Los neutrófilos son las más abundantes en leucocitos de sangre. Los neutrófilos poseen funciones regulados transcripcionalmente tales como la producción de citocinas proinflamatorias y la inhibición de la apoptosis. Estas funciones pueden ser estudiadas con el método presentado aquí, que permite la detección y cuantificación de los factores nucleares por citometría de flujo en los núcleos aislados
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Artículo de método
Un método simple y eficiente para detectar la activación del factor nuclear en neutrófilos humanos por citometría de flujo
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Resumen
Resumen
Los neutrófilos son las más abundantes en leucocitos de sangre periférica. Estas células son el primero en aparecer en sitios de inflamación e infección, convirtiéndose así en la primera línea de defensa contra los microorganismos invasores. Los neutrófilos poseen importantes funciones antimicrobianos, tales como fagocitosis, la liberación de enzimas líticas, y la producción de especies reactivas del oxígeno. Además de estas importantes funciones de defensa, neutrófilos realizar otras tareas en respuesta a la infección, tales como la producción de citocinas proinflamatorias y la inhibición de la apoptosis. Las citoquinas reclutar leucocitos otros que ayudan a eliminar la infección, y la inhibición de la apoptosis permite el neutrófilo a vivir más tiempo en el sitio de la infección. Estas funciones se regulan a nivel de la transcripción. Sin embargo, debido a los neutrófilos son las células de vida corta, el estudio de respuestas regulados transcripcionalmente en estas células no se puede realizar con los métodos convencionales de genes informadores ya que no hay eficienciatécnicas eficientes para la transfección de neutrófilos. Aquí, se presenta un método simple y eficiente que permite la detección y cuantificación de los factores nucleares en núcleos aislados y immunolabeled por citometría de flujo. Se describen técnicas para aislar los neutrófilos puros a partir de sangre periférica humana, estimular estas células con anticuerpos anti-receptor, aislar y núcleos inmunomarcador, y analizar núcleos por citometría de flujo. El método ha sido utilizado con éxito para detectar NF-kB y Elk-1 factores nucleares en los núcleos de los neutrófilos y otros tipos celulares. Por lo tanto, este método representa una opción para el análisis de la activación de factores de transcripción en los núcleos aislados a partir de una variedad de tipos de células.
Introducción
Los neutrófilos son las más abundantes en leucocitos de sangre periférica 1. Durante los neutrófilos inflamación y la infección son las primeras células que aparecen en el sitio afectado cuando actúan como la primera línea de defensa 2. Los neutrófilos poseen varios mecanismos antimicrobianos 3 incluyendo la fagocitosis, la producción de especies reactivas de oxígeno, liberación de enzimas líticas por la desgranulación y la producción de citocinas proinflamatorias 4,5. Los neutrófilos son las células de vida corta que se activa rápidamente a través de la señalización de los distintos receptores de la superficie celular. Aun....
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Protocolo
1. Aislamiento de neutrófilos (PMN) de la sangre humana
- Use aproximadamente 20 ml de sangre humana con heparina (10 U / ml) como anticoagulante. Se recogió sangre de voluntarios adultos sanos por venopunción. Todos los experimentos se realizaron bajo la aprobación del Comité de Bioética de la Instituto de Investigaciones Biomédicas - UNAM.
- Dejar 2 ml de dextrano al 6% T500 en PBS en un tubo de 15 ml de centrífuga cónico y añadir 10 ml de sangre. Mezclar invirtiendo el tubo dos o tres veces y se deja reposar durante 45 minutos para permitir la sedimentación de eritrocitos.
- En un nuevo máximo de 15 ml tubo de centrífuga cónico poner 5 ml ....
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Resultados
El método de purificación descrito aquí proporciona generalmente los neutrófilos no estimulados (PMN) con una pureza mayor que 95% (Figura 1A). Aislado PMN entonces puede ser estimulado por los receptores de reticulación particular con anticuerpos monoclonales específicos. Hemos PMN estimulados a través de los receptores Fc y las integrinas (Figura 1B). Una vez estimulado, PMN son lisadas y los núcleos se aislaron con rendimientos altos. Los núcleos son entonces immunolabeled para un de.......
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Discusión
El método de purificación descrito aquí permite el aislamiento de neutrófilos no estimulados (PMN) con una pureza mayor que 95% (evaluado por observación microscópica), en un corto tiempo. A veces, los neutrófilos pueden estar contaminados por los eritrocitos, si éste no se lisan completamente. Esto no suele afectar a la técnica, ya que los eritrocitos y los PMN se pueden distinguir fácilmente como poblaciones celulares distintas por citometría de flujo. Aislado PMN entonces puede ser estimulado por los receptores de re.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Nancy Mora por su asistencia técnica.
Este trabajo fue financiado por becas de investigación 48573-M y 168098 de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México, y por subvenciones IN212308 y IN205311-2 de Dirección General de Asuntos del Personal Académico de la Universidad Nacional Autónoma de México, México.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| REACTIVOS | |||
| Heparina | PiSA (México) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Dinamarca) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Cloruro de sodio | Sigma | S7653 | |
| Fosfato de sodio monobásico | Sigma | S9638 | |
| Fosfato de sodio dibásico | Sigma | S9390 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fracción V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Cloruro de potasio | Sigma | P9541 | |
| Cloruro de magnesio anhidro | Sigma | M8266 | |
| DL- ditiotreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Azul de tripán (solución al 0,4 %) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehído | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Anticuerpo monoclonal IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Anticuerpo monoclonal anti-FcRII (CD32) |
| 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Anticuerpo anti-FcRIII (CD16) específico para humanos |
| TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donado por el Dr. Martin Hemler | Anti-β específico para humanos; 1 integrina (CD29) |
| Anticuerpo monoclonal IB4 | Universidad de California, San Francisco | Donado por el Dr. Eric J. Brown | Anti-β específico para humanos; 2 integrina (CD18) |
| F(ab')2 cabra anti-ratón IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| F(ab')2 cabra conjugada con FITC-2 IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| F(ab')2 cabra conjugada con FITC anti-conejo IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κ B p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Anticuerpo policlonal de conejo |
| Anti-NF-κ B p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Anticuerpo |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml tubo de centrífuga | Corning | 430791 | |
| de 50 ml | Centrífuga Corning | 430291 | |
| , Sorvall Medidor | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| Corning | 340 | ||
| Pipeta Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipeta Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipeta Pipetman P-1000 | Gilson | ||
| Hemocitómetro | Microscopio Fisher Scientific 0267110 | ||
| Nikon Nikon | Eclipse E600 | ||
| Microscopio invertido | Nikon | TMS | |
| agua | Microcentrífuga Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5414C | |
| Citómetro de flujo Eppendorf | 5418 | ||
| Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur | ||
Referencias
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010). ....
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Reimpresiones y permisos
