Artículo de método

Tipo 1 Diabetes inducción acelerada en ratones por transferencia adoptiva de células CD4 + células T diabetogénico

DOI:

10.3791/50389

⸱

6 de mayo de 2013

 , 
1Department of Microbiology & Immunology, Pennsylvania State University College of Medicine

En este artículo

Resumen

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Proporcionamos un método reproducible para inducir la diabetes tipo 1 (DM1) en ratones dentro de dos semanas por la transferencia adoptiva de células del islote T específicas de antígeno, células CD4 + primarias.

Resumen

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El ratón diabético no obeso (NOD) desarrolla espontáneamente diabetes autoinmune después de 12 semanas de edad y es el modelo animal más ampliamente estudiado de humano de tipo 1 diabetes (DM1). Estudios de la transferencia de células en ratones receptores irradiados han establecido que las células T son esenciales en la patogénesis de DT1 en este modelo. Se describe en este documento un método simple para inducen rápidamente DT1 por transferencia adoptiva de purificado, las células T de ratones NOD prediabéticos transgénicos para el receptor de células T islote-específico (TCR) BDC2.5 en ratones receptores NOD.SCID CD4 + primarias. Las principales ventajas de esta técnica son que el aislamiento y transferencia adoptiva de células T diabetogénicos se puede completar en el mismo día, no se requiere la irradiación de los destinatarios, y una alta incidencia de diabetes tipo 1 está provocada dentro de 2 semanas después de la transferencia de células T. Por lo tanto, los estudios de la patogénesis y las intervenciones terapéuticas en DT1 puedan tener lugar a un ritmo más rápido que con los métodos que se basan en poblaciones de células T heterogéneas o clonesderivados de ratones NOD diabéticos.

Introducción

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El ratón NOD desarrolla la diabetes autoinmune espontánea y ha sido ampliamente utilizado como un modelo animal para el 1,2 DT1 humana. Patogénesis de la diabetes tipo 1 en ratones NOD se caracteriza por la infiltración, a partir de las 3-4 semanas de edad, de los islotes de Langerhans del páncreas por las células dendríticas y los macrófagos, seguido por las células T y B. Esta fase de no destructiva peri-insulitis conduce a una destrucción lenta y progresiva de las células β pancreáticas productoras de insulina, lo que resulta en la diabetes manifiesta por 4-6 meses de edad de 3 años. La transferencia de esplenocitos CD4 + 4,5, 6,7 o 8,9 CD8 + células T de ratones NOD diabéticos han demostrado mediar en la diabetes en ratones NOD inmunocomprometidos, lo que indica que las células T de islotes reactivos juegan un papel central en la patogénesis de DT1. Dependiendo de las condiciones experimentales, la diabetes desarrollada en ratones receptores lentamente, durante varias semanas en estos estudios. Del mismo modo, varios clones de células T, que se deriven por mucho tiempo y es costosocultivo de las células T diabetogénicas, se han reportado para mediar la diabetes varias semanas después de la transferencia en ratones receptores 7,10. Con la disponibilidad de ratones transgénicos que expresan TCR derivados de varios laboratorios diabetogénicos clones CD8 restringidas de células T CD4-o posteriormente, han demostrado que las células T esplénicas de tales ratones fueron capaces de transferir la diabetes a receptores 11-13. Específicamente, BDC2.5 ratones NOD son transgénicas para la BDC2.5 TCR, que es específico para la cromogranina A, una proteína en las células beta pancreáticas 14-16. La transferencia de las células enteras o fraccionadas no se han activado bazo de abiertamente diabéticos o prediabéticos BDC2.5 ratones transferidos diabetes a ratones NOD neonatales o inmunodeficientes con eficiencias variables 11,17-19 vitro activada o.

Se describe un método simple que utiliza transgénicos CD4 + células T purificadas de pre-diabéticos BDC2.5 ratones para inducir T1D en ratones receptores a alto rendimiento y consistencia. Un gran número de células T ingenuas, islotes CD4 + específicas de antígeno están aislados de estos ratones por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para CD4 + CD62L + células T que expresan la cadena TCR transgénico de Vβ4. Células T transgénicas purificadas se transfieren a continuación sin activación en ratones NOD.SCID, que carecen de T funcionales y las células B y son-insulitis y la diabetes-libre 20. Los ratones receptores son monitoreados para concentraciones elevadas de glucosa en la orina que indican DT1, que se desarrolla rápidamente dentro de las dos semanas después de la transferencia de células T.

En contraste con otros métodos que transferir las células T diabetogénicas con especificidades heterogéneas, nuestro protocolo utiliza células T que expresan casi exclusivamente la diabetogénico BDC2.5 TCR FACS-ordenados CD4 +. Debido a su homogeneidad, sólo un pequeño número de células T transferidas (~ 1x10 6 células / ratón) se requieren para el desarrollo de DT1 rápida dentro de 2 semanas en el 100% de incidencia. Otra ventaja de nuestro protocolo es que irradiation de los ratones receptores no es necesario, ya que es para algunos otros métodos. Una limitación potencial de este método es que no permite la investigación de la contribución tanto de las células T CD8 en la diabetes CD4 y CD8 subconjuntos de células T o específicamente.

El protocolo descrito será útil para estudiar el desarrollo DT1 rápida, mediada por células T ingenuas, estrategias terapéuticas CD4 + monoespecíficos, así como para intervenir en homing de las células Th específicas de antígeno islotes en el órgano diana.

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Protocolo

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1. Aislamiento de células T del bazo y los ganglios linfáticos de los ratones BDC2.5

  1. Use 6 semanas de edad pre-diabéticos hembra BDC2.5 ratones como donantes de células T CD4 + diabetogénicos. Los ratones deben ser libres de diabetes tal como se determina por medición de glucosa en la orina (véase a continuación).
  2. La eutanasia a cada ratón mediante asfixia con CO2 y extraer los ganglios linfáticos del bazo, axilares y braquiales en condiciones estériles. Para quitar el bazo, empape la piel con etanol al 70%, luego se corta y retraer la piel. El bazo será visible como un órgano de color rojo oscuro en el lado izquierdo del ratón. Hacer una incisión de 1 pulgada en el peritoneo usando las tijeras pequeñas y pellizque suavemente el bazo en el centro con un par de pinzas pequeñas. Recorte con cuidado el tejido conjuntivo y la grasa adjunta tanto como sea posible y extirpar el bazo.
  3. Recoger los bazos y los ganglios linfáticos en 10 ml de Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) en un tubo cónico de 15 ml en hielo.
  4. Preparar una suspensión de células individuales mediante el uso de thfinal e de 10 ml émbolo de la jeringa estéril para presionar suavemente los órganos linfoides a través de 70 células coladeras micras (una bazo por colador y 4-6 ganglios linfáticos por filtro) en el mismo tubo cónico de 50 ml.

Durante el proceso, enjuague cada filtro con 1 ml de DMEM varias veces para maximizar la recuperación de células del colador.

  1. Transferir las células recogidas del tubo cónico de 50 ml en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 300-400 xg durante 7 minutos a temperatura ambiente.
  2. Para lisar las células rojas de la sangre, descartar el sobrenadante, resuspender las células en 5 ml de amonio-cloruro y potasio (ACK) tampón (pH 7,2), y se incuba la suspensión ACK de células a temperatura ambiente durante 5 min.
  3. Añadir 10 ml de DMEM a la suspensión ACK de células y centrifugar el tubo como anteriormente. Lavar el sedimento celular una vez en 10 ml de DMEM.

2. Clasificación de células activadas por fluorescencia de las células CD4 + T diabetogénico células de BDC2.5 Ratones

  1. Vuelva a suspender las células en 5 ml FACS sconteniendo tampón y contar el número de células viables (usando un microscopio de contraste de fase y un hemocitómetro) por exclusión del colorante azul de tripano.
  2. Uso de tampón FACS, ajustar el volumen de suspensión celular a 5 x 10 7 células / ml. Retire ~ 1 x 10 6 células por tinción de control (1, 3 sin mancha manchas individuales). Teñir la muestra de células T con anti-CD4 (APC), anti-TCR Vβ4 (FITC) y los anticuerpos anti-CD62L (PE) monoclonal (AM) en un tubo de 15 ml CD4 transgénicos no + activadas. Realizar tinción de las células utilizando las concentraciones de mAb sugeridas por el fabricante durante 20-30 min a 4 ° C en la oscuridad.
  3. Lavar la muestra y los controles de las manchas individuales con tampón FACS a> 3 veces el volumen de reacción de tinción. Centrifugar el tubo a 300-400 xg, separar el sobrenadante y resuspender las células en tampón FACS (1-2 x 10 7 células / ml para la clasificación de la muestra y de 300 l para los controles de manchas individuales) y almacenar en hielo hasta la próxima paso.
  4. Pasar la muestra de células a través de una celda de 35 micrastubo colador tapa para eliminar los agregados celulares. Ordena las muestras de CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + células en un clasificador de células con un operador entrenado. Recoger las células clasificadas en 3 ml de DMEM en un tubo de 15 ml. Permitir 2.5-3 horas, incluyendo la instalación, para ordenar 8 células 1,5 x 10 (el número aproximado de células obtenidas a partir de 3 ratones donantes) a una tasa de tipo de 2 x 10 4 Total de eventos / seg. Esperar ~ 2,5 x 10 6 células T por ratón después de la clasificación de células CD4 transgénicos no + activadas.
  5. Registre el número absoluto de células clasificadas en el extremo de la especie y centrifúguelas durante 7 minutos a 300-400 x g. Descartar el sobrenadante y volver a suspender las células (2 x 10 6 células / ml) en estéril buffer fosfato salino (PBS) (Mg 2 + / Ca 2 + libre) para la transferencia adoptiva de células T.

3. La transferencia adoptiva de células CD4 + T las células diabetogénico de BDC2.5 Ratones

  1. Con una jeringa de 1 ml y una aguja de calibre 18 a 1 ½, suavemente volver a suspender las células CD4 + purificados por FACSCélulas T y cargar la jeringa de 1 ml. En preparación para la inyección, reemplace la aguja de calibre 18 a 1 ½ con una aguja de calibre 27 ½.
  2. Exponga 6-8 semanas de edad ratones hembras receptoras NOD.SCID a una lámpara de calentamiento hasta que exhiben comportamiento de acicalamiento.
  3. Sujetar ratones receptores en una inmovilización y limpie la cola con 70% (v / v) de etanol para desinfectar el sitio de inyección.
  4. Inyectar 1-2 x 10 6 células / ratón FACS ordenados (en hasta 500 l de PBS) en cualquiera de las venas de la cola lateral.

No fuerce el émbolo. Si la aguja se encuentra adecuadamente en la vena, la inyección se llevará a cabo sin apenas resistencia.

4. Monitoreo ratones receptores de hiperglucemia y diabetes tipo 1

  1. A partir de cinco días después de la transferencia de células T, los ratones receptores NOD.SCID son monitoreados diariamente por elevación de glucosa en la orina usando tiras de reactivo (Bayer Diastix) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ratones con dos Urin consecutivolecturas de glucosa e> 250 mg / dl se consideraron diabéticos.

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Resultados

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Nuestros resultados muestran el aislamiento de células transgénicas que expresan CD62L BDC2.5, lo cual es crítico para las células T a casa a los órganos linfoides secundarios tales como los ganglios linfáticos pancreáticos. Nuestros resultados demuestran una vez más la potente capacidad de esta población de células T monoespecíficos para transferir rápida y eficazmente DT1 a ratones receptores NOD.SCID.

Aislamiento de células T procedentes de ratones BDC2.5 CD4 + diabetogénicos se muestra e...

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Discusión

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DT1 puede ser inducida en ratones receptores a diferentes eficiencias de la transferencia adoptiva de células de bazo completas o subconjuntos de células T de ratones NOD diabéticos o ratones transgénicos para TCR derivados de clones de células T diabetogénicos. Presentamos aquí un método reproducible para inducir la diabetes tipo 1 en ratones receptores dentro de dos semanas en el 100% de incidencia mediante la transferencia de FACS purificados por CD62L + BDC2.5 células T CD4 + en ratones transgénicos NOD.SCID.

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Divulgaciones

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Todos los animales fueron alojados en el Colegio de instalación libre de patógenos específicos Medicine (SPF) de conformidad con las directrices del Estado de Penn Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión Estatal de Pensilvania.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

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Agradecemos a los Dres. Robert Bonneau y Neil Christensen por sus valiosos comentarios.

Este trabajo fue apoyado por Pennsylvania State University College of Medicine fondos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ratones nod transgénicos BDC 2.5 TCR (NOD. Cg-Tg(Tcr&alfa; BDC 2.5, Tcrβ BDC 2.5)JAX004460
NOD. Los ratones SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J)JAX001303
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Themo ScientificSH30022.01
Bayer DiastixFisher ScientificAM2803
15 ml tubos cónicosFalcon352095
50 ml tubos cónicosFalcon352070
quirúrgicas estériles
Tijeras estériles de par pequeño
par grande
70 μ FisherScientific22363548
35 μ m tubos de tapón de filtro de célulasBD Biosciences352235
cloruro-potasio (ACK)0,15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2 en dH2
O BD FACSFlowTM fluido
FACSPBS, 0,2 mM EDTA, 0,5% BSA/FCS, esterilizado
por filtro Microscopio
Azul
Hemocitómetro
Anti-CD4 (APC) mAbBiolegend1005616clon RM4-5
Anti-TCR Vβ 4 (FITC) mAbBD Biosciences553365clon KT4
Anti-CD62L (PE) mAbBD Biosciences553151clon MEL-14
Clasificador de célulasBD Biosciencesp. ej. BD FACSAria III
Lámpara
Ratón
Anillos de retención de 1 mlBecton Dickinson309602
18-1½ agujas de calibre (estériles)Becton Dickinson305196
27½ agujas de calibre (estériles)Becton Dickinson305109
Pinzas Tijeras estériles detampón de de tinción BD Biosciences 342003 de contraste de fasede tripánde calor

Referencias

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