La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

Resumen

Las células madre pluripotentes, cualquiera de las células madre pluripotentes embrionarias o inducidas (iPS), constituyen una valiosa fuente de células diferenciadas humanas, incluyendo cardiomiocitos. Aquí, nos centraremos en la inducción cardiaca de las células iPS, que muestra cómo usarlos para obtener cardiomiocitos humanos funcionales a través de un protocolo de los organismos con sede en embrioide.

Resumen

Con el fin de investigar los hechos de conducir el desarrollo del corazón y determinar los mecanismos moleculares que conducen a enfermedades del miocardio en los seres humanos, es fundamental primero para generar cardiomiocitos humanos funcionales (CM). El uso de estas células en el descubrimiento de fármacos y estudios de toxicología también sería altamente beneficioso, permitiendo que las nuevas moléculas farmacológicas para el tratamiento de trastornos cardíacos que ser validado pre-clínicamente en las células de origen humano. De las posibles fuentes de CM, las células madre pluripotentes inducidas (iPS) se encuentran entre los más prometedores, ya que se pueden derivar directamente de tejido del paciente fácilmente accesibles y poseen una capacidad intrínseca para dar lugar a todos los tipos de células del cuerpo ^1. Se han propuesto varios métodos para la diferenciación de las células iPS en los CM, que van desde los clásicos cuerpos embrioides (EB) enfoque de agregación de química definida protocolos de ^2,3. En este artículo se propone un protocolo basado en EBS y mostrar cómo esta metod se puede emplear para generar de manera eficiente las células CM-como funcionales a partir de células iPS alimentador-libres.

Introducción

Históricamente, la investigación de los mecanismos genéticos y moleculares de conducción desarrollo humano y la enfermedad se ha basado en la generación de modelos animales genéticamente modificados. Sin embargo, numerosos fenotipos humanos no pueden ser replicados con éxito en ratones, principalmente a causa de las diferencias biológicas existentes entre las dos especies. Por otra parte, el acceso a los tejidos humanos puede ser limitada y con frecuencia no permita que el material suficiente para obtener por estudios experimentales en profundidad. El campo de la biología cardiovascular sufre de estas dos limitaciones: la fisiología del corazón humano es significativ....

Protocolo

1. Mantenimiento del alimentador-libre y Propagación de líneas de células humanas iPS

1. Preparar los platos revestidos con Matrigel. Descongelar un vial de matriz ESC-cualificado humana en hielo durante una hora y se diluye en 25 medio DMEM-F12 ml. Añadir 1 ml a cada placa de 35 mm (o cantidades equivalentes por unidad de superficie si se utilizan otros platos), manteniendo todo en hielo y asegurar que todas las placas y los tubos son pre-enfriado. Cubrir las placas con papel de aluminio.

Nota: las concentraciones de valores Matrigel variar según el lote. Instrucciones de dilución se indican en la hoja de d....

Resultados

En nuestros estudios hemos generado los CM de varias líneas de células iPS. Estas líneas se generaron inicialmente en una capa de alimentación MEF pero se colocaron inmediatamente en Matrigel usando un medio definido (ya sea mTESR1 o Nutristem). Varios ensayos se utilizaron para verificar el mantenimiento de las propiedades morfológicas, la expresión de marcadores típicos de células pluripotentes (OCT-4, SSEA4 y TRA1-60) y su estabilidad genoma (Figura 1).

La inducción en el.......

Discusión

Las células madre pluripotentes tienen el potencial de diferenciarse espontáneamente en los CM, aunque con baja eficiencia y alta variabilidad entre líneas. Por consiguiente, el desarrollo de métodos de inducción novedosos se ha centrado en la mejora de la eficiencia del proceso y avanzar hacia protocolos más definidos. Sin embargo, la mayoría de estos nuevos métodos de diferenciación son bastante complejos, que requieren condiciones elaboradas cultura, control preciso del tiempo y la concentración de los reactivos, y e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Media and Reagents
Human Qualified ESC Matrix	BD Biosciences	354277	Descongele el frasco de 5 ml a 4 & grados; C en hielo O/N, alícuota en criotubos preenfriados sobre hielo, de acuerdo con las instrucciones de dilución de la hoja de datos y almacenar a -20 & grados; C .
Fibronectina, a partir de plasma humano, solución al 0,1%	Sigma	F0896-2MG Concentración de	trabajo: 5 μ g/cm2
Laminina	Sigma	L2020-1MG Concentración de	trabajo: 5 μ g/cm2
PBS (sin Mg y Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (con Mg y Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispasa II, proteasa neutra, grado II	Roche		4942078001 Stock: 10 mg/ml en DMEM-F12 a -20 & grados; C, solución de trabajo: 1 mg/ml en PBS (sin Mg/Ca)
Tripsina/EDTA, 0,5%	Sigma	T3924
Colagenasa tipo 2	Worthington	4176	Diluido a 480 U/ml (p. ej. 1,6 mg/ml) en PBS con Mg y Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Suero Knockout Reemplazo (KSR)	Life Technologies	10828-028	Descongelar a 4 & grados; C, alícuota y almacenar a -20 ° C
F– Tal Suero bovino (origen América del Sur)	Invitrogen	10270-106	Los lotes deben ser probados para determinar su potencial cardiogénico. Descongele a las 4 & grados; C, inactivación por calor a 56 °C; C durante 30 min, alícuota y almacenar a -20 °; C
PenStrep, penicilina-estreptomicina, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
Suplemento N2, 100X	Life Technologies	17502-048
Suplemento B27, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercapt– etanol	Invitrogen	31350-010
Gelatina, de piel porcina	Sigma	G1890-100G	Hacer caldo al 1% en agua, almacenar a -20 °C. Diluir al 0,1% en PBS y mantener a 4 ° C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combine el suplemento 5X con el medio básico, alícuota y almacene a -20 °C. No mantenga el medio completo a 4 ° C por más de 1 semana
Nutristem hESC XF	Stemgent de Biological Industries	05-100-1A	Descongelar a 4 & grados; C O/N, alícuota y almacenar a -20 ° C hasta su uso. Las alícuotas pueden mantenerse en 4 ° C por no más de una semana.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ácido ascórbico	Sigma	A4544-25G	Prepare las existencias a 10 mg/ml en agua. Almacene las alícuotas a -20 ° C en la oscuridad. Añadir a la MBE en la concentración final (500X)
Plasticware
35 mm Placas de cultivo	Becton Dickinson	353001
Cell	Corning Incorporated	3008
Placas de 12 pocillos	Becton Dickinson	353043
Permanox Portaobjetos de cámara Thermo	Fisher Scientific	177437
Portaobjetos de vidrio con cámara de 2 pocillos	Thermo Fisher Scientific	177380
Placas de 6 pocillos, superficie de fijación ultrabaja	Corning Incorporated	3471
Aguja 18G	Becton Dickinson	304622
Pipetas de vidrio para pasteur, 230 mm	VWR International	612-1702
Jeringa de 2,5 ml	Becton Dickinson	300188
Equipments
IVF Workstation	KSystem, de Nikon
Nikon SMZ1500 Microscopio estereoscópico	Nikon