Preparación de la proteína de recombinación Mgm101 por Estrategia de etiquetas MBP basado

Summary

La proteína nucleoide mitocondrial de levadura, Mgm101, es una proteína de recombinación de tipo Rad52 que forma grandes anillos de oligómeros. Un protocolo se describe la preparación Mgm101 recombinante soluble usando la proteína de unión a maltosa (MBP)-etiquetado estrategia junto con intercambio catiónico y cromatografía de exclusión por tamaño.

Abstract

El gen MGM101 se identificó hace 20 años por su papel en el mantenimiento de ADN mitocondrial. Los estudios de varios grupos han sugerido que la proteína Mgm101 está implicado en la reparación de recombinación de ADN mitocondrial. Recientes investigaciones han indicado que Mgm101 se relaciona con la familia de proteínas de recombinación de tipo Rad52. Estas proteínas forman grandes anillos de oligómeros y promueven la hibridación de moléculas de ADN homólogas de cadena sencilla. Sin embargo, la caracterización de Mgm101 se ha visto obstaculizada por la dificultad en la producción de la proteína recombinante. Aquí, se describe un procedimiento fiable para la preparación de Mgm101 recombinante. Proteína de unión a maltosa (MBP)-etiquetados Mgm101 se expresa primero en Escherichia coli. La proteína de fusión se purificó inicialmente por cromatografía de afinidad de amilosa. Después de ser liberado por escisión proteolítica, Mgm101 se separa de MBP por cromatografía de intercambio catiónico. Monodispersada Mgm101 se obtiene despuéspor cromatografía de exclusión por tamaño. Se obtiene un rendimiento de ~ 0,87 mg de Mgm101 por litro de cultivo bacteriano puede ser obtenido de forma rutinaria. El Mgm101 recombinante tiene un mínimo de contaminación de ADN. Las muestras preparadas se utilizan con éxito para el análisis de imágenes de partículas bioquímicas, estructurales e individuales de Mgm101. Este protocolo también se puede usar para la preparación de otras proteínas de unión al ADN oligoméricas grandes que pueden ser mal plegadas y tóxico para las células bacterianas.

Introduction

La recombinación homóloga es importante para la reparación de doble filamento se rompe (DSBs) y enlaces cruzados, y para la reiniciación de la replicación del ADN a partir de horquillas de replicación se derrumbó ^1. En la recombinación homóloga convencional, el centro de reacción es catalizada por las recombinasas dependientes de ATP incluyendo RecA en procariotas, y Rad51 y Dmc1 en eucariotas ^1-3. Estas recombinaciones forman nucleoprotein filamentos en ssDNA, que son esenciales para iniciar la búsqueda de homología y el capítulo invasión dentro de moldes de ADN dúplex (Figura 1, panel izquierdo) ^4-7. Además del esqu....

Protocol

Estudios previos han demostrado que los primeros amino-terminal de 22 residuos de Mgm101 se escinden después de la importación en mitocondrias ^19. Para la expresión en Escherichia coli, el marco de lectura abierto MGM101 carece de los primeros 22 codones se amplifica por PCR y se coloca aguas abajo de la secuencia de malE que codifica la proteína de unión a maltosa (MBP) en una versión modificada del vector de expresión pMAL-c2E. Esto genera la fusión MBP-Mgm101 con un enlazador que contiene un sitio de escisión para la proteasa PreScission (Figura 3). El plásmido se construyó por primera vez por la selección de ....

Results

Mgm101 es una proteína Rad52 recombinación relacionada en la mitocondria. Rad52 ha sido ampliamente estudiado por su papel en la recombinación del ADN mitocondrial (Figura 1). Mgm101 recombinante se puede preparar mediante un procedimiento de tres pasos (Figura 2). Esto se ve facilitado por el uso de la estrategia de MBP-etiquetado que permite Mgm101 a ser expresado en una forma soluble y posteriormente liberado de la etiqueta mediante escisión proteolítica (Figura 3). .......

Discussion

Ha sido un reto para producir una proteína estable, nativo recombinante Mgm101 de E. coli posiblemente debido a su insolubilidad en células bacterianas. En este informe, muestran que la estrategia de fusión MBP permite que la proteína que se expresa en un nivel razonablemente alto. Mediante el uso de tinción negativa microscopía electrónica de transmisión y cromatografía de exclusión por tamaño, hemos demostrado previamente que la proteína de fusión MBP forma oligómeros uniformes in vitro ^18.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vector de expresión pMAL-c2E	New England Biolabs	#N8066S
PreScission Proteasa	GE Healthcare Life Sciences	#27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL	cells Strategene	#230245
Leupeptina	Roche Ciencia Aplicada	#11034626001
Pepstatina	Roche Ciencia Aplicada	#11359053001
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)	Roche Applied Science	#10837091001
DNAse I	Sigma	#DN25-1G
Isopropyl β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)	Roche Applied Science	#11411446001
Resina de amilosa	New England Biolabs	#E8021L
Columna de cromatografía Econo-Column	BIO-RAD	#7372512
Cartucho Bio-Scale Mini Macro-Prep High S (1 ml)	BIO-RAD	#732-4130
VIVASPIN 15R Columna de centrifugación de ultrafiltración (10.000 MWCO)	Sartorius Stedium	#VS15RH02
Superose 6 columna de grado de preparación	Amersham Bioscirnces	#17-0489-01
VIVASPIN 6 Columna de centrifugación de ultrafiltración (5.000 MWCO)	Sartorius Stedium