La estimulación del nervio infrarrojos ha sido propuesta como una alternativa a la estimulación eléctrica en una gama de tipos de nervios, incluyendo los asociados con el sistema auditivo. Este protocolo describe un método de patch clamp para estudiar el mecanismo de estimulación nerviosa de infrarrojos en un cultivo de neuronas auditivas primarias.
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Artículo de método
Whole Cell Patch Clamp para investigar los mecanismos de la Estimulación Neural infrarrojos
En este artículo
Resumen
Resumen
Se ha demostrado en los últimos años que la luz láser pulsado, infrarrojos puede ser utilizado para provocar respuestas eléctricas en el tejido neural, independiente de cualquier modificación adicional del tejido diana. Estimulación neural de infrarrojos ha sido reportado en una variedad de tejido neural periférica y sensorial in vivo, con particular interés se muestra en la estimulación de las neuronas en el nervio auditivo. Sin embargo, mientras que el INS se ha demostrado que funciona en esta configuración, el mecanismo (o mecanismos) por el cual la luz infrarroja provoca excitación neuronal está actualmente no se entiende bien. El protocolo presentado aquí describe un método de patch clamp de célula completa diseñada para facilitar la investigación de la estimulación neural de infrarrojos en las neuronas auditivas primarias cultivadas. Al caracterizar a fondo la respuesta de estas células a la iluminación láser infrarrojo in vitro bajo condiciones controladas, puede ser posible obtener una mejor comprensión de la Physica fundamentall y procesos bioquímicos subyacentes estimulación neural infrarrojos.
Introducción
Los campos de la neurofisiología y médica biónica dependen en gran medida en las técnicas que permiten la estimulación controlable de respuestas eléctricas en el tejido neural. Mientras que la estimulación eléctrica sigue siendo el estándar de oro en la excitación neuronal, que adolece de una serie de inconvenientes tales como la presencia de artefactos de estimulación cuando se graban las respuestas neurales, y la falta de especificidad de la estimulación debido a la propagación de la corriente en el tejido circundante 1.
Las últimas dos décadas han visto el desarrollo de técnicas de estimulación mediada ópticamente 2.
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Protocolo
1. Cultura de las neuronas del ganglio espiral
- Esterilizar pequeñas y redondas (por ejemplo, 10 mm de diámetro) cubreobjetos de vidrio y pinzas curvas en un autoclave. Transfiera los portaobjetos esterilizados en pocillos individuales de una 4-anillo de 35 mm placa de Petri estéril o placa de 4 pocillos, utilizando las pinzas esterilizadas. Aplicar 150 l de poli-L-ornitina (500 mg / ml) y laminina de ratón (0,01 mg / ml) a la superficie superior del cubreobjetos y colocar en una incubadora (37 ° C) durante un máximo de 48 h. Asegúrese de que los cubreobjetos no flotan lejos de la parte inferior del pozo.
- Preparar ml de medio Neurobasal e....
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Resultados
Las neuronas del ganglio espiral responden a la iluminación con láser de formas de onda en tanto repetible de fijación de voltaje y configuraciones de grabación actual-clamp. Figura 3a muestra los cambios típicos en el flujo de corriente a través de una membrana celular en respuesta a un 2,5 mseg, 0,8 mJ láser de pulso (respuesta promedio de 6 pulsos de láser, que se repite en intervalos de 1 seg) con el potencial de membrana se celebró en -70 mV, -60 mV y -50 mV. Corrientes de entrada netos se evocan c.......
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Discusión
Usando los protocolos descritos en este documento, es posible extraer y cultura neuronas del ganglio espiral y para investigar laser-evocó actividad eléctrica mediante la realización de experimentos de patch clamp de células enteras. Cuando se usa in vitro, la técnica de patch clamp proporciona un nivel de control sobre los parámetros experimentales que no es alcanzable in vivo. Parámetros de estimulación láser, tales como longitud de onda, energía de pulso, duración del pulso, forma del pulso, y las s.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Consejo Australiano de Investigación bajo Vinculación del proyecto de subvención LP120100264.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Materiales y equipos de cultivo celular | |||
| Cubreobjetos de vidrio | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| Placa de cultivo celular de 4 anillos | VWR International | 82050-542 | |
| Solución de poli-L-ornitina | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curvo pinza | WPI | 14101 | Pinzas Dumont #5 (punta de ángulo de 45&grados) |
| CO2 Incubadora | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Mesa 1. Materiales y equipos de cultivo celular. | |||
| Medios neurobasales | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 suplemento | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 suplemento sin suero | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-glutamina | Invitrogen | 25030-149 | |
| potasio | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| D-gluconato de potasio | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Hidróxido de potasio | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Solución extracelular | |||
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Cloruro de potasio | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Cloruro de calcio | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Cloruro de magnesio | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucosa | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hidróxido de sodio | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Tabla 2. Soluciones para cultivo celular y patch clamp. a) Medios neurobasales. b) Solución intracelular. c) Solución extracelular. | |||
| Microscopio vertical | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipado con contraste Dodt |
| Objetivo de inmersión en agua | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Plataforma y platina X-Y | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Cámara de grabación | Warner Instruments | RC-26G | |
| Mesa de aislamiento de vibraciones | TMC | Micro-g 63-532 | |
| Instrumentos de diagnóstico | la cámara CCD | RT1200 | |
| Software de la cámara | Instrumentos de diagnóstico | SPOT | |
| Calentador de solución en línea | Warner | SH-27B | |
| Controlador de temperatura | Warner | TC-324B | |
| Amplificador de pinza de parche | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Pinza de parche sistema de adquisición de datos | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulador | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Vidrio de micropipeta | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Vidrio de borosilicato con filamento |
| Extractor de micropipetas | Sutter Instruments | P2000 | |
| Software de grabación | AxoGraph | Lab pack y herramientas de electrofisiología | |
| Frasco aspirador | Sigma-Aldrich CLS12201L | 1 L Botella aspiradora Pyrex, con salida para tubos | |
| Tubo de PE | Bomba | PolyE #340 | |
| Masterflex | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Equipo de pinza de parche.diodo láser | |||
| 1.870 nm | Optotech | ||
| 200/220 y mu; latiguillo de fibra óptica multimodo de diámetro m (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 Suministro de | luz fibra óptica, núcleo de sílice y revestimiento, 0,22 NA |
| Fibra óptica a través del conector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Cortadora de fibra óptica | EREM | FO1 | |
| Herramienta de pelado de fibra óptica (0,25 - 0,6 mm) | Siemens | fibra óptica | |
| Herramienta de pelado de fibra óptica (0,6 - 1,0 mm) | Siemens | Para quitar el revestimiento exterior del cable de conexión | |
| Generador | de señales Cualquier generador de señales que pueda emitir las formas de pulso necesarias y que pueda ser activado externamente | ||
| Posicionador de fibra óptica Posicionador | hecho a medida. Podría sustituirse con el microposicionador estándar utilizado para experimentos de pinza de parche | ||
| Mandril de fibra óptica | Newport | FPH-DJ | |
| Medidor de potencia láser y cabezal detector | FieldMate coherente | (medidor de potencia) con LM-3 (cabezal detector) | |
| Tabla 4. Equipo láser. |
Referencias
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003(2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical rad....
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Reimpresiones y permisos
