La Caenorhabditis elegans Sistema Modelo para el Estudio Amylopathy

Resumen

Se describen métodos para estudiar los aspectos de la amylopathies en el gusano C. elegans. Mostramos cómo construir gusanos expresan Aß humano ₄₂ En las neuronas y la forma de poner a prueba su función en ensayos de comportamiento. Además, muestran cómo obtener cultivos neuronales primarios que pueden ser utilizados para las pruebas farmacológicas.

Resumen

Amylopathy es un término que describe la síntesis y la acumulación anormal de la proteína beta amiloide (Aß) en los tejidos con el tiempo. Aß es un sello distintivo de la enfermedad de Alzheimer (EA) y se encuentra en la demencia con cuerpos de Lewy, la miositis de cuerpos de inclusión y la angiopatía amiloide cerebral ^1-4. Amylopathies desarrollan progresivamente con el tiempo. Por esta razón organismos simples con periodos de vida cortos pueden ayudar a dilucidar los aspectos moleculares de estas condiciones. A continuación, se describen los protocolos experimentales para el estudio de la neurodegeneración mediada por Aß usando el gusano Caenorhabditis elegans. Así, construimos gusanos transgénicos mediante la inyección de ADN que codifica Aß humano ₄₂ en las gónadas sincitial de adultos hermafroditas. Líneas transformantes se estabilizan mediante una integración mutagénesis inducida. Los nematodos son la edad sincronizado mediante la recolección y la siembra de sus huevos. La función de las neuronas que expresan Aß ₄₂ se prueba en ensayos de comportamiento oportunos (ensayo de quimiotaxiss). Cultivos neuronales primarios obtenidos a partir de embriones se utilizan para complementar los datos de comportamiento y para probar los efectos neuroprotectores de los compuestos anti-apoptóticas.

Introducción

Beta amiloide (Aß) es un péptido de 36-43 aminoácidos que se forma después de la escisión secuencial de la proteína precursora de amiloide (APP) por β y γ secretasas ^1. La secretasa γ procesa el extremo C-terminal del péptido Aß y es responsable de sus longitudes variables ^5. Las formas más comunes de Aß son Aß ₄₀ y Ap _42, siendo esta última más comúnmente asociado a condiciones patológicas tales como ⁵ AD. A altas concentraciones de Aß forma β-hojas que se agregan para formar fibrillas amiloides ^6. Depósitos de fibrillas son el principal componente de las placas seniles que rodean las neuronas. Ambas placas y difusibles, oligómeros Aß no la placa, se cree que constituyen las formas patogénicas subyacentes de Aß.

El estudio de laboratorio de amylopathies neuronales se complica por el hecho de que estas condiciones de progreso con el tiempo. Por lo tanto, es IMPORTANTESt para el desarrollo de animales genéticamente manejable modelos complementarios a los ratones-con vida corta. Estos modelos se pueden utilizar para elucidar aspectos específicos de amylopathies-típicamente celular y molecular y en virtud de su simplicidad, para ayudar a capturar la esencia del problema. El gusano Caenorhabditis elegans cataratas es esta categoría. Tiene una vida corta, ~ 20 días y, además, los procesos celulares básicos como la regulación de la expresión génica, el tráfico de proteínas, la conectividad neuronal, sinaptogénesis, la señalización celular y la muerte son similares a los mamíferos ^7. Las características únicas del gusano incluyen la genética de gran alcance y la falta de un sistema de vasos, lo que permite estudiar el daño neuronal independientemente del daño vascular. Por otro lado, la falta de un cerebro limita el uso de C. elegans para estudiar muchos aspectos de la neurodegeneración. Además, la reproducción y la identificación de las distribuciones anatómicas de las lesiones no se pueden realizar en este organismo. Otro límiteciones incluyen la dificultad para evaluar tanto las diferencias en los perfiles de expresión génica y alteraciones de la conducta compleja y la función de la memoria. A continuación se describen los métodos para generar C. modelos elegans de amylopathies.

Protocolo

1. Construcción de gusanos transgénicos

1. Transformación.
   1. Preparar almohadillas de inyección. Coloque una gota de caliente, 2% de agarosa disuelta en agua, sobre un cubreobjetos de vidrio. Colocar rápidamente un segundo cubreobjetos sobre la gota y golpee suavemente ella. Después de la agarosa se ha solidificado, cubreobjetos diapositivas aparte, y hornear el cubre-pad en un horno de vacío a 80 º CO / N.
   2. Tire de pipetas. Utilizamos un P-97 Extractor Sutter tirar 1/0.5 mm OD / ID capilares de borosilicato con filamento. Las pipetas se forjan con punta cerrada que se rompe abierto en una etapa posterior.
   3. Prepare la mezcla de inyección. Hacer la mezcla de inyección que contiene el ADN de interés (20 ng / l por construcción) más ADN de plásmido vacío a una concentración final de 150 ng / l. Centrifugar la mezcla de inyección para eliminar cualquier contaminante. Este paso es crucial, ya que los contaminantes reducen la eficiencia de transformación. Transferir el 5 l superior (escombros y otros contaminantes se acumulan en la parte inferior) a un tubo nuevo de be utilizada en la inyección.
   4. Cargar la mezcla de inyección por capilaridad. La parte inferior de la pipeta se sumerge en la mezcla de inyección. Típicamente 0,5 l son suficientes para inyectar 100 gusanos.
   5. Cargar pipeta de inyección. Inserte la pipeta en el soporte del micromanipulador y lo rompiera abierto por el roce de la punta contra el borde de una hoja de cubierta montada en un portaobjetos de vidrio o alternativamente contra los desechos en la plataforma de agarosa. Este es un paso crucial como consejos muy grande el daño del gusano y demasiado pequeños consejos se obstruyen fácilmente. La calidad de la punta rota puede ser juzgado por la forma y lo más importante por la tasa de flujo. La velocidad de flujo se puede evaluar por el tamaño de las burbujas que fluyen desde la punta abierta inmerso en una gota de aceite de halocarbono 700 en respuesta a una presión de inyección.
   6. Traslado gusanos para rellenar inyección. Ponga una gota de aceite de hidrocarburo halogenado 700 en una plataforma de inyección y transferir varios (1 o 2 para principiantes) gusanos para el aceite. Utilice un gusano recoger a empujar los gusanos hacia abajo sobre la almohadilla hasta que lay se adhieren a la agarosa. Los gusanos deben estar orientadas en filas con lados ventrales en la misma dirección. Evite tocar la cabeza del gusano. Si después de varios intentos de los gusanos no se adhieren a la almohadilla, reemplazar con una almohadilla fresca o aumentar agarosa espesor y / o concentración.
   7. Inserte la pipeta en el gusano. Al mover la etapa, colocar el gusano debajo de la pipeta. Coloque la pipeta en el núcleo central de la gónada porque su citoplasma es compartida por muchos núcleos de células germinales. Esto aumenta la probabilidad de entregar ADN inyectado a muchos progenie. La pipeta debe estar casi en paralelo al tornillo sin fin (~ 15 ° -25 ° de ángulo). Empuje verticalmente la punta de la pipeta hacia abajo el cuerpo del gusano hasta que se presiona la piel. A continuación, toque suavemente en el manipulador para inducir la inserción de la punta. Para obtener los mejores resultados inyectar ambas gónadas.
   8. Se inyecta la solución de ADN. Aplique presión sobre la pipeta hasta que las olas gónadas. Detener el flujo y tire el gusano de la pipeta. Prueba de la aguja para el flujo y luego pasara la siguiente gusano y etapas de inyección de repetición.
   9. Recuperar los gusanos: Añadir una gota (~ 10 l) de tampón de recuperación en los gusanos y se incuba hasta que los gusanos comienzan a nadar. Añadir un volumen igual de M9, espere hasta que los gusanos reanudar natación y repetir varias veces hasta que la solución es principalmente M9. Transferir individualmente gusanos de placas sembradas.
2. Integración.
   1. Coloque 40 sanos, bien alimentados, L4 gusanos en un plato fresco
   2. Irradiar con γ-ray con 4.000 rads de 40 min. Traslado gusanos irradiados (P0), en placas sembradas OP50 frescas (4 gusanos / placa). Los gusanos, alternativamente, pueden ser irradiados con una dosis de 300 J / m ² UVs.
   3. Traslado 10-20 transformantes F1 de cada placa para placas individuales, etiquetar las placas con el correspondiente origen P0.
   4. Individual a cabo 2-4 transformantes F2 para cada F1 para placas separadas. Comprobar la progenie F3 para la transmisión de 100% del marcador de transformación. Por lo general, el 1-3% de la progenie de un wil gusano irradiadoTengo un evento de integración.
   5. Hacer existencias de tres o más líneas transformantes independientes.

2. Los ensayos de comportamiento

1. Edad-sincronización.
   1. Crecer gusanos en estándar 10 cm placas NGM + OP50 E. coli hasta una gran población de adultos grávidas se alcanza (3-5 días).
   2. Recoja los gusanos en tubos Falcon de 50 ml de suspensión en 1 ml de tampón M9.
   3. Añadir 5 ml de tampón M9 y se centrifuga a 450 g durante 3 min. Desechar el sobrenadante. Repita 3-4x.
   4. Al final de la última centrifugación, eliminar el sobrenadante y añadir 10 volúmenes de solución de hipoclorito básica (NaOH 0,5 M, 1% de hipoclorito recién mezclado) a los gusanos sedimentadas. Incubar a temperatura ambiente durante ~ 10 min. La reacción de lisis se puede controlar mediante la colocación de una gota de la reacción de lisis en un cubreobjetos y el examen de los gusanos bajo un microscopio. Cuando más o menos 80% de los gusanos están rotos la reacción debe ser detenido.
   5. Detenga la reacción de lisis por complementog el mismo volumen de tampón de huevo estéril.
   6. Recoger los huevos (y canales) por centrifugación a 450 xg durante 5 min.
   7. Lavar los huevos con tampón estéril huevo 2-3x.
   8. Incubar los huevos O / N en tampón M9 y sembrarlos en placas NGM estándar.
2. Ensayo de quimiotaxis.
   1. Prepare varias piezas de agar aproximadamente 0.5x0.5x0.5 cm. Depositamos el agar en una placa de 10 cm y cortamos los trozos de agar a partir de ahí.
   2. Remojar el trozo de agar en una solución que contiene el atrayente deseada (en concentraciones saturantes, cerca-saturantes) durante 2 horas. Atrayentes típicos son lisina (0,5 M), biotina (0,2 M).
   3. Depositar un trozo de agar en una placa de ensayo de 10 cm en la que se han marcado la ubicación de un punto de prueba y un punto de control (Figura 1A). Permitir equilibración y la formación de un gradiente de O / N (Figura 1B). Preparar 5 placas para un solo experimento.
   4. Antes del experimento añadir 10 l de 20 mM NaN ₃ (anesthetic) para cada punto.
   5. Coloque 20 gusanos edad sincronizados en el centro de la placa. Colocar la placa en la incubadora a 20 ° C.
   6. Después de 1 hora, contar los animales en los puntos de prueba / control y calcular el índice de quimiotaxis (CI) de la siguiente manera: donde N, _test N y N _Cnt., indican que el número total de animales, el número de animales en el área de análisis y el número de animales en el punto de control.

3. Primaria embrionarias de cultivo celular

1. Lyse gusanos como se describe en la edad de sincronización.
2. Detener la reacción mediante la adición de lisis el mismo volumen de tampón de huevo estéril y se centrifuga a 450 xg durante 5 min. Deseche con cuidado el sobrenadante, teniendo cuidado de no perder los huevos sedimentadas. Repita 2 a 3 veces o hasta que sobrenadante quede claro.
3. Resuspender pellet (huevos y cadáveres) En 2 ml de tampón de huevo estéril y añadir 2 ml de sacarosa al 60% estéril en tampón de huevo. Mezclar esta solución hasta que los huevos se resuspendieron completamente (ya que tienden a formar grumos bajo centrifugación) a mano o por agitación.
4. Centrifugar a 450 xg durante 15 min.
5. Transferir cuidadosamente el sobrenadante (que contiene los huevos) a un tubo estéril. Descartar sedimento que contiene canales y otras sub-productos de la lisis.
6. Retire sacarosa residual mediante resuspensión en tampón de los huevos de huevo y centrifugación a 450 xg durante 5 min. Recoger con cuidado y desechar el sobrenadante. Repita 3 veces.
7. Bajo una campana laminar resuspender huevos sedimentadas en tampón de huevo estéril que contiene 1 U / ml quitinasa a temperatura ambiente para digerir las cáscaras de huevo. Después de 30 min empieza a controlar la reacción (bajo un microscopio de cultivo de células invertida). Cada lote de quitinasa tiene una actividad ligeramente diferente. Típicamente, la digestión se completó en 1 hr.
8. Cuando aproximadamente 70-80% cáscaras de huevo son digeridos por quitinasa complemento CM-15 (L-15 de cultivo celular medio que contiene 10% de suero bovino fetal, 50 U / ml de penicilina, y 50 mg / ml de estreptomicina). Disociar las células utilizando una jeringa con un calibre de 27. Se filtra la suspensión de células con un filtro de 5,0 micras para eliminar embriones intactos, grupos de células y larvas.
9. Pellet la suspensión de células disociadas por centrifugación a 450 xg durante 15 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 15-CM medio de cultivo celular.
10. Células disociadas Plate sobre cubreobjetos de vidrio previamente revestidas con lectina de cacahuete (0,1 mg / ml) disuelto en agua Nota:. Células deben adherirse al sustrato con el fin de diferenciar.
11. Las células se pueden mantener a temperatura ambiente (16-20 ° C) en aire durante más de 2 semanas.

Resultados

Con nuestros protocolos se estudian los efectos de los humanos Aß ₄₂ oligómero en la función neuronal ^8. Un fragmento que codifica Aß humano ₄₂ y la secuencia de codificación del péptido señal artificial de fuego vector de pPD50.52 se amplificó a partir constructo PCL12 ⁹ usando cebadores que introdujeron un Sma 1 sitio de endonucleasa de restricción en los extremos. El fragmento se inserta en un constructo que contiene un FLP-6 secuencia del promotor de 2481 pb en el...

Discusión

Aquí se describe un enfoque combinado, para estudiar los aspectos celulares y moleculares de amylopathies utilizando C. elegans. Las ventajas de este enfoque incluyen:. 1) bajo costo C.elegans se mantiene en la placa de Petri normal de sembrado con bacterias, a temperatura ambiente. 2) genética potentes. Los animales transgénicos pueden obtenerse en pocos meses y una amplia gama de secuencias de promotor está disponible para conducir la expresión del gen deseado en las neuronas específicas. 3), bien ca...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1. NGM
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
Agar bacteriológico	AMRESCO	J637	17 g
Bacto-peptona	AMRESCO	J636	2,5 g
Agua			Llevar a 975 ml
Esterilizado en autoclave, luego agregar los siguientes elementos y mezclar bien
Sulfato	de magnesioSigma-Aldrich	M2643	1 ml de 1 M de caldo
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	C5670	1 ml de 1 M de caldo
Colesterol	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml de 5 mg/ml de caldo ( en etanol)
Tampón			de potasio 25 ml de 1M de caldo
2. Tampón de fosfato de potasio
Fosfato de potasio monobásico	Sigma-Aldrich	P5655	108,3 g
Fosfato de potasio dibásico	Sigma-Aldrich	P3786	35,6 g
Agua			Llevar a 1 L
Esterilizado en autoclave
3. Tampón M9
Fosfato potásico monobásico	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
Fosfato sódico dibásico	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
Cloruro sódico	Sigma-Aldrich	S5886	5 g
Sulfato de magnesio	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml de 1 M de caldo
Agua			Llevar a 1 L
Esterilizado en autoclave
4. Tampón de huevo (pH 7,3, 340 mOsm)
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S5886	118 mM
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
Agua			Llevar a 1 L
Esterilizado en autoclave
5. CM-15
L-15 medio de cultivo	Gibco	11415	450 ml
Suero fetal bovino	Gibco	10437-028	50 ml
Penicilina	Gibco	15140	50 unidades/ml
Estreptomicina	Gibco	15140	50 g/ml
Ajustar a 340 mOsm con sacarosa y luego filtrar estéril en botellas esterilizadas en autoclave y almacenar a 4 & grados; C
6. Otros reactivos
Aceite Halocarbon 700	Productos de Halocarbono	9002-83-9
5 μ m Filtro de jeringa Acrodisc PALL	Co.	4199
Quitinasa	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
Lectina (cacahuete)	Sigma-Aldrich	L0881-10MG
Hidróxido de sodio	Fisher Scientific	S320
Lisina	Sigma-Aldrich	L5501
Biotina	Sigma-Aldrich	B4639
Solución	de hipoclorito de sodioSigma-Aldrich	425044
Azida sódica	Sigma-Aldrich	71289
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S0389