Se describe aquí un método bioquímico exacta, reproducible y conveniente para la titulación de glucógeno in vitro. Esta técnica utiliza el kit de ensayo de Abcam glucógeno y se basa en la hidrólisis sucesivas de glucógeno en glucosa y la glucosa titulación por fluorescencia.
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Titulación bioquímica de glucógeno
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Resumen
Resumen
El glucógeno es la principal de polímero energético de la glucosa en animales vertebrados y juega un papel crucial en el metabolismo de todo el cuerpo, así como en el metabolismo celular. Ya existen muchos métodos para detectar glucógeno pero sólo unos pocos son cuantitativos. Se describe aquí un método que utiliza el kit de ensayo de Abcam glucógeno, que se basa en la degradación específica de glucógeno en glucosa por glucoamilasa. La glucosa se oxida específicamente a un producto que reacciona con la sonda OxiRed para producir fluorescencia. La titulación es preciso, sensible y se puede lograr en extractos de células o secciones de tejido. Sin embargo, en contraste con otras técnicas, no da información sobre la distribución de glucógeno en la célula. Como ejemplo de esta técnica, como se describe aquí la titulación de glucógeno en dos líneas celulares, chino CCL39 fibroblastos de pulmón de hámster y LS174 carcinoma de colon humano, se incubaron en normoxia (21% de O 2) frente a la hipoxia (1% de O 2). La hipótesis de que la hipoxia es un signal que prepara las células para sintetizar y almacenar glucógeno para sobrevivir 1.
Introducción
El glucógeno es un polímero multibranched de residuos de glucosa, que está presente en el citoplasma de muchos tipos de células. Es una de las principales formas de almacenamiento de energía en las células y juega un papel importante en el metabolismo de la glucosa. La mayoría de las células de mamífero son capaces de producir y glucógeno tienda, que puede ser degradado rápidamente en glucosa para promover la glicolisis y la producción de ATP durante el estrés metabólico. Los hepatocitos producen cantidades masivas de glucógeno para regular el nivel de azúcar en la sangre proporcionando con ello un suministro continuo de glucosa para el cuerpo. En contraste, la concentración de glucógeno en otras células (músculos, células rojas de la sangre, etc) es relativamente bajo. Sin embargo, a nivel local, estas cantidades son suficientes para proporcionar energía a corto plazo, cuando las células están expuestas súbitamente a un entorno privado de nutrientes.
La síntesis de glucógeno y la degradación del glucógeno sigue los mismos pasos en todos los tejidos (Figura 1). En primer lugar, la glucosaentra en las células por transportadores de glucosa (GLUT), y se convierte rápidamente a partir de glucosa-6-fosfato (G6P) en glucosa-1-fosfato (G1P) por fosfoglucomutasa. G1P se modifica luego en UDP-glucosa, y el carbono C1 de UDP-glucosa se une a un residuo de tirosina de glucogenina, la proteína de anclaje de glucógeno. Esta molécula, considerado un cebador de glucógeno, se extiende por la unión de la UDP-glucosa a la glucosa terminal por un α (1 → 4) unión a través de la glucógeno sintasa. Finalmente, cuando se forma una cadena lineal de más de 11 residuos de glucosa, la enzima de ramificación transfiere un oligosacárido terminal de constituido por un mínimo de 6 residuos de glucosa a otro de glucosa de la cadena cerca a través de una α (1 → 6) de ligamiento. La repetición de este proceso da una estructura fractal masiva que contiene ramas que forman una hélice con 6,5 glucosa por turno. El glucógeno puede ser inversamente hidrolizada a glucosa por la acción concertadadesramificante de enzimas que hidrolizan la α (1 → 6) unido y la glucógeno fosforilasa que hidroliza la α (1 → 4) glicosídico límite entre el último residuo de glucosa de una rama y la molécula de glucógeno. Esta reacción llamada glucogenolisis se activa mediante el aumento de los niveles de AMP (que refleja el consumo de ATP), y se inhibe por la glucosa y ATP 2,3.
Por microscopía electrónica, las moléculas de glucógeno se han descrito en muchos tipos de células como partículas β libres (o monopartículas glucógeno) de 15-30 nm de diámetro. En determinados tipos de células tales como hepatocitos, partículas β pueden ser ensamblados en un complejo para formar rosetas, también conocidos como partículas α que varían en diámetro desde 80 nm a un máximo de 200 nm 4 . La forma en que estas partículas β se unen para formar grupos más grandes de partículas α todavía no está completamente aclarada. Alguna evidencia tiende a demostrar que las partículas β pueden estar unidos por enlace covalente 5, enlace de hidrógeno, o incluso a través de interacciones proteína-proteína 6. La cantidad de glucógeno almacenado en las células depende de muchos parámetros: (I) la cantidad de glucogenina en la célula que inicia la síntesis de glucógeno, (ii) la actividad de la sintasa de glucógeno fosforilasa y regulada por la fosforilación de proteínas / desfosforilación; (III) la concentración de la glucosa en las células, que depende de varios parámetros, tales como el suministro de glucosa a partir del sistema vascular y la captación de glucosa por las células. Las reservas de glucógeno son estrictamente regulados por la regulación alostérica de hormonas biosintéticas través de metabolitos intermedios, por las hormonas que regulan el metabolismo de la energía, y por vías de señalización de detección de nutrientes 7.
Es importante estarcapaces de cuantificar glucógeno en muestras biológicas para entender mejor la importancia del metabolismo del glucógeno en todo el cuerpo y nivel celular. Se describe aquí un bioquímica precisa, reproducible y conveniente en el ensayo in vitro de glucógeno. Esta técnica se basa en la fluorescencia de la glucosa cuantificación antes y después de la hidrólisis específica de glucógeno.
Existen otros métodos para estimar el nivel de glucógeno en las células, pero la mayoría de ellos no son cuantitativos. Una de las primeras técnicas descritas para la cuantificación de glucógeno en las células se basó en la medición de la incorporación de [14 C]-glucosa en glucógeno 8,9. El uso de radiactividad que hace que este proceso sea más difícil de manejar, pero tiene la ventaja de proporcionar la tasa de incorporación de glucosa en glucógeno y en la distinción entre la distribución de los residuos de glucosa en las ramas exteriores y en el núcleo de la molécula (que también requiere una β-amyloly adicionalsis y un paso cromatográfico). Otra técnica fue desarrollada más recientemente y se basa en la incorporación de 2-NBDG (2 - {N-[7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol-4-il] amino}-2-desoxiglucosa), una derivado fluorescente 2-desoxiglucosa, en glucógeno 10. La intensidad de fluorescencia medida refleja la cantidad de glucógeno producido y se puede medir con un lector de fluorescencia. Distribución de la fluorescencia en la célula también puede ser evaluada por microscopía confocal.
Entre las otras técnicas no cuantitativas, la tinción de ácido periódico de Schiff (PAS) es quizás el más común. Se puede utilizar para la detección de glucógeno en células fijadas, secciones de tejido en parafina o congelado. Este histológicos colores técnica no específicamente polisacáridos, glicolípidos, glicoproteínas, celulosa y mucinas neutras, de color morado. La especificidad de esta prueba se puede aumentar mediante el tratamiento de células o secciones de tejido fijadas con diastasa, que digiere específicamente glucógeno. A partir de entonces,el nivel de glucógeno puede estimarse cualitativamente comparando muestras no hidrolizadas (todos macromoléculas carbohidrato modificado) a las muestras hidrolizadas (carbohidratos macromoléculas modificado excepto glucógeno). La tinción de PAS y el análisis microscópico, a diferencia de los ensayos bioquímicos de glucógeno, proporciona información relativa a la distribución de glucógeno en la célula, que puede ser difusa o concentrada en una cierta parte de la célula. Sin embargo, a pesar de que las estimaciones de tinción PAS diferencias en la acumulación de glucógeno entre diferentes condiciones, no es cuantitativo 11.
Un anticuerpo monoclonal de ratón originalmente hizo usando el cartílago condilar mandibular como el antígeno se ha demostrado que reaccionar con glucógeno en las células y con glucógeno purificada in vitro 12. Como este anticuerpo reconoce específicamente las cadenas de azúcar relacionadas glucógeno-, es una herramienta útil para la detección de glucógeno por inmunohistoquímica en una manera más específica que la tinción de PAS.
La microscopía electrónica es otra técnica que permite la visualización de los granos de glucógeno en las células y la evaluación del grado de almacenamiento de glucógeno. De hecho, las partículas β de glucógeno son fácilmente reconocibles con una microscopía electrónica como gránulos electrón densos 1.
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Protocolo
Titulación bioquímica de glucógeno
1. La lisis celular
- Se siembran las células a una concentración de 0,5 a 2 x 10 6 por placa de 100 mm de diámetro.
- Tratamiento: incubar las células 24, 48, o 72 horas en baja concentración de oxígeno (hipoxia) en una estación de trabajo anaeróbico Bug-Box (Ruskinn Tecnología Biotrace International Plc, Bridgend, Reino Unido), fijado en el 1% o el 0,1% de O 2, 94% o 94,9% de N 2, y 5% de CO 2. En paralelo, se incuban las células en normoxia (21% de O 2, 5% de CO 2). Cambio de medio (medio que contiene glucosa-25 mM) cada 24 h para minimizar las variaciones en la concentración de glucosa durante el tiempo de experimento.
- Después del tratamiento, las células de lavado 2 veces con PBS para eliminar las trazas de glucosa a partir de medio de cultivo. Raspar las células en PBS frío.
- Centrifugar la solución a 1.000 rpm durante 5 min, descartar el sobrenadante y lavar el sedimento una vez con PBS. El pellet puede congelarse a -20 ° C antes de continuar.
- Resuspender el sedimento en 100 l de agua destilada. Añadir 100 l de la hidrólisis del glucógeno Buffer se proporcionan con el kit de ensayo de glucógeno (Abcam). Hervir el lisado a 95 ° C durante 5 minutos para inactivar las enzimas.
- Vórtice y se centrifuga el lisado a 13.000 rpm durante 10 min para eliminar los productos insolubles. Mantenga el sobrenadante.
- Para normalizar los niveles de glucógeno para el contenido de proteínas entre muestras, la cuantificación de proteínas se puede hacer con 25-35 l del sobrenadante usando el ensayo del ácido bicinconínico (BCA-Interchim).
Algunos de la lisado se puede utilizar para medir la concentración de glucosa libre en el interior de las células.
2. La hidrólisis del glucógeno
- Mezclar 50 l del sobrenadante (etapa 1) con 1 l de la hidrólisis enzimática de la mezcla. Esta mezcla contiene glucoamilasa. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
- Preparar la curva de calibración por dilución de la glucógeno estándar (2 mg / ml) supplied con el kit a una solución de 10 g / ml en el tampón de hidrólisis. A continuación, preparar seis tubos separados con 0, 4, 8, 12, 16, y 20 l de 10 mg estándar / ml y ajustar cada tubo a un volumen final de 50 l con tampón de hidrólisis para dar una concentración de glucógeno de 0, 0,04 , 0,08, 0,12, 0,16, y 0,2 g / ml. Añadir 1 l de hidrólisis enzimática de la mezcla en los estándares y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente.
El fondo de la concentración de glucosa de la línea celular, dada por el valor de la concentración de glucosa libre, se debe restar del valor de la concentración total de glucosa (glucosa a partir de la hidrólisis del glucógeno + sin glucosa) para determinar el nivel de glucógeno en la célula.
3. Desarrollo y lectura de fluorescencia
- Para cada condición, (tubo 1) preparar un tubo para medir la concentración de glucosa libre y dos tubos (tubos 2 y 3) para medir la concentración total de glucosa (cada ingenio tuboja diferente volumen de glucógeno hidrolizada).
- Añadir 15 l de sobrenadante extraídas al final de la etapa 1 en el tubo 1. Añadir 35 l de tampón de hidrólisis para completar hasta un volumen final de 50 l. Fluorescencia obtenida dará la concentración de glucosa libre.
- Añadir X l de glucógeno hidrolizado (obtenido en el paso 2) en el tubo 2. Ajustar a un volumen final de 50 l. Volumen de la muestra (X l) tiene que ser ajustado de acuerdo con la densidad celular y / o tipo de célula con el fin de obtener los valores de fluorescencia que no están más allá de las concentraciones de la curva de calibración.
- Añadir 2 X l de glucógeno hidrolizada en el tubo 3. Ajustar a un volumen final de 50 l.
- Preparar una solución de desarrollo para las muestras y los estándares mediante la mezcla para cada tubo 48,7 l de Buffer Desarrollo, 1 l de Enzyme Development Mix y 0,3 l de OxiRed Probe (suministrado en el kit de ensayo de glucógeno). Por ejemplo, para 2 condiciones, preparar una mezcla de 12 tubos (6 de las normas, 2 de glucosa libre y 4 para la fluorescencia total de glucosa).
- Añadir 50 l de esta mezcla a cada tubo y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Medir la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 535 nm, una longitud de onda de emisión de 587 nm como se recomienda, y una ranura de 3 nm para excitación y emisión.
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Resultados
Un nivel bajo de oxígeno (hipoxia) en señales de tumores a las células tumorales la necesidad de almacenar energía para manejar agotamiento de los nutrientes posterior, a fin de sobrevivir. Como glucógeno es la principal polímero energético de la glucosa en las células de mamíferos, se estudió la regulación del almacenamiento de glucógeno en la hipoxia. El cálculo y la normalización de la concentración de glucógeno en los lisados celulares se deben realizar en los datos en bruto de la fluorescencia como se muestra en ...
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Discusión
Valoración bioquímica de la glucógeno in vitro permite una cuantificación precisa de las células el contenido de glucógeno. En comparación con algunas otras técnicas (PAS, de inmunofluorescencia con un anticuerpo glucógeno, etc.), Esta valoración es muy específico, sensible y reproducible. Por otra parte, el método es conveniente ya que no requiere la radiactividad pero un espectrómetro de fluorescencia. Sin embargo, esta técnica es puramente cuantitativa y no proporciona información sobre la distribuc...
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Estamos muy agradecidos con el Dr. Thierry Pourcher para permitirnos usar el espectrómetro de fluorescencia y por su ayuda. El laboratorio está financiado por la Ligue Nationale Contre le Cancer (labellisée équipe), la Association pour la Recherche contre le Cáncer, el Instituto Nacional del Cáncer du (INCA), la Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (programa de la UE FP7), el Centro A. Lacassagne, el Centre National de la Recherche Scientifique, el Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale y la Universidad de Niza ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Damos las gracias a la Dra. M Christiane Brahimi-Horn para la lectura crítica y la corrección editorial.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| REACTIVOS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Kit de ensayo de glucógeno | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Fluorescence Spectrómetro | PerkinElmer | LS 50B |
Referencias
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).
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Reimpresiones y permisos
