La transducción adenoviral de células T CD4 + naïve a estudiar la diferenciación Treg

Resumen

Adenoviral la transferencia génica en células T con la expresión transgénica del receptor de adenovirus Coxsackie ingenuo CD4 permite el análisis molecular de la diferenciación de células T reguladoras In vitro.

Resumen

Las células T reguladoras (Treg) son esenciales para proporcionar la tolerancia inmune a auto, así como a ciertos antígenos extraños. Tregs puede ser generada a partir ingenuas CD4 en las células T in vitro con TCR-y co-estimulación en presencia de TGF y la IL-2. Esto tiene un enorme potencial para las terapias futuras, sin embargo, las moléculas y vías de señalización que la diferenciación de control son en gran parte desconocidos.

Las células T primarias se pueden manipular a través de la expresión del gen ectópico, pero los métodos comunes no atacan el estado ingenua más importante de la célula T antes del reconocimiento al antígeno primario. Aquí, ofrecemos un protocolo para expresar genes ectópicos de células T naive CD4 in vitro antes de inducir la diferenciación de Treg. Se aplica la transducción con el adenovirus de replicación deficiente y explica su generación y producción. El adenovirus puede tardar hasta grandes inserciones (hasta 7 kb) y se puede equipar con los promotores para lograr una alta y transitorios Sobreexpresión en las células T. Se transduce eficazmente las células T de ratones ingenuos si expresan un receptor de adenovirus Coxsackie transgénico (CAR). Es importante destacar que, después de la infección las células T permanecen ingenua (CD44 ^bajo, CD62L ^alta) y en reposo (CD25 ^-, CD69 ^-) y se pueden activar y diferenciarse en células T reguladoras similares a las células no infectadas. Por lo tanto, este método permite la manipulación de la diferenciación de células T CD4 desde sus inicios. Se asegura de que la expresión del gen ectópico ya está en su lugar cuando los eventos de señalización temprana de la estimulación inicial TCR induce cambios celulares que finalmente conducen a la diferenciación de Treg.

Introducción

Tregs son cruciales para mantener la tolerancia inmunológica y para amortiguar la respuesta inmune rebasamiento. Treg suprimen la activación de células T espectador. En consecuencia, la ablación de células T reguladoras conduce a la autoinmunidad fatal y la autodestrucción impulsado por las células T activadas ^1. Desarrollar células T reguladoras en el timo durante la selección negativa de células CD4-positivas precursores sola, pero también puede diferenciar en la periferia de las células T naive CD4 tras la estimulación de antígeno con dosis baja subóptima ^1,2 co-estimulación. Tímico células T reguladoras parece suprimir la autoinmunidad tejid....

Protocolo

1. La clonación de un gen de interés en un vector de entrada

1. Clonar el gen de interés en un vector de entrada. Amplificación por PCR del gen seguido por ligación de extremos romos en un vector de la topoisomerasa-acoplado (por ejemplo pENTR / D-TOPO) o la enzima de restricción mediada por clonación puede ser usada para este procedimiento.

2. Transferencia del gen de interés en la pCAGAdDu Destino vectorial

1. La transferencia del gen de interés a partir del vector de entrada en el vector de destino por LR recombinación (por ejemplo, puerta de enlace LR Clonase II mezcla de enzimas). Esto creará e....

Resultados

Producción Virus

Para la generación de altos títulos de virus, el tiempo de cosecha de células HEK293A en la producción de virus primario o amplificación del virus es crucial. Representativos imágenes de contraste de fase fluorescentes y con signos visuales de la producción de virus se muestran en la Figura 3. El CPE se observaron 10 días después de la transfección de células HEK293A con pCAGAdDu vector de control sin inserto. CPE se caracteriza por la aparición de áreas con cé.......

Discusión

Virus Generación y Titulación

Para obtener resultados óptimos de transfección, la calidad y la cantidad de vector linealizado parecen más importantes. No se observaron efectos negativos en la producción primaria de lisado de un crecimiento excesivo inicial del cultivo ya que la infección se procederá rápidamente una vez que se produce la producción de virus eficiente. Sin embargo, la producción de virus por las células HEK293A puede verse afectado por las inserciones largas que disminuyen la ef.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de clonación pENTR/D-TOPO	Invitrogen	K240020
Gateway LR Clonasa II Mezcla de enzimas	Invitrogen	11791020
PacI	New England Biolabs	R057S
jetPEI	Polyplus-transfection	101-10N
HEK293A línea celular	Invitrogen	R705-07
A549	ATCC	CCL-185
Placas de 6 pocillos	BD Falcon	353046
placa de cultivo de tejidos de 14 cm	Nunc 168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ 1)1Jdgr	Taconic Farms	Modelo Nr. 4285
Kit de aislamiento de células T CD4+ ingenuas II	Miltenyi Biotech	130-094-131
DMEM	Invitrogen	41966-052
FBS	PAN Biotech	1502-P110704
PenStrep	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
NaPyruvate	Lonza	BE13-115E
NEAA 100x	Lonza	BE13-114E
L-Glutamine	Invitrogen	25030
HEPES Solución tampón (1 M)	Invitrogen	15630-056
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-7522
MEM Mezcla de vitaminas esenciales (100x)	Lonza	13-607C
Dynabeads Ratón T-Activador CD3/CD28 para la Expansión y Activación Celular	Invitrogen	114-56D
Recombinante Humano TGF-beta 1	R& D Systems	240B
Proleukin S (18 x 106IE)	Novartis
LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas azules fijables	Invitrogen	L-23105
Ratón BD Fc BlockT	BD Pharmingen	553141
Anti-Ratón/Rata Foxp3 PE	eBioscience	12-5773-82
Mmu-miR-155 Ensayo de microARN TaqMan	Roche Applied Biosystems
LightCycler 480 Probes Master	Roche Applied Biosystems	04902343001
TaqMan Kit de transcripción inversa de microARN	Applied Biosystems	4366596

4427975 Roche