La<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para el Estudio Amylopathy

Resumen

Se describen métodos para estudiar los aspectos de la amylopathies en el gusano C. elegans. Mostramos cómo construir gusanos expresan Aß humano ₄₂ En las neuronas y la forma de poner a prueba su función en ensayos de comportamiento. Además, muestran cómo obtener cultivos neuronales primarios que pueden ser utilizados para las pruebas farmacológicas.

Resumen

Amylopathy es un término que describe la síntesis y la acumulación anormal de la proteína beta amiloide (Aß) en los tejidos con el tiempo. Aß es un sello distintivo de la enfermedad de Alzheimer (EA) y se encuentra en la demencia con cuerpos de Lewy, la miositis de cuerpos de inclusión y la angiopatía amiloide cerebral ^1-4. Amylopathies desarrollan progresivamente con el tiempo. Por esta razón organismos simples con periodos de vida cortos pueden ayudar a dilucidar los aspectos moleculares de estas condiciones. A continuación, se describen los protocolos experimentales para el estudio de la neurodegeneración mediada por Aß usando el gusano Caenorhabditis elegans. Así, construimos gusanos transgénicos mediante la inyección de ADN que codifica Aß humano ₄₂ en las gónadas sincitial de adultos hermafroditas. Líneas transformantes se estabilizan mediante una integración mutagénesis inducida. Los nematodos son la edad sincronizado mediante la recolección y la siembra de sus huevos. La función de las neuronas que expresan Aß ₄₂ se prueba en ensayos de comportamiento oportunos (ensayo de quimiotaxiss). Cultivos neuronales primarios obtenidos a partir de embriones se utilizan para complementar los datos de comportamiento y para probar los efectos neuroprotectores de los compuestos anti-apoptóticas.

Introducción

Beta amiloide (Aß) es un péptido de 36-43 aminoácidos que se forma después de la escisión secuencial de la proteína precursora de amiloide (APP) por β y γ secretasas ^1. La secretasa γ procesa el extremo C-terminal del péptido Aß y es responsable de sus longitudes variables ^5. Las formas más comunes de Aß son Aß ₄₀ y Ap _42, siendo esta última más comúnmente asociado a condiciones patológicas tales como ⁵ AD. A altas concentraciones de Aß forma β-hojas que se agregan para formar fibrillas amiloides ^6. Depósitos de fibrillas son el principal componente de las placas seniles que rodean las neurona....

Protocolo

1. Construcción de gusanos transgénicos

1. Transformación.
   1. Preparar almohadillas de inyección. Coloque una gota de caliente, 2% de agarosa disuelta en agua, sobre un cubreobjetos de vidrio. Colocar rápidamente un segundo cubreobjetos sobre la gota y golpee suavemente ella. Después de la agarosa se ha solidificado, cubreobjetos diapositivas aparte, y hornear el cubre-pad en un horno de vacío a 80 º CO / N.
   2. Tire de pipetas. Utilizamos un P-97 Extractor Sutter tirar 1/0.5 mm OD / ID capilares de borosilicato con filamento. Las pipetas se forjan con punta cerrada que se rompe abierto en una etapa posterior.
   3. Prepare la mezcla de inyecc....

Resultados

Con nuestros protocolos se estudian los efectos de los humanos Aß ₄₂ oligómero en la función neuronal ^8. Un fragmento que codifica Aß humano ₄₂ y la secuencia de codificación del péptido señal artificial de fuego vector de pPD50.52 se amplificó a partir constructo PCL12 ⁹ usando cebadores que introdujeron un Sma 1 sitio de endonucleasa de restricción en los extremos. El fragmento se inserta en un constructo que contiene un FLP-6 secuencia del promotor de 2481 pb en el.......

Discusión

Aquí se describe un enfoque combinado, para estudiar los aspectos celulares y moleculares de amylopathies utilizando C. elegans. Las ventajas de este enfoque incluyen:. 1) bajo costo C.elegans se mantiene en la placa de Petri normal de sembrado con bacterias, a temperatura ambiente. 2) genética potentes. Los animales transgénicos pueden obtenerse en pocos meses y una amplia gama de secuencias de promotor está disponible para conducir la expresión del gen deseado en las neuronas específicas. 3), bien ca.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1. NGM
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
Agar bacteriológico	AMRESCO	J637	17 g
Bacto-peptona	AMRESCO	J636	2,5 g
Agua			Llevar a 975 ml
Esterilizado en autoclave, luego agregar los siguientes elementos y mezclar bien
Sulfato	de magnesioSigma-Aldrich	M2643	1 ml de 1 M de caldo
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	C5670	1 ml de 1 M de caldo
Colesterol	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml de 5 mg/ml de caldo ( en etanol)
Tampón			de potasio 25 ml de 1M de caldo
2. Tampón de fosfato de potasio
Fosfato de potasio monobásico	Sigma-Aldrich	P5655	108,3 g
Fosfato de potasio dibásico	Sigma-Aldrich	P3786	35,6 g
Agua			Llevar a 1 L
Esterilizado en autoclave
3. Tampón M9
Fosfato potásico monobásico	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
Fosfato sódico dibásico	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
Cloruro sódico	Sigma-Aldrich	S5886	5 g
Sulfato de magnesio	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml de 1 M de caldo
Agua			Llevar a 1 L
Esterilizado en autoclave
4. Tampón de huevo (pH 7,3, 340 mOsm)
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S5886	118 mM
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
Agua			Llevar a 1 L
Esterilizado en autoclave
5. CM-15
L-15 medio de cultivo	Gibco	11415	450 ml
Suero fetal bovino	Gibco	10437-028	50 ml
Penicilina	Gibco	15140	50 unidades/ml
Estreptomicina	Gibco	15140	50 g/ml
Ajustar a 340 mOsm con sacarosa y luego filtrar estéril en botellas esterilizadas en autoclave y almacenar a 4 & grados; C
6. Otros reactivos
Aceite Halocarbon 700	Productos de Halocarbono	9002-83-9
5 μ m Filtro de jeringa Acrodisc PALL	Co.	4199
Quitinasa	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
Lectina (cacahuete)	Sigma-Aldrich	L0881-10MG
Hidróxido de sodio	Fisher Scientific	S320
Lisina	Sigma-Aldrich	L5501
Biotina	Sigma-Aldrich	B4639
Solución	de hipoclorito de sodioSigma-Aldrich	425044
Azida sódica	Sigma-Aldrich	71289
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S0389

destilada de fosfato destilada destilada destilada