Determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas Ensayos

Resumen

Procedimientos basado en una microplaca se describen para el análisis colorimétrico o fluorométrico de la actividad enzimática extracelular. Estos procedimientos permiten el rápido ensayo de tal actividad en un gran número de muestras del medio ambiente dentro de un marco de tiempo manejable.

Resumen

Gran parte de la ciclo de los nutrientes y el procesamiento de carbono en ambientes naturales se produce a través de la actividad de las enzimas extracelulares liberados por microorganismos. Por lo tanto, la medición de la actividad de estas enzimas extracelulares puede dar una visión de los tipos de procesos a nivel de ecosistema, como la descomposición de la materia orgánica o mineralización del nitrógeno y el fósforo. Los ensayos de actividad de la enzima extracelular en muestras ambientales normalmente implican la exposición de las muestras a sustratos colorimétricos o fluorométricos artificiales y el seguimiento de la tasa de hidrólisis del sustrato. Aquí se describen los métodos de microplacas basado para estos procedimientos que permiten el análisis de un gran número de muestras dentro de un corto período de tiempo. Las muestras se dejan reaccionar con sustratos artificiales dentro de microplacas de 96 pocillos o de pozo profundo bloques de la microplaca, y la actividad enzimática se determina posteriormente por absorción o fluorescencia del producto final resultante usando un Reade típica de microplacasr o fluorómetro. Tales procedimientos de alto rendimiento no sólo facilitan las comparaciones entre sitios espacialmente separados o ecosistemas, sino que también reducen sustancialmente el coste de dichos ensayos, reduciendo los volúmenes totales de reactivos necesarios por muestra.

Introducción

Los microorganismos tales como bacterias y hongos obtienen los nutrientes y de carbono a partir de compuestos orgánicos complejos a través de la producción de enzimas extracelulares. Estas enzimas hidrolizan típicamente polímeros en subunidades más pequeñas que se pueden tomar en la célula. Por lo tanto, a nivel ecológico, estas enzimas extracelulares microbianos son responsables de gran parte de la mineralización de nutrientes y la descomposición de la materia orgánica que se produce en entornos naturales. Las enzimas tales como celobiohidrolasa (CBH) y β-glucosidasa son importantes para la degradación de la celulosa y el trabajo al unísono para catalizar la hidróli....

Protocolo

Análisis colorimétrica de la actividad enzimática extracelular en suelos y sedimentos

1. Preparación del substrato y Soluciones tampón para análisis colorimétricos de actividad enzimática

1. H Preparar 50 mM de tampón de acetato (pH 5.0-5.5) mediante la mezcla de 50 ml de 0.1 M de ácido acético (2,87 ml de ácido acético glacial en 500 ml de agua), 150 ml de acetato de sodio 0,1 M, y 200 ml de agua destilada ₂ O. Ajustar el pH a 5,0-5,5 con ácido acético 0,1 M si es necesario.
2. Preparar una solución de 1 M de hidróxido de sodio (NaOH) en _H2O destilada
3. Preparar soluciones de sustrato NP-linked <....

Resultados

Los suelos y sedimentos acuáticos suelen tener niveles apreciables de actividad enzimática extracelular como resultado de las comunidades microbianas adjuntos (biofilms) que crecen en la superficie de las partículas. Figura 3 muestra cómo esta actividad cambia en función del tamaño de las partículas obtenidas del sedimento superficial de un tercer corriente de orden en el norte de Mississippi, EE.UU.. Un estudio previo ha demostrado que las comunidades bacterianas en las partículas de sedimento de esta .......

Discusión

La determinación de la actividad de una variedad de enzimas extracelulares microbianas en suelos y sedimentos puede proporcionar información útil sobre las tasas de mineralización de nutrientes y de procesamiento de materia orgánica ^17. Sin embargo, los suelos pueden varían en sus niveles de humedad, por lo que es importante normalizar la actividad de peso en seco del suelo. Esto requiere una etapa de secado adicional (normalmente dos días) más allá de la simple medición de la actividad enzimática. Por lo tan.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
REACTIVOS Y MATERIALES
Ácido			Varios proveedores
Acetato			Varios proveedores
Hidróxido de			Varios proveedores
p-Nitrofenol	Fisher	BP612-1	Alternativas disponibles
p-Nitrofenilo (pNP)-fosfato	Sigma	N3234	pNP-substrate
pNP-β-glucopiranósido	Sigma	N7006	pNP-sustrato
pNP-β-N-acetilglucosaminida	Sigma	N9376	p Sustrato NP
Microplacas transparentes de 96 pocillos	Fisher	12-563-301	Alternativas disponibles
Bloques de pocillos profundos de 96 pocillos	Costar	3958	Alternativas disponibles
Bandejas de pesaje de			Varios proveedores
Tubos de centrífuga estériles de			Varios proveedores
Tubos de centrífuga estériles de			50 mlVarios proveedores
4-Metilumbeliferona	Sigma	M1381
4-Metilumbeliferol (MUB)-fosfato	Sigma	M8883	MUB-sustrato
4-MUB-glucopiranósido	Sigma	M3633	MUB-sustrato
4-MUB-N-acetilglucosaminida	Sigma	M2133	MUB-sustrato
Bicarbonato			Varios proveedores
Microplaca negra de 96 pocillos	Costar	3792
Depósito			Varios proveedores
EQUIPMENT
Centrífuga	Eppendorf	5810R
Rotor centrífugo	Eppendorf	A-4-81	Para microplacas/bloques de pocillos profundos
Lector de microplacas	BioTek	Synergy HT	Alternativas disponibles
Fluorómetro de microplacas	BioTek	FLx 800	Alternativas disponibles
Pipeta			Varios proveedores

acético glacial de sodio sodio aluminio 15 ml de sodio de pipeta de 8 canales