moléculas extracelulares mediante la adición de 0,2-0,5 g de cada anticuerpo seleccionado por 1 x 10 ⁶ células en un volumen total de 100 l.
2. Brevemente Vortex.
3. Incubar los tubos durante 15 minutos en la oscuridad a 4 ° C.
4. Lavar las células con 2 ml de PBS + 2% FCS.
5. Se centrifuga a 4 ° C, 320 xg durante 5 min.
6. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células añadiendo, gota a gota, 500 l BD frío Cytoperm / Cytofix mientras vórtice.
7. Incubar los tubos durante 40 min a 4 ° C en la oscuridad.
8. Brevemente Vortex.
9. Lavar las células dos veces con 1 ml frío BD Perm / Tampón de lavado y centrifugado a 800 g durante 7 min a 4 ° C.
10. Aspirar el sobrenadante con excepción de 300 l.
11. Mancha de células intracelularmente porla adición de 1 g de cada anticuerpo seleccionado por 1 x 10 ⁶ células en un volumen total de 100 l.
12. Brevemente Vortex.
13. Incubar durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C.
14. Lavar las células dos veces con 1 ml frío BD Perm / Tampón de lavado y centrifugado a 800 g durante 7 min a 4 ° C.
15. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células añadiendo 300 l BD Perm / Wash Buffer frío.
16. Brevemente Vortex.
17. Transferir la suspensión mientras se filtra a tubos de FACS.
18. Mantener los tubos en un lugar oscuro y frío hasta su análisis.

Resultados

Se presentan ejemplos de análisis de citometría de flujo en células de la encía. Células gingivales agrupados a partir de 2 ratones se llevaron a cabo en un citómetro de flujo LSR II y analizados utilizando el software FlowJo. Figura 3A demostraron la distribución de células de la encía de los ratones no tratados previamente en una dispersión lateral (SSC) frente a dispersión trama hacia adelante (FSC). Estrategia de apertura de puerta para identificar (i) linfocitos (ii) los monocitos / células dendrít...

Discusión

Tejidos gingivales Maxilla obtenidos a partir de un solo ratón son suficientes para el análisis de subpoblaciones de linfocitos T y B, así como su capacidad para expresar moléculas extracelulares e intracelulares como hemos descrito anteriormente en ^1. Sin embargo, si las poblaciones de células raras son de interés (por ejemplo, DC), se recomienda a los tejidos piscina 2-3 ratones. De nota, si así se prefiere, es posible despegar ambos los tejidos gingivales y palatales y luego a impuestos especiales, la encí...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Colagenasa Tipo II	Worthington Biochemical Corp.	CLS-2
DNAse I	SIGMA	DN25-1G
EDTA	SIGMA	E6758-100G
PBS de Dulbecco	SIGMA	D8537
Suero Fetal Bovino	Industrias Biológicas	04-121-1	inactivado por calor
	Jet Biofil	FPE-204-500
5 ml Poliestireno de fondo redondo Tubo	BD Falcon	352052
Filtro de celdas 70 μ m	SPL Lifesciences	93070
Plato de cultivo de tejidos 35× 10 mm	NUNC	153066
BD Cytofix/Cytoperm	BD	554714
Anticuerpo CD11c de	ratón Biolegend		117305 Clon N418
Anti-ratón Anticuerpo CD45.2	Biolegend	109819	Clon 104
Anticuerpo CD4 antiratón	Biolegend	100413	Clon GK1.5
Anti-ratón Anticuerpo CD8a	Biolegend	100733	Clon 53-6.7
Anticuerpo CD3 antiratón	Biolegend	100214	Clon 17A2
Anti-ratón CD326 (Ep-CAM)	Anticuerpo Biolegend	118219	Clon G8.8
Anti-ratón CD207 (Langerin) Anticuerpo	Imgenex	DDX0362D	Clon 929F3.01
Anti-ratón I-Ad (MHC-II) Antobody	Biolegend	115010	Clon 39-10-8
LSR II Citómetro de flujo	BD Biosciences
FlowJo Software v 7.6.5	Tree Star

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