Tipo 1 Diabetes inducción acelerada en ratones por transferencia adoptiva de células CD4 + células T diabetogénico

Resumen

Proporcionamos un método reproducible para inducir la diabetes tipo 1 (DM1) en ratones dentro de dos semanas por la transferencia adoptiva de células del islote T específicas de antígeno, células CD4 + primarias.

Resumen

El ratón diabético no obeso (NOD) desarrolla espontáneamente diabetes autoinmune después de 12 semanas de edad y es el modelo animal más ampliamente estudiado de humano de tipo 1 diabetes (DM1). Estudios de la transferencia de células en ratones receptores irradiados han establecido que las células T son esenciales en la patogénesis de DT1 en este modelo. Se describe en este documento un método simple para inducen rápidamente DT1 por transferencia adoptiva de purificado, las células T de ratones NOD prediabéticos transgénicos para el receptor de células T islote-específico (TCR) BDC2.5 en ratones receptores NOD.SCID CD4 + primarias. Las principales ventajas de esta técnica son que el aislamiento y transferencia adoptiva de células T diabetogénicos se puede completar en el mismo día, no se requiere la irradiación de los destinatarios, y una alta incidencia de diabetes tipo 1 está provocada dentro de 2 semanas después de la transferencia de células T. Por lo tanto, los estudios de la patogénesis y las intervenciones terapéuticas en DT1 puedan tener lugar a un ritmo más rápido que con los métodos que se basan en poblaciones de células T heterogéneas o clonesderivados de ratones NOD diabéticos.

Introducción

El ratón NOD desarrolla la diabetes autoinmune espontánea y ha sido ampliamente utilizado como un modelo animal para el ^1,2 DT1 humana. Patogénesis de la diabetes tipo 1 en ratones NOD se caracteriza por la infiltración, a partir de las 3-4 semanas de edad, de los islotes de Langerhans del páncreas por las células dendríticas y los macrófagos, seguido por las células T y B. Esta fase de no destructiva peri-insulitis conduce a una destrucción lenta y progresiva de las células β pancreáticas productoras de insulina, lo que resulta en la diabetes manifiesta por 4-6 meses de edad de ³ años. La transferencia de esplenocitos CD4 + ^{4,5, 6,7} ....

Protocolo

1. Aislamiento de células T del bazo y los ganglios linfáticos de los ratones BDC2.5

1. Use 6 semanas de edad pre-diabéticos hembra BDC2.5 ratones como donantes de células T CD4 + diabetogénicos. Los ratones deben ser libres de diabetes tal como se determina por medición de glucosa en la orina (véase a continuación).
2. La eutanasia a cada ratón mediante asfixia con _CO2 y extraer los ganglios linfáticos del bazo, axilares y braquiales en condiciones estériles. Para quitar el bazo, empape la piel con etanol al 70%, luego se corta y retraer la piel. El bazo será visible como un órgano de color rojo oscuro en el lado izquierdo del ratón. Hacer ....

Resultados

Nuestros resultados muestran el aislamiento de células transgénicas que expresan CD62L BDC2.5, lo cual es crítico para las células T a casa a los órganos linfoides secundarios tales como los ganglios linfáticos pancreáticos. Nuestros resultados demuestran una vez más la potente capacidad de esta población de células T monoespecíficos para transferir rápida y eficazmente DT1 a ratones receptores NOD.SCID.

Aislamiento de células T procedentes de ratones BDC2.5 CD4 + diabetogénicos se muestra e.......

Discusión

DT1 puede ser inducida en ratones receptores a diferentes eficiencias de la transferencia adoptiva de células de bazo completas o subconjuntos de células T de ratones NOD diabéticos o ratones transgénicos para TCR derivados de clones de células T diabetogénicos. Presentamos aquí un método reproducible para inducir la diabetes tipo 1 en ratones receptores dentro de dos semanas en el 100% de incidencia mediante la transferencia de FACS purificados por CD62L + BDC2.5 células T CD4 + en ratones transgénicos NOD.SCID.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratones nod transgénicos BDC 2.5 TCR (NOD. Cg-Tg(Tcr&alfa; BDC 2.5, Tcrβ BDC 2.5)	JAX	004460
NOD. Los ratones SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J)	JAX	001303
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Themo Scientific	SH30022.01
Bayer Diastix	Fisher Scientific	AM2803
15 ml tubos cónicos	Falcon	352095
50 ml tubos cónicos	Falcon	352070
			quirúrgicas estériles
Tijeras estériles de par pequeño
			par grande
70 μ Fisher	Scientific	22363548
35 μ m tubos de tapón de filtro de células	BD Biosciences	352235
		cloruro-potasio (ACK)	0,15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2 en dH2
O BD FACSFlowTM fluido
FACS			PBS, 0,2 mM EDTA, 0,5% BSA/FCS, esterilizado
por filtro Microscopio
Azul
Hemocitómetro
Anti-CD4 (APC) mAb	Biolegend	1005616	clon RM4-5
Anti-TCR Vβ 4 (FITC) mAb	BD Biosciences	553365	clon KT4
Anti-CD62L (PE) mAb	BD Biosciences	553151	clon MEL-14
Clasificador de células	BD Biosciences		p. ej. BD FACSAria III
Lámpara
Ratón
Anillos de retención de 1 ml	Becton Dickinson	309602
18-1½ agujas de calibre (estériles)	Becton Dickinson	305196
27½ agujas de calibre (estériles)	Becton Dickinson	305109

Pinzas Tijeras estériles detampón de de tinción BD Biosciences 342003 de contraste de fasede tripánde calor