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Un procedimiento de detección química de glucocorticoides Señalización con un sistema indicador de pez cebra Larva luciferasa

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DOI:

10.3791/50439

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10 de septiembre de 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Toxicology and Genetics, Karlsruhe Institute of Technology - Campus North, 2Institute of Organic Chemistry, Karlsruhe Institute of Technology - Campus North, 3Institute of Organic Chemistry, Karlsruhe Institute of Technology - Campus South

En este artículo

Resumen

Se describe el procedimiento y el análisis de datos de un sistema de detección química para la señalización de glucocorticoides hormona del estrés usando larvas de pez cebra: la de respuesta en vivo Pez Cebra actividad luciferasa (DE GRIZLY) ensayo de glucocorticoides. El ensayo sensible y específicamente detecta efectos en la señalización de glucocorticoides por compuestos que requieren metabolización o afectan la producción de glucocorticoides endógena.

Resumen

Hormonas del estrés de glucocorticoides y sus derivados artificiales se utilizan ampliamente las drogas para tratar la inflamación, pero el tratamiento a largo plazo con glucocorticoides pueden dar lugar a efectos secundarios graves. Se necesitan sistemas de ensayo para buscar nuevos compuestos que influyen en la señalización de glucocorticoides in vivo o para determinar los efectos no deseados de los compuestos sobre la vía de señalización de glucocorticoides. Hemos establecido un ensayo de pez cebra transgénico que permite la medición de la actividad de señalización de glucocorticoides in vivo y en tiempo real, el ensayo de DE GRIZLY (glucocorticoides reactivas in vivo la actividad de luciferasa de pez cebra). El ensayo basado en la luciferasa detecta efectos en la señalización de glucocorticoides con alta sensibilidad y especificidad, incluyendo los efectos de compuestos que requieren metabolización o afectan la producción de glucocorticoides endógena. Presentamos aquí un protocolo detallado para la realización de pantallas químicas con este ensayo. Se describe la adquisición de datos, la normalización yanálisis, poniendo énfasis en el control de calidad y la visualización de datos. El ensayo proporciona una lectura sencilla, resuelta en el tiempo, y cuantitativo. Puede funcionar como una plataforma independiente, pero también se puede integrar fácilmente en flujos de trabajo de selección de alto rendimiento. Es, además, permite muchas aplicaciones más allá de la detección química, como la vigilancia del medio ambiente de los perturbadores endocrinos o los estudios sobre el estrés.

Introducción

Los glucocorticoides (GCS) son hormonas esteroides producidas por la glándula suprarrenal, que desempeñan un papel importante durante la respuesta al estrés y en la regulación del metabolismo de la 1. GC se unen a receptores de glucocorticoides citoplasmáticos (GRS) de la superfamilia de receptores nucleares que, tras la unión, translocan al núcleo 2. Aquí, se puede por ejemplo reprimir la transcripción al interferir con otros factores de transcripción (transrepresión) o activar la transcripción de genes a través de elementos de glucocorticoides de respuesta (Gres, transactivación.) Debido a sus propiedades anti-inflamatorias, GC, tanto naturales y artificiales se utilizan ampliamente fármacos en el tratamiento de un número de enfermedades, tales como asma o artritis 3. Sin embargo, sobre todo el uso a largo plazo de la GC puede dar lugar a efectos secundarios graves, como la diabetes y el glaucoma 4. Por lo tanto, los nuevos compuestos dirigidos GC señalización con la eficiencia del tratamiento potencialmente más beneficiosa y la tolerancia son muy buscados en popaer. Es importante destacar que los efectos de ligandos observados en las células cultivadas pueden diferir de los que se observan in vivo 5. Tales efectos pueden sesgar los resultados obtenidos con el cultivo celular convencional basada ensayos de cribado farmacéuticas. Química screening in vivo como habilitado por el modelo de pez cebra ha entrado recientemente en el foco, ya que permite la determinación de los efectos no detectables en el cultivo celular 6,7.

Vías de señalización hormonales también pueden verse afectadas por contaminantes ambientales. Los llamados productos químicos disruptores endocrinos (EDC) afectan a diversas hormonas reguladas procesos 8. Por lo tanto, la reproducción y la diferenciación sexual de los organismos acuáticos pueden ser moduladas por las sustancias con actividades similares al estrógeno. Recientemente, han surgido preocupaciones de que los trastornos metabólicos podrían estar vinculados a las SAE en el medio ambiente 9. Una vía de los objetivos de tales "interrupción metabólica" es la vía de glucocorticoides, que también ha sido implicado en Xenoefectos bióticos sobre el desarrollo y la función inmune 10,11. Sin embargo, en comparación con la gran cantidad de información disponible sobre los compuestos que interfieren con la acción de la hormona esteroide sexual, se sabe relativamente poco acerca de los efectos endocrinos interrupción mediadas a través de la GR. Por lo tanto, se necesitan herramientas que permitan el seguimiento de los efectos contaminantes de la señalización de GC in vivo.

El pez cebra ha sido durante mucho tiempo un modelo popular en la biología del desarrollo y también ha atraído más recientemente los investigadores de otros campos, incluyendo la endocrinología 12. En comparación con otros teleósteos, el sistema de señalización de GC de pez cebra es más similar a la de los mamíferos, ya que el pez cebra genoma contiene sólo un gen GR en oposición a los receptores de la duplicación en muchas otras especies de peces 13-15. Además, el eje hipotálamo-pituitaria-adrenal ya es funcional en 5 días de edad larvas de pez cebra, que aumentan la producción de GC endógena en respuesta a factores de estrés 14,16-18.

Hemos generado recientemente una línea transgénica de pez cebra, GRE: Luc, que permite la monitorización de la actividad de señalización de GC in vivo y en tiempo real 18. La línea lleva un constructo reportero gen de la luciferasa bajo el control de un promotor mínimo caja TATA y cuatro GRE concatemerized (Figura 1A). GC bioluminiscencia inducida puede medirse a partir de un solo GRE: larvas de Luc en 96 placas de microtitulación bien in vivo durante períodos prolongados de tiempo. Este ensayo DE GRIZLY (para "glucocorticoides de respuesta en vivo Pez Cebra Luciferase actividad") se puede utilizar en un número de diferentes campos de investigación, como la investigación del estrés, control del medio ambiente, y las pantallas farmacológicas 18. Hemos sido capaces de detectar el aumento en el cortisol endógeno después de estrés osmótico a partir de larvas individuales y podríamos seguir la maduración de la respuesta durante el desarrollo. Por otra parte, podríamos monitorizar los efectos sobre la GC señalización de organoestaños que requieren la metabolización por la larva. Es importante destacar que la línea fue capaz de detectar estos efectos a concentraciones ambientales relevantes. Por último, en una pantalla de piloto el ensayo de sensibilidad y detecta específicamente compuestos con actividad de GC a partir de una biblioteca química, incluyendo un compuesto que estimula la producción de cortisol endógeno en las larvas. Aquí se describe un protocolo detallado para pantallas químicas utilizando el ensayo DE GRIZLY.

Protocolo

1. Preparar la dilución de trabajo de la Biblioteca Química

Cavidad de predilución de los compuestos de la biblioteca de medicamentos para ser probado (por ejemplo, la FDA aprobó las drogas, Enzo Life Science) en E3 (NaCl 5 mM, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM CaCl 2) con una estación de manipulación de líquidos robótico (por ejemplo Multiprobe II, 8 agujas con adaptador de puntas disposición, PerkinElmer). Las concentraciones adecuadas son, por ejemplo 40 g / ml en 3% de DMSO, pero esto dependerá del tipo de biblioteca usado. Los ajustes Multiprobe II correspondientes a los pasos descritos a continuación se indican en la Tabla 1. El protocolo descrito en la tabla permite la preparación de cuatro placas alícuotas en paralelo.

  1. Pipeta 10 ml de alícuotas de la biblioteca de papeles (2 mg / ml en DMSO) en placas de pocillos profundos (por ejemplo, placas de 96 pocillos de almacenamiento, Round Bueno, 0,8 ml, ABgene). Las columnas 1 y 12 deben dejarse vacíos - éstos recibirán los controles positivos y negativos dentro de la placa.
    2. i> Se dispensan 490 l de E3 con DMSO al 1% en las alícuotas preparadas de la biblioteca con el Multiprobe II. La dilución se realiza con agujas fijas sin la punta de eliminación.
  2. Añadir 10 l de DMSO en la columna 1 y 10 l de una solución de dexametasona 5 mM (en DMSO) a la columna 12 como controles dentro de la placa. La concentración de DMSO en todos los pocillos es ahora 3%, la concentración de dexametasona en los pocillos de control positivo es 100 mM en E3 / 3% de DMSO.
  3. Sellar la placa con adhesivo resistente DMSO láminas de sellado. Almacenar las placas a -80 º C hasta su uso.

2. Cría de Periodista Fish

Recoger los embriones de desove natural de los apareamientos de grupo entre GRE: Luc pescado transgénico. Levante embriones (no más de 60) en 9 cm de platos Petri que contenían medio E3 suplementado con 1 mg / ml de azul de metileno fungicida hasta 4 días después de la fertilización (dpf) en una incubadora a 28 ° C. Cambio de medio E3 regularmente.

título "> 3. Preparación de luciferasa Medio (E3L)

Preparar una solución de luciferina madre acuosa de 50 mM añadiendo dH2O al vial que contiene el polvo luciferina. Esta solución madre se puede almacenar a -80 ° C durante varios meses. Diluir el Stock luciferina en un medio de E3 a una concentración final de 0,5 mM para obtener medio E3L.

4. Distribuir larvas en placas de 96 pocillos

  1. Prepare 1 ml puntas de pipeta con gran calibre cortando aproximadamente 5 mm de la punta y los bordes afilados en llamas brevemente.
  2. Larvas piscina de varios cruces vertiendo cuidadosamente de las placas de Petri en un vaso de precipitados. Cosechar alrededor de 50 larvas en un momento mediante el vertido suavemente sobre un tamiz (tamaño de poro de 0,25 mm de diámetro) e inmediatamente colocar el tamiz en una pequeña placa de Petri (diámetro 5,5 cm) lleno de medio de E3L.
  3. Con una punta de pipeta de orificio ancho, transferir 225 l de medio que contienen una larva cada uno de los pocillos de una blancoPlaca de 96 pocillos (OptiPlate, PerkinElmer).
  4. Sellar las placas con láminas de sellado adhesivo (por ejemplo TopSeal-A, PerkinElmer) y se incuba ellos a 28 ° C durante la noche. Esto evita que la preincubación de grabación de cambios transitorios en la bioluminiscencia inmediatamente después de la adición de luciferina, un fenómeno que se produce también en las células cultivadas 19.

5. Tratamiento de Drogas

  1. Retire la placa que contiene la dilución de trabajo de la biblioteca desde el -80 ° C congelador aproximadamente 4 horas antes de su uso. Vórtice suavemente la placa y brevemente girar en una centrífuga para recoger el líquido en la parte inferior de la placa.
  2. Retire las hojas de sellado adhesivas de las placas de larvas.
  3. Con un 96-canal de dispositivo de pipeta de accionamiento manual (por ejemplo, Liquidator, Steinbrenner) pipeta la solución de fármaco hacia arriba y abajo 3 veces. Entonces alícuota de 25 l de la dilución de trabajo de la biblioteca química en los pocillos que contienen las larvas (con el ejemplo anterior, esteresultados en una concentración final de 4 g / ml en E3 con 0,3% de DMSO). Preparar 10 (mínimo: 5) placas de réplica con larvas por placa biblioteca.
  4. Sellar las placas con las láminas de sellado adhesivo y la etiqueta de cada plato con una etiqueta de código de barras.

6. Grabación de luminiscencia

  1. Coloque las placas que contienen las larvas en las unidades de apilamiento de un lector de bioluminiscencia EnVision como la creciente sensibilización de luminiscencia (Perkin Elmer). Alternativamente, utilizar un sistema robotizado incubadora tales como las empleadas para los sistemas de detección de cultivo de células de mamífero en combinación con el lector.
  2. Bioluminiscencia Registro durante dos días utilizando ajustes del lector análogos a los descritos en la Tabla 2 para el lector Envision. Adaptar el número de repeticiones del ensayo con el número de placas en la carrera para que coincida con el tiempo de ejecución requerido.
  3. Después del final de la carrera, comprobar las placas para determinar la presencia de larvas muertas para evaluar la toxicidad general del borradorHeridas.

7. Análisis de Datos

Todo el análisis de los datos se realiza en el entorno de programación estadística R utilizando scripts personalizados.

  1. Cálculo AUC
    Con el fin de identificar compuestos que activan GC de señalización independientemente de sus propiedades cinéticas, determinar el área bajo la curva (AUC) de las trazas grabadas de luminiscencia (de bioluminiscencia recuentos en función del tiempo primas) como el parámetro de cribado. Las AUC son aproximados con la regla trapezoidal (ver figuras 2a y a ').
  2. Normalización
    Log transformada de los valores de AUC con el fin de garantizar un mayor normalidad de los datos (Figuras 2b y B '). Entonces normalizar el log transformado los valores de AUC para cada placa de la biblioteca con el método de puntuación Z robusta (ver 20). Esta normalización se traduce en valores que representan el número de desviaciones estándar de la mediana de todos los puntos de datos. De esta manera,errores sistemáticos, como la variabilidad inter-run, se eliminan de los datos. Los datos ahora pueden ser visualizados por el trazado de la robusta Z-score promedio de las réplicas para cada pozo (Figuras 2c y c ').
  3. Las métricas de calidad
    1. Mapa de calor
      Con el fin de visualizar la placa efectos relacionados, graficar los datos de cada plato como un mapa de calor utilizando por ejemplo la función heatmap.2 del paquete gplot 21. De esta manera, los efectos de borde o compuesto de arrastre se pueden detectar fácilmente (por ejemplo, comparar Figura 3A con 3B). Excluir placas sub-óptimos de los nuevos análisis.
    2. Curva ROC
      Para determinar la sensibilidad y especificidad de la prueba, calcular un receptor de funcionamiento característico (ROC) por ejemplo con la ayuda del paquete bioconductor ROC 22 utilizando los valores de Z-score determinados de 7,2 (Figura 3c). Posteriormente, determinar el AUC de este curve. Un valor de AUC de cerca de 1 indica una alta sensibilidad y especificidad del ensayo.
  4. Hit de identificación
    Para optimizar el valor de corte para la identificación de compuestos activos, determinar el índice de Youden. Para el cálculo del índice, se resta la verdadera tasa positiva estimada (TPR) de la tasa de falsos positivos (FPR) de la curva ROC para el aumento de los valores de corte Z-score robustos. Tome la robusta Z-score con el índice más alto de Youden (TPR menos FPR) como el punto de corte. El TPR / FPR se puede estimar mediante la detección de pocillos de control positivo o de los compuestos activos conocidos dentro de la biblioteca. Al utilizar el control positivo pozos asegurarse de que coinciden con la fuerza éxito esperado.

8. Reevaluación

  1. Vuelva a evaluar los compuestos de ataque positivos mediante el tratamiento de las larvas con diluciones en serie de los compuestos obtenidos a partir de un proveedor diferente, utilizando la misma grabación de la configuración descrita anteriormente. Los verdaderos éxitos deben inducir una luminiscencialso en este ensayo, idealmente en una manera dependiente de la dosis.

Resultados

En una publicación anterior 18, que exhibió una biblioteca de 640 fármacos aprobados por la FDA en una pantalla de piloto para evaluar el rendimiento del ensayo de DE GRIZLY. Esta biblioteca contiene 12 bona fide GC, lo que nos permite determinar las medidas de calidad para la sensibilidad y especificidad de la prueba.

La figura 2 muestra ejemplos típicos de los análisis de los datos en bruto y la normalización tomado de esta pantalla. Un resultado típico de un control de dexametasona así se representa en la figura 2a, que ilustra la información temporal dada por los datos. Un pico en la bioluminiscencia que se produce en alrededor de 12 horas después del tratamiento disminuye lentamente durante el siguiente 36 horas de medición. Figura 2a 'pone de relieve la aproximación del valor AUC utilizando el método trapezoidal. Este cálculo se lleva a cabo para todos los pocillos y cada repetición técnica. El resultado de la transformación de registro se muestra en las Figuras 2b </ Strong> y b '. Aquí, la media de los controles positivos se trazan en un gráfico normal de QQ. Transformación logarítmica conduce a una mayor aproximación de los puntos de datos a los valores teóricos distribuidos normalmente indicados por las diagonales rojas. Una transformación para lograr la normalidad de los datos aumenta la potencia estadística de los análisis posteriores. Por último, las figuras 2c y 2c 'muestran el efecto de la normalización robusta Z-score en la variabilidad de placa a placa: Los diferentes valores de referencia obtenidos con diferentes placas (Figura 2c) se normalizan en el robusto parcela Z-score en la figura 2c.

Los valores de puntuación z robustos se pueden utilizar para identificar errores sistemáticos en los datos mediante la visualización de la distribución de los accesos a través de las placas. Figura 3a muestra un ejemplo de un mapa de calor de una placa de biblioteca, en la que el robusta puntuación Z Values se representan codificados por colores en las posiciones de los pocillos. Uno se identifica con facilidad la columna 12 con los controles positivos en forma de placa. Compuestos de la biblioteca de puntuación positivos se ven en F8 bien y, aunque más débil,. E2 Figura 3b muestra una placa en la que un error sistemático está presente. Se observa una serie de compuestos con la disminución de los valores de Z-score en las filas A y E a través de varias columnas. Ninguno de los compuestos en estos pozos se dio positivo en la repetición de la prueba. Dado que los pozos con esta disminución de la actividad de prueba DE GRIZLY se colocan a lo largo de la trayectoria del robot de pipeteo toma cuando alícuotas de las placas de la biblioteca, este patrón es indicativo de arrastre de un compuesto positivo durante el proceso de pipeteo automatizado.

La robusta normalización Z-score junto con la presencia de GC conocidos en la biblioteca también nos permitió calcular un receptor de funcionamiento característico (ROC) para la pantalla 18. Figura 3c muestra un gráfico de la estimaciónacoplado verdadera tasa positiva frente a la tasa de falsos positivos estimada para diferentes valores de corte Z-score robustos. La verdadera tasa positiva estimada se define como el porcentaje de verdaderos positivos hits (en este caso, los glucocorticoides conocidos presentes en la biblioteca) que se encuentran en un punto de corte Z-score robusta dado. La tasa de falsos positivos estimada correspondiente indica el porcentaje de compuestos no positivos golpeó en este valor de corte. El AUC de esta curva es 0,95, lo que indica una alta sensibilidad y especificidad de la pantalla y excelente rendimiento del ensayo. La curva AUC también se utilizó para estimar el valor óptimo de corte para la identificación de golpe en el cálculo del índice de Youden para diferentes valores Z robustos. Identificamos la robusta Z-score de 1.49 por tener el más alto índice de Youden. Este valor de corte se indica en la figura 2c 'como una línea de negro que separa los éxitos de la mayor parte de los compuestos.

En nuestra pantalla18, que fueron capaces de identificar los GC casi todas conocidas, presentes en la biblioteca. Sólo tres de los 12 GCs de buena fe, no se detectaron. En el caso del acetato de melengestrol, este fue un hallazgo negativo falso, ya que este compuesto dio positivo en la repetición de la prueba a una concentración más alta que la utilizada en la biblioteca. Los otros dos GCs fueron negativos también en la repetición de la prueba. La corticosterona es el principal GC en roedores, pero no en el pescado o los seres humanos 1, mientras que la prednisona profármaco puede no ser metabolizado así por el sistema de larvas. Curiosamente, también dos medicamentos no anotado como los GC fueron identificados en la pantalla, de las cuales una no se pudo confirmar en el re-test (espironolactona, un antagonista de los receptores de mineralocorticoides). El otro compuesto, pregnenolona, ​​es un precursor en la biosíntesis de esteroides, que se convierte en cortisol por la glándula suprarrenal. De hecho, el tratamiento con pregnenolona estimuló la producción de cortisol en las larvas 18. Todos estos resultados confirman la alta performance del ensayo: sólo un falso negativo y un compuesto de falsos positivos fueron algunos de los resultados de la pantalla principal, y 10 de los 11 compuestos confirmados con actividad estimulante de la señalización de GC ya se identificaron en la pantalla principal.

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Figura 1. Principio general del ensayo y el flujo de trabajo del procedimiento de selección. A) Esquema de la construcción reportera DE GRIZLY ensayo. Luciferasa (amarillo) expresión está controlada por un promotor mínimo (P min, naranja) y cuatro elementos concatemerized GRE ((GRE) 4, blanco), que están obligados por homodímeros GR activados por ligando (GR, azul). Red de cajas indican los sitios de transposasa Tol2 que facilitan la integración de la construcción en el genoma. La caja de color rosa representa un sitio de poliadenilación (pA). Larvas transgénicas portadoras este contextostruct se colocan en placas de 96 pocillos de microtitulación opacos para las mediciones de bioluminiscencia. b) Esquema de la reacción de la luciferasa. La luciferasa cataliza la oxidación de luciferina a oxiluciferina, lo que conduce a la emisión de luz (hv). La reacción requiere también de ATP y Mg 2 +, que es proporcionada por la larva. I PP, pirofosfato. C) Flujo de trabajo de la pantalla. Trabajar diluciones se preparan a partir de acciones aprobado por la FDA biblioteca de fármacos en placas de 96 pocillos, una columna que contiene una negativa dentro de la placa de control (sólo DMSO, verde) y una columna que contiene un control positivo (dexametasona, rojo) (diseño de la biblioteca). GRE: Luc larvas se distribuyen en placas de 96 pocillos (5-11 repeticiones) y se trató con los compuestos de la biblioteca (aplicación de la droga). Rastros de bioluminiscencia se registran con un lector de bioluminiscencia durante dos días (recolección de datos). Rastros de bioluminiscencia se integran (los cálculos de las AUC), log transformados y robusto Z-score normalizaron (normalización). Los datos normalizados se utilizan para determinar las métricas de calidad y para la identificación de golpe (análisis de datos). Éxitos elegidos son reexaminados para la actividad dependiente de la dosis en el ensayo (retest). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

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Figura 2. El análisis de datos se ilustra con los datos de una pantalla de un FDA aprobó biblioteca de medicamentos. a) traza Representante de un pocillo de control positivo. a ') El área bajo la curva (AUC) se aproxima con la regla del trapecio. Los trapecios utilizados para el cálculo se muestran en distintos tonos de rojo b) normal QQ plot de los valores brutos de las AUC de los pocillos de control positivo (eje y) frente a una población (eje x normal estándar) antes de la transformación logarítmica. B '. ) Normal QQ plot de los valores de AUC después de la transformación logarítmica. Una distribución normal se indica mediante la linealidad de los puntos de datos transformados logarítmicamente. C) representación gráfica de log transforma los datos en bruto para todos los compuestos ensayados en la pantalla. Azul, de buena fe los glucocorticoides;. Gris, todos los demás compuestos c ') Parcela de datos de la pantalla después de robusta normalización Z-score. Los errores sistemáticos, tales como las variaciones entre las placas se han eliminado de los datos. Las líneas rojas indican la media ± sem de los controles positivos dentro de la placa. Línea de Negro: valor de corte de identificación golpear según lo determinado por Youden-Índice de optimización (Figura 3). Reproducido con permiso de 14, 2012 de ACS. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

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Figura 3. Resultados de pantalla. a) Mapa de calor de los resultados de la pantalla. Valores de Z-score robustos de compuestos de la biblioteca se trazan en las posiciones respectivas así. Los controles positivos en la columna 12, así como dos compuestos de ataque positivos en pozos F8 y E2 son visibles. B) Mapa de calor de una placa con el traspaso de un compuesto positivo durante la preparación de la biblioteca con un robot de pipeteo. Un gradiente de actividad es visible a lo largo de la trayectoria de pipeteado tomada por el robot. C) características operativas del receptor ROC) curva (para la pantalla. Los verdaderos índices estimados positivos (eje-y de la mano izquierda) y tasas de falsos positivos (eje x) se trazan para aumentar los valores de corte robustos Z-Score (un código de color, la mano derecha del eje Y). El valor de AUC de la curva resultante está cerca de 1, lo que indica un buen rendimiento de ensayo. Reproducido con permiso de 14, 2012 de ACS. D) Tabla que muestra los compuestos activos (yellow) o inactiva (azul) en la pantalla principal (prim.) o en el retest. glucocorticoides Bona fide no siempre fueron reexaminados (blanco). Reproducido con permiso del 14 de 2012 ACS. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

Configuración general:
Paso 1.1
Procedimiento tipo: líquido sola
modo: apagar
dispensa por aspirado: 1
para optimizar la velocidad: Sí
sistema de bolsas de aire: 10 l
transporte: 0
Flush / Wash No
Aspirado Tipo de establecimiento Valor Observaciones
Posición B7, B10, B13, B16
Aspirar vol. 10 l
Velocidad 200 l / seg
Seguimiento Liquid 60%
Aspirar Altura Labware defecto 22.28
Dispensar Tipo de establecimiento Valor Observaciones
Posiciones D7, D10, D13, D16
Dispense vol. 10 l
Velocidad 200 l / seg
Seguimiento Liquid 100 l
Dispense Altura Labware defecto 17.01
Paso 1.2
Procedimiento tipo: reactivo
modo: residuos
dispensa por aspirado: 3
para optimizar la velocidad: Sí
sistema de bolsas de aire: 15 l
transporte: 0
Flush / Wash No
Aspirado Tipo de establecimiento Valor Observaciones
Posición A4
Aspirar vol. 3 x 490 l
Los espacios de aire 15 y 0
Velocidad 200 l / seg
Seguimiento Liquid 400%
Aspirar Altura Superficie del líquido
Dispensar Tipo de s rocedimien Valor Observaciones
Posición D7, D10, D13, D16
Dispense vol. 490 l
Los espacios de aire 15 y 0
Velocidad 200 l / seg
Seguimiento Liquid 100%
Dispense Altura Labware defecto 17.01

Tabla 1. Ajustes para Multiprobe II. El protocolo en la Tabla 1 describe la preparación de 4 platos (cada 96 pozos). Las placas están situadas en adaptadores de placas en el área de trabajo en posiciones especificadas por el robot (por ejemplo, B7, B10, B13, B16).

1 "fo: keep-together.within-page =" always "> Configuración general: Número de repeticiones de ensayo depende de la longitud de la carrera Número de placas ilimitado Control de la temperatura 28 ° C Protocolo Cálculos EE.UU. Lum 96 (cps) leer Tiempo de medición 2.5 seg Corrección Crosstalk Distancia entre la placa y el detector 0 mm Glow (CT2) factor de corrección 0% contenido "> Tabla 2. configuración EnVision utilizados para la pantalla.

Discusión

Presentamos aquí el flujo de trabajo y el análisis de datos para una pantalla de medición de la actividad química GC in vivo utilizando el ensayo DE GRIZLY 18. El ensayo tiene características de control de calidad y medidas de desempeño que son comparables con las pantallas convencionales basados ​​en células, una ventaja importante para su uso en entornos de alto rendimiento. Además, sin embargo, el ensayo in vivo que detecta también compuestos que no son accesibles a las pantallas in vitro. Esto se ejemplifica por la presencia de la pregnenolona prohormona entre los accesos. Por lo tanto, el ensayo DE GRIZLY amplía el ámbito de las pantallas destinadas a la actividad de señalización GC.

La importancia de la detección de efectos in vivo con nuestro ensayo también se ilustra por los resultados que obtuvimos con el DBT contaminantes orgánicos del estaño y OTC 18. DBT, pero no OTC, se ha demostrado que inhibe la señalización de GC en el cultivo de células de mamífero, y se observó la misma en cultivos de células de pez cebra expresarción del GRE: Luc reportero. Es importante destacar sin embargo, en el ensayo de DE GRIZLY, OTC mostró actividad inhibidora sobre la vía GC, ya que se puede convertir a la TDC por el metabolismo de las larvas. Esta inhibición se observó ya en concentraciones de relevancia ambiental de OTC. Estos resultados ilustran adicionalmente el potencial del ensayo DE GRIZLY en la detección de los efectos del compuesto sobre la base de entre órganos de diafonía y metabólicas modificaciones de los compuestos en la animal vivo. También destacan el potencial de aplicación de la prueba DE GRIZLY para el monitoreo ambiental. Por lo tanto, los efectos disruptores endocrinos pueden ser estudiados a nivel de la señalización del receptor, donde el disruptor interfiere con la actividad de señalización de GC inducida por un agonista de GR, tales como dexametasona. Otra posibilidad es estudiar los efectos del compuesto sobre la síntesis de pregnenolona GC-estimulado. La alta calidad de rendimiento del ensayo deberá permitir la detección rápida de librerías de muestras del medio ambiente.

El uso de luciferasa como ARgen iverwood permite un alto rango dinámico de detección de la actividad de señalización 23. De hecho, la sensibilidad del ensayo hace posible la detección de la producción osmótica GC inducida por el estrés de larvas única 18. La alta resolución temporal logrado con el indicador de luciferasa nos permite seguir las actividades de señalización a través del tiempo, lo que hace posible analizar también la cinética de los datos.

Un posible inconveniente para algunas aplicaciones es la idoneidad limitada para la vigilancia espacial de este sistema reportero. Los sistemas indicadores fluorescentes pueden ser más adecuados para ensayos que requieren vigilancia de determinadas áreas de las larvas. Sin embargo, tales ensayos pueden sufrir de sensibilidades inferiores debido a los efectos de fondo causado por la luz de excitación, que también plantea límites a la detección de compuestos fluorescentes. Además, se pueden proporcionar menos resolución cinética debido a la generalmente mayor estabilidad de las proteínas fluorescentes 23.Además, presentan desafíos en términos de equipos de imagen, análisis de datos y de almacenamiento de datos que podrían limitar su uso para los laboratorios de investigación más pequeños.

La puesta a punto del ensayo DE GRIZLY como un ensayo basado en la placa de microtitulación permite una fácil integración en los flujos de trabajo de detección típicos. El ensayo es fácilmente aplicable también en los laboratorios de investigación más pequeños debido a su sencillo manejo y análisis de datos. Al mismo tiempo, permite un grado sustancial de automatización, por ejemplo, automatizado aplicación del fármaco pipeteando los robots o distribución automatizada de embriones por la clasificación de embrión de dispositivos de 24,25. El simple lectura no requiere microscopios automatizados de prueba o un sofisticado software de análisis de imágenes, sin embargo, proporciona un rico conjunto de datos sobre los aspectos temporales y cuantitativos de la vía de señalización estudiadas.

En resumen, se presenta un protocolo paso a paso para un ensayo relativamente barato, robusto y fácil de manejar detección química para GCseñalización actividad in vivo y en tiempo real. El ensayo permite la determinación de los efectos in vivo de los compuestos sobre GC señalización no detectable en el cultivo de células basadas en ensayos. Entre las muchas aplicaciones para el ensayo se encuentran por ejemplo, la determinación de los efectos genéticos sobre la señalización de glucocorticoides, la vigilancia del medio ambiente de los efectos disruptores endocrinos sobre la síntesis de glucocorticoides y la actividad de señalización, y el cribado de compuestos para los efectos no deseados sobre la señalización de GC o de novela en moduladores vivo de este vía de señalización importante.

Divulgaciones

No tenemos nada que revelar.

Agradecimientos

Damos las gracias a S. Burkhart, C. Hofmann y Simone Gräßle por su excelente asistencia técnica y estamos agradecidos a M. Ferg para ayudar con el análisis de datos. También queremos agradecer a S. Rastegar de comentarios críticos sobre el manuscrito. Reconocemos la financiación por el Studienstiftung des deutschen Volkes (a MW), la DFG (DI913/4-1) y los BioInterfaces Programa de Helmholtz en kit.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Composición tampón + reactivos
Sulfóxido de dimetilo (DMSO)Carl Roth GmbH Co KGA994.2
medicamentos aprobada por la FDAEnzo Life SciencesBML-2841-0100
LuciferinaBiosynthL-8220
DexametasonaSigma-AldrichD4902
Metileno BlueSigma-AldrichM9140
E3N/AN/A 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2
Instruments
Multiprobe IIPerkinElmerde 8 canales, equipado con adaptador de punta desechable
Liquidator 96Steinbrenner Laborsystemepipeta manual de 96 canales
EnVision XCite Lector de placas multietiquetaPerkinElmerEquipado con automatización de apilador, control de temperatura, lector de código de barras y detector
Plasticware + consumibles
96-Plato de almacenamiento de pocillosABgeneAB-0765pocillo redondo, 0,8 ml
Películas de cubierta,ratiolab6018412autoadhesivas, resistente a DMSO
Puntas de pipetaSteinbrenner LaborsystemeLRF-200Lpara liquidador 96, 200 μ l, de baja retención
TopSeal-APerkinElmer6005185
OptiPlate-96PerkinElmer6005299blanco opaco de 96 pocillos
Microplaca Etiquetas de código de barrasPerkinElmer1608182
polipropileno filtrado Puntas de pipeta IsoTipCorningS058.4809
Animals
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Referencias

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