Microdisección de captura por láser de neuronas a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas en cultivo

Summary

Células neuroprogenitoras Humanos (CPN) se ampliaron en condiciones proliferantes. NPC se diferenciaron en cultivos de neuronas-rica en la presencia de una combinación de neurotrofinas. Marcadores neuronales se detectaron por tinción de inmunofluorescencia. Para aislar una población pura de las neuronas, NPCs se diferenciaron en láminas de membrana PEN y se realizó con láser captura microdissection.

Abstract

Células neuroprogenitoras (NPC) aislados a partir de cerebro fetal humano se ampliaron en condiciones proliferativas en presencia de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) para proporcionar un suministro abundante de células. NPC fueron diferenciadas en la presencia de una nueva combinación de factor de crecimiento nervioso (NGF), derivado del cerebro factor neurotrófico (BDNF), dbAMPc (DBC) y ácido retinoico en platos recubiertos con poli-L-lisina y laminina de ratón para obtener neurona ricas culturas. NPC también se diferenciaron en ausencia de las neurotrofinas, DBC y ácido retinoico y en presencia de factor neurotrófico ciliar (CNTF) para producir cultivos de astrocitos-rica. NPC diferenciadas se caracterizan por la tinción de inmunofluorescencia para un panel de marcadores neuronales incluyendo NeuN, sinapsina, la acetilcolinesterasa, sinaptofisina y GAP43. Proteína glial fibrilar ácida (GFAP) y STAT3, marcadores de astrocitos, se detectaron en el 10-15% de los NPCs diferenciadas. Para facilitartipo de célula caracterización molecular específica, se realizó la captura de microdisección láser para aislar las neuronas cultivadas en polietilennaftalato (PEN) se desliza de membrana. Los métodos descritos en este estudio proporcionan valiosas herramientas para avanzar en nuestra comprensión de los mecanismos moleculares de la neurodegeneración.

Introduction

Neurogénesis largo de la vida se sabe que se producen en la zona subventricular de los ventrículos laterales y en la capa de subgranular del giro dentado del cerebro adulto de mamíferos ^1. Células neuroprogenitoras (NPCs) que se originan en estas regiones son células pluripotentes que pueden diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos ^2. NPC han generado interés debido a su potencial para ser trasplantadas en pacientes con diversos trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, accidente cerebrovascular y enfermedad de Alzheimer (EA) ^3. Los estudios con NPCs han centra....

Protocol

1. La expansión de los NPCs Humanos (Figura 1)

1. Revive la madre congelada de NPCs humanos de cerebro fetal (Lonza, Walkersville, MD, EE.UU.) y el cultivo en suspensión en matraces T-75 como neuroesferas (Figura 1A) en medio neurobasal contienen suplementos proliferación, EGF (10 ng / ml) y FGF (10 ng / ml).
2. Después de 3 días en cultivo, transferir las neuroesferas a un tubo de 15 ml y centrifugar a 500 rpm durante 5 min.
3. Descartar el sobrenadante dejando tras de ~ 100 l medio por encima de la pastilla de células y transferir a un tubo Eppendorf. Un pelet de 100 l de células es suficiente para dividir en ....

Results

Expansión de NPCs (Figura 1)

Cuando neuroesferas se descomponen a una única suspensión de células por trituración, la punta de la pipeta tiene que tocar la parte inferior del tubo de modo que haya algo de resistencia cuando la suspensión se pipetea arriba y abajo. El número de veces de la trituración varía entre los individuos y debe ser decidido por ensayo y error mediante el examen de la suspensión celular resultante con un microscopio. Es crítico para proporcionar suficiente.......

Discussion

Se describe en este estudio un modelo de cultivo celular de la neurona-rica por la diferenciación de las células neuroprogenitoras humanos auto-renovación y un método para aislar una población pura de las neuronas mediante láser captura microdissection. Hemos utilizado una combinación de NGF, BDNF, DBC y el ácido retinoico para la diferenciación neuronal de NPCs. DBC se utiliza para activar CREB, un factor de transcripción que mejora la neurogénesis ^12. El ácido retinoico induce la salida del ciclo celular y .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Células neuroprogenitoras (NPCs)	Lonza	PT-2599
Neurocult NS-A medio basal humano	Tecnología de células madre	5750
Neurocult NS-A Suplemento de proliferación	Tecnología de células madre	5753
Neurocult NS-A Suplemento de diferenciación	Tecnología de células madre	5754
B-27 Suplemento (50x)	Invitrogen	17504-044
Factor de crecimiento epidérmico humano	Tecnología de células madre	2633
Factor de crecimiento de fibroblastos	Sigma	F0291
Factor neurotrófico derivado del cerebro	Señalización celular	3897S
Factor de crecimiento nervioso	Invitrogen	13257-019
Dibutiril cíclico AMP	Sigma	D-0627
poli-L-lisina	Sigma	P-5899
Laminina de ratón	Sigma	L-2020
Ácido retinoico	Sigma	R-2625
Anticuerpo STAT3	Señalización celular	9132
Anticuerpo GFAP	Señalización celular	3670
Anticuerpo GAP43	Laboratorios de transducción	612262
Anticuerpo BDNF	Millipore	AB1534SP
Anticuerpo acetilcolinesterasa	Santz cruz	Sc-11409
Anticuerpo sinaptofisina	Abcam	ab18008-50
Anticuerpo NeuN	Chemicon	MAB377
Anticuerpo sinapsina	Novus	NB300-104
Anti ratón FITC	Jackson Immuno	115-095-146
	Laboratorios
Anti Conejo Cy3	Jackson Immuno	711-165-152
	Laboratorios de Investigación
BSA	Sigma	A1653
Triton-X 100	Acros	21568-2500
Paraformaldehye	Fisher	4042
Cubreobjetos (cubreobjetos circulares grandes)	Fisherbrand	12-545-102
Medio de montaje (Prolong Gold)	Invitrogen	P36930
	Biosystems aplicados	LCM0521
Kit de tinción de sección congelada Histogene LCM	Biosystems aplicados KIT0401
RiboAmp Kit de amplificación de ARN	Biosystems aplicados	KIT0201
Kit de aislamiento de ARN Picopure	Biosistemas aplicados	KIT0202
CapsureMacro Tapas LCM	Biosistemas aplicados	LCM0211