Artículo de método

El análisis inmunohistoquímico en el sistema nervioso central y periférico de la rata de nodo linfático secciones de tejido

DOI:

10.3791/50425

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14 de noviembre de 2016

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1Department of Clinical Neuroscience, Neuroimmunology Unit, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 2Department of Neuroimmunology, Center for Brain Research, Medical University of Vienna, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Vascular Biology Unit, Karolinska Institutet

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí presentamos un protocolo optimizado y detallado para la inmunotinción doble en secciones de tejido del sistema nervioso central (SNC) y de los ganglios linfáticos periféricos (LN) de rata fijadas en formol, incluidas en parafina.

Resumen

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La inmunohistoquímica (IHC) proporciona una visualización altamente específico, fiable y atractivo proteína. rendimiento correcta y la interpretación de un etiquetado multicolor basado en la IHC es un reto, especialmente cuando se utiliza para la evaluación de las interrelaciones entre las proteínas diana en el tejido con un alto contenido de grasa, tales como el sistema nervioso central (SNC).

Nuestro protocolo representa un refinamiento de la técnica immunolabeling estándar especialmente ajustado para la detección de ambas proteínas estructurales y solubles en el CNS de rata y de los ganglios linfáticos periféricos (LN) afectadas por la neuroinflamación. No obstante, con o sin modificaciones adicionales, nuestro protocolo probablemente podría ser utilizado para la detección de proteínas relacionadas con otros objetivos, incluso en otros órganos y especies que aquí se presenta.

Introducción

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A pesar de la utilización de tecnologías avanzadas de alto rendimiento de los análisis realizados en el metiloma, transcriptoma o incluso de proteoma, inmunotinción sigue siendo el estándar de oro para la detección de proteínas directamente en la muestra de tejido, cultivo celular o un frotis celular. Al revelar el patrón de localización / distribución, inmunohistoquímica (IHC) puede evaluar proporciones relativas y las interrelaciones topográficas de las proteínas diana, e incluso indicar sus actividades biológicas. Por lo tanto, IHC se utiliza ampliamente para fines clínicos y de investigación, por ejemplo, para el diagnóstico, tratamiento, evaluaciones estudio de los mecanismos de la enfermedad, alteraciones funcionales y fenotípicas en modelos animales, etc.

Que comprende esencialmente la histología, patología, bioquímica e inmunología, IHC ha avanzado significativamente desde 1941, cuando se utilizaron anticuerpos marcados con fluorescencia por primera vez para identificar antígenos de neumococo en el tejido infectado 1. Visualization de productos y componentes por IHC celulares se basa en la unión de anticuerpos (Abs) a su antígeno específico (Ag). Además de utilizar anticuerpos fluoróforo etiquetado, reacciones inmunes también se pueden visualizar mediante el uso de enzimas como la peroxidasa de 2,3 o fosfatasa alcalina 4. Además, los anticuerpos de oro coloidal-etiquetado 5 se utilizan para detectar la interacción específica antígeno-anticuerpo tanto por microscopía óptica y electrónica, mientras marcadores radiactivos se visualizaron por autorradiografía.

La inmunorreacción Ag-Ab se puede detectar a través de métodos directos e indirectos. El método directo es esencialmente más rápido y más sencillo, ya que utiliza directamente etiquetada Abs primaria 6. Sin embargo, debido a la significativa falta de sensibilidad, los métodos indirectos se prefieren a los directos. Procedimientos de detección indirecta de dos pasos requieren no marcados Abs primaria, ya que el primero, y se marcaron Abs secundarios dirigidos contra el Abs primario, como la segunda capa 7.la amplificación de la señal se puede lograr mediante la participación adicional, terciaria Ab enzima acoplada (de tres pasos método indirecto) que se une al Ab secundario. métodos de detección indirectos utilizados están avidina-biotina y peroxidasa-antiperoxidasa (PAP). Alternativamente, fosfatasa alcalina fosfatasa antialkaline (APAAP) complejo se puede utilizar en lugar del método PAP. En particular, la fosfatasa alcalina (AP) métodos parecen ser aún más sensible que los métodos de inmunoperoxidasa 4. método del complejo avidina-biotina (ABC) utiliza biotina Ab secundario en combinación con la etiqueta complejo avidina-biotina (LAB), o el etiquetado de estreptavidina-biotina (LOSA). Sensibilidad de detección se puede aumentar más mediante la participación de avidina marcada con peroxidasa o fosfatasa alcalina 8. Otros métodos de detección utilizados son el etiquetado polimérico, tiramina y la amplificación círculo 9 inmuno-balanceo. En particular, los métodos de detección diferentes se pueden combinar para la detección múltiple Ag en el mismo tejidomuestra, el cual fue reportado por primera vez en 1978 4. inmunotinción doble simultánea que aquí se presenta se realizó en fijado en formol, ratas incluido en parafina cortes de tejido del SNC y LN utilizando peroxidasa unida y AP-conjugado con anticuerpos secundarios, respectivamente. Las señales se visualizaron utilizando 3,3'-diaminobencidina cromógeno (DAB) y el Fast Blue (FB) APAAP compleja, respectivamente.

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Protocolo

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Declaración de ética
El presente estudio se realizó de acuerdo con las directrices de la Junta Nacional Sueca de Animales de Laboratorio y la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea (86/609 / CEE), por los permisos éticos N338 / 09, N15 / 10 y N65 / 10, los cuales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal Estocolmo Norte.

1. Preparación del tejido

  1. Perfusión y de fijación
    1. Anestesiar al animal con isoflurano para realizar la perfusión transcardial a través del ventrículo izquierdo. Iniciar el enjuague de la vasculatura con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar los componentes de la sangre, seguido de paraformaldehído al 4% en PBS 0,1 M (PFA).
    2. Fijar los cerebros disecados, la médula espinal y el tejido LN periférica mediante la inmersión en PFA. Después de 24 horas a 4 ° C, transferir el tejido de PFA en PBS y se almacena a 4 ° C hasta su posterior procesamiento. Como alternativa a PBS comercial, se disuelven 9 g de NaCl en 250 ml del S &# 246; rensen tampón y añadir 750 ml de agua desionizada (DH 2 O); para preparar tampón 0,2 M Sörensen (pH 7,4) disolver 13,8 g NaH 2 PO 4 x 1H 2 O y 71,2 g de Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O en 2,5 L dH 2 O.
  2. La deshidratación y la incrustación
    1. Cortar el tejido en aproximadamente 5 mm partes gruesas mediante el uso de una hoja de afeitar.
    2. Iniciar el proceso de endurecimiento del tejido (deshidratación) mediante el uso del procesador de infiltración a vacío Tissue-Tek VIP (procedimiento estándar basado en la inmersión en concentraciones ascendentes de etanol, seguido de xileno y finalmente parafina (Tabla 1).
    3. Coloque el tejido en un molde y se vierte en la parafina líquida alrededor de la muestra para formar un "bloque de parafina". El almacenamiento a largo plazo requiere la temperatura ambiente (TA). Sin embargo, antes de seccionar, es recomendable para enfriar los bloques, por ejemplo, durante la noche (o / n) a 4 ° C.

2. Seccionamiento

  1. Coloque el bloque de parafina en un soporte fijo de la microtomo trineo, que puede moverse hacia atrás y hacia delante a través de la cuchilla. Ajuste el ángulo óptimo entre el bloque y el cuchillo microtomo (que depende de la geometría de cuchillo, sino también de la velocidad de corte y la técnica).
  2. Cortar 3 - 5 de m de espesor secciones transversales del bloque de parafina.
  3. Transferir la sección acaba de cortar en un recipiente de agua y montarlo posteriormente del agua sobre el portaobjetos de vidrio.
  4. Presione la sección montada cuidadosamente con una toalla de papel para eliminar el agua residual y las burbujas de aire potenciales. Comercialmente pre-revestidas portaobjetos de vidrio adhesivas son recomendables.
  5. Diapositivas montadas en seco por un par de horas en una estufa a 50 - 60 ° C.

3. desparafinación (Rehidratación y bloqueo de la peroxidasa endógena)

  1. Sumergir los portaobjetos en xileno 2x (sustituto de xileno, alternativamente,XEM-200), cada vez 15 a 20 '.
  2. Enjuague con etanol al 99%.
  3. Para bloquear la actividad peroxidasa endógena, se incuban las secciones para 30 'en solución de metanol que contiene 0,25% de peróxido de hidrógeno.
  4. Continuar la rehidratación mediante el uso de etanol con el aumento de contenido de agua (99%, 70%, terminando en agua destilada.
  5. Desde este punto hasta el montaje de la cubierta se desliza secciones tienen que mantenerse húmedo.

4. La recuperación del antígeno

  1. Utilice una vaporera para hervir los portaobjetos en una solución de recuperación de antígeno (en este caso EDTA pH 8,5 tampón) durante 60 '(EDTA reserva de estabilización solución contiene 1,21 g de Tris y 0,37 g de EDTA se disuelve en 50 ml de H2O destilada, para preparar el trabajo solución diluida solución de 2,5 ml de EDTA de valores en 47,5 ml dH2O).
  2. Enfriar los portaobjetos en la temperatura ambiente durante aprox. 1 hr y luego enjuague 3 - 5x con solución salina tamponada con Tris (TBS, usar alternativamente PBS) que consiste en 0,05 M Tris y 0,15 M NaCl; pH 7,5 ajustado wiTH HCl. Alternativamente, puede utilizar TBS comercial.

5. El bloqueo de los sitios de unión inespecífica

  1. Para evitar reacciones de fondo no específicas, se incuban las secciones sobre TA durante 30 'en la solución de bloqueo que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS) y tampón DAKO 90%.

6. Doble Immunolabeling: La incubación simultánea con los Abs primarias

  1. Diluir cantidad necesaria de anticuerpos primarios en la solución de bloqueo y se incuba o / n a 4 ° C. Para la inmunotinción doble combinar α-eotaxina (CCL11; 1: 300) con α-CD68 (Ed1; 1: 1.000) o α-Iba1 (AIF1, 1: 1.000) o α-CD8a (Ox-8; 1: 200) .
  2. Enjuague los portaobjetos 3-5X con tampón TBS (alternativamente usar tampón 10x diluida DAKO).
  3. Diluir cantidad necesaria de anticuerpos secundarios (biotinilado anti-cabra y AP-conjugado anti-ratón, ambos 1: 200) en la solución de bloqueo y se incuba 1 h en RT.
  4. Enjuague las diapositivas 3 - 5 veces con tampón TBS (use alternativamente 10x diluido tampón DAKO).
  5. Incubar los portaobjetos con complejo de avidina-peroxidasa de rábano (HRP) diluidos en la solución de bloqueo durante 1 h en RT.
  6. Enjuagar las diapositivas 3 - 5 veces con tampón TBS (utilizar alternativamente 10x tampón DAKO diluida).

7. Visualización

  1. La visualización del anticuerpo secundario marcado con AP enlazado
    1. Preparar tampón Tris-HCl 0,1 disolviendo 12,1 g de Tris en 1 L dH 2 O y ajustar el pH a mediante el uso de HCl. Usar el mismo tampón Tris-HCl para preparar una solución 1 M levamisol. Preparar solución recién 4% NaNO2 en dH2O
    2. Para obtener 50 ml del sustrato Fast Blue (FB) (volumen requerido para una cubeta de vidrio estándar) disolver 6,25 mg Naftol-AS-MX-fosfato en 312,5 DMF l en el tubo de vidrio y se agita en 50 ml de pre-calentado (37 ° C) de tampón Tris-HCl. Para disolver 12,5 mg FB RR sal en l HCl 2 N 312,5 312,5 l de añadir previamente preparojo 4% de solución de NaNO 2 y se agita la mezcla en los mismos 50 ml de tampón Tris-HCl pre-calentado. Agitar suavemente hasta que el líquido amarillo se vuelve claro y por último añadir 77 l de solución 1 M levamisol previamente preparada. Filtrado obtenido mezcla y se vierte sobre portaobjetos colocados en la cubeta de vidrio.
    3. Iniciar la incubación a 37 ° C y el control de procesos en desarrollo bajo el microscopio de luz aprox. cada 15 - 30 min. Si al girar difusa, reemplace la solución FB con la mezcla fresca.
    4. Enjuague las diapositivas 3 - 5 veces con tampón TBS y la transferencia a continuación en tampón PBS.
  2. La visualización del anticuerpo secundario biotinilado unido
    1. Preparar DAB / H 2 O 2 solución de revelado diluyendo 1 ml de solución de DAB (DAB 25 mg por 1 ml de PBS) en 49 ml de PBS. Añadir 16,5 l de H 2 O 2 y filtrado antes de verter en secciones.
    2. La conversión del cromógeno DAB en la frente precipitandon pigmento puede ser inmediata. Controlar el proceso de desarrollo bajo el microscopio de luz (incluso par de segundos de incubación más largo puede plantear un alto fondo y enmascarar la señal específica).
    3. La intensidad del precipitado pigmento marrón puede ser, alternativamente, reforzada por la incubación en la solución que consiste en 2% de sulfato de cobre y 0,9% de NaCl para 5 '.
    4. Enjuague las diapositivas 3 - 5 veces con PBS y finalmente con H2O destilada Alternativamente, puede utilizar el agua del grifo.
    5. Montar los portaobjetos con tapa se desliza directamente del agua mediante el uso de un medio de montaje acuoso GelTol. Evitar la creación de burbujas de aire.
    6. Deje secar por completo del medio de montaje, por ejemplo, O / N a 4 ° C. Tienda secó diapositivas en RT.
1. % etanol 20 ' 40 ° C
2. % etanol 60 y# 39; 40 ° C
3. % etanol 90 ' 40 ° C
4. % etanol 60 ' 40 ° C
5. % etanol 90 ' 40 ° C
6. % etanol 60 ' 40 ° C
7. % etanol 90 ' 40 ° C
8. % etanol 120 ' 40 ° C
9. xilol 30 ' 40 ° C
10. xilol 60 ' 40 ° C
11. Parafina 60 ' 60 ° C
12. Parafina 60 ' 60 ° C
13. Parafina 60 ' 60 ° C
14. Parafina 120 ' 60 ° C

Tabla 1. Procesamiento de tejido por vacío Tissue-Tek VIP procesador de infiltración.

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Resultados

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immunostainings dobles (co-tinciones) se realizaron en fijado en formol e incluido en parafina de rata secciones del SNC y LN. 3-5 micras rodajas de tejido espesor fueron cortadas usando un microtomo trineo, montados posteriormente en portaobjetos de vidrio recubierto con adhesivo previamente y se trata como se ha descrito previamente 10,11,12. En resumen, después deparaffinizing, la rehidratación del tejido y la inactivación de la peroxidasa endógena, las secciones se sometie...

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Discusión

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Los procedimientos estándar de IHC menudo requieren ajustes específicos para obtener un resultado óptimo, lo que comúnmente implica una amplia experiencia, sino también de "ensayo y error" enfoque. Desde la preparación hasta la visualización del tejido diana, casi cada paso en el protocolo puede ser sometida a modificaciones diseñadas de forma individual con el fin de mejorar el resultado final. protocolo de tinción doble que aquí se presenta un ejemplo de proteínas a base de IHC focalización particular ajusta...

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

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Agradecemos a Hans Lassmann y Jan Bauer por su orientación y apoyo. También agradecemos a Katalin Benedek por su excelente asistencia técnica y a Caroline Westerlund por su evaluación crítica y lingüística.

Este estudio fue financiado por subvenciones de Biogen Idec, la Fundación Wenner-Gren, el Consejo Sueco de Investigación, la Asociación Sueca de Personas con Discapacidades Neurológicas, la Fundación Sueca del Cerebro, el 6º Marco de la UE EURATools (LSHG-CT-2005-019015) y Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
fuerte
Isoflurano (Isofluran): 1-Cloro-2,2,2-trifluoretilo (éter difluormetílico) 2-Cloro-2-(difluormetoxi)-1,1,1-trifluoretano (C3H2ClF5O)Baxter1001936060Irradiación ocular. Probablemente influye en la fertilidad y daña al bebé en el útero. Administrar solo en un ambiente anestésico adecuadamente equipado.
Cloruro de sodio (NaCl)Merck1.0604
Tampón de fosfato salino (PBS), tabletaSigma-AldrichP4417
Paraformaldehído (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% en 1x PBSApl pharma34 24 28salud. Corrosivo. Inflamable. Toxicidad aguda.
Etanol ≥ 99.5%, absoluto (CH3CH2OH)Sigma-Aldrich459844-1LInflamable.
Xileno (Xilenos, grado histológico; C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich534056 Inflamable. Toxicidad aguda.
Histo-Comp Cera de parafinaTissue-TekV0-5-1001
Portaobjetos de microscopio adhesivoStarfrostMIC-1040-W
Sustituto de xilol XEM-200 Vogel GmbHND-HS-200Sensibilización respiratoria. Carcinogenicidad.
α-CD8 (Ox-8) ratón anti-rata, anticuerpo primarioAbD SerotecMCA48G
α-Iba1 (AIF1) ratón anti-rata, anticuerpo primarioMilliporeMABN92
α-CD68 (ED1) ratón anti-rata, anticuerpo primarioAbD SerotecMCA341R
α-eotaxina C-19 (CCL11) cabra anti-rata, anticuerpo primarioSanta Cruz BTSC-6181
Anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (AP)Dakopatts, DinamarcaD0314
Anticuerpo secundario biotiniladoAmersham BiotechRPN1025
Avidina-complejo peroxidasa de rábano picante (HRP) Sigma-AldrichA3151
Naftol AS-MX fosfato (C19H18NO5P)Sigma-AldrichN4875-1GToxicidad aguda.
Sal RR Azul Rápida, Diazo Azoico Nº 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2)Sigma-AldrichFBS25
Clorhidrato de levamisol (C11H13ClN2S)Sigma-Aldrich31742Toxicidad aguda.
3,3'-Diaminobencidina tetraclorhidrato (Cromo DAB)DAKOS3000Altamente inflamable. Nocivo.
Sulfato de cobre (CuSO4)Merck1.02791Toxicidad aguda. Peligrosidad ambiental.
GelTol Medio de montaje acuosoThermo Electron Corporation230100
Peróxido de hidrógeno, 30% (H2O2)Merck107210Toxicidad aguda.
Metanol (CH3OH)Fluka65543Toxicidad aguda. Sensibilización respiratoria. Carcinogenicidad. Inflamable.
Tris (hidroximetil) aminometano, TRIS base (C4H11NO3 )AppliChemA1379Irritación de la piel y los ojos.
Solución salina tamponada Tris (TBS), tabletaSigma-AldrichT5030
Di- Hidrogenofosfato de sodio dihidratado (Na2HPO4 x 2H2O)Merck1.0658
Dihidrógeno fosfato de sodio monohidratado (NaH2PO4 x 1H2O) Merck1.06346
Suero fetal de ternera (FCS) Cambrex BioScienceDE-14-802F
Tampón de lavado por citomación DAKO 10x DAKOS3006Debe almacenarse a 2-8 & deg; C para inhibir el crecimiento bacteriano. Evite la formación de espuma.
N,N-Dimetilformamida; DMF (C3H7NO)Fluka40250Inflamable. Toxicidad aguda.
Cubreobjetos de vidrio 24 x 36 mm Menzel-Glä serBB024036A1
Ácido clorhídrico, conc. (HCl)Sigma-Aldrich30721Corrosivo, irritante, permeante. Sensibilizador pulmonar (en forma de neblina ácida). Nocivo.
Solución volumétrica de ácido clorhídrico, 2 M HCl (2 N)Fluka71826Corrosivo, irritante, permeante. Sensibilizador pulmonar (en forma de neblina ácida). Nocivo.
Nitrito de sodio, ReagentPlus, ≥ 99.0% (NaNO2)Sigma-AldrichS2252Oxidante. Nocivo. Peligroso para el medio ambiente.
Sal disódica dihidratada de ácido etileninittrilotetraacético (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O)Merck1.08454Las exposiciones orales pueden causar efectos reproductivos y de desarrollo.
Equipo
Tissue-TekV.I.P Procesador de infiltración al vacíoSakura5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 Series Microtomo de trineo base Instrumentos Hacker Vaporizador
alimentos para el hogar BraunMultiGourmet FS 20
Microscopio óptico Leica Polyvar 2
Peligro para la de

Referencias

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