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Optogenética perturbación de la actividad neuronal con la iluminación láser en semi-intacta

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DOI:

10.3791/50513

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4 de julio de 2013

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1Department of Complexity Science and Engineering, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2Department of Physics, Graduate School of Science, The University of Tokyo

En este artículo

Resumen

Aquí se describe un protocolo para la manipulación optogenética de la actividad motoneuronal mientras monitoriza los cambios en la salida del motor (contracción muscular) en semi-intacta Drosophila Larvas de uso de láser dentro de un microscopio confocal convencional. Esta técnica permite a los investigadores para lograr perturbación local de la actividad neuronal en algunas neuromeres para dilucidar la dinámica de circuitos de motor.

Resumen

Larvas de Drosophila locomoción es un sistema modelo espléndida en desarrollo y fisiológicos neurociencia, en virtud de la accesibilidad genética de los componentes neuronales subyacentes en los circuitos de 1-6. Aplicación de la optogenética 7,8 en el circuito neural larval nos permite manipular la actividad neuronal de manera estampadas espacial y temporalmente 9-13. Típicamente, las muestras son ampliamente iluminadas con una lámpara de mercurio o LED, por lo que la especificidad de las neuronas diana es controlado por binarios sistemas de expresión de genes tales como el sistema Gal4-UAS 14,15. En este trabajo, para mejorar la resolución espacial de "resolución sub-genética", que localmente iluminados un subconjunto de neuronas en el cordón nervioso ventral utilizando láseres implementados en un microscopio confocal convencional. Mientras controla el movimiento de la pared del cuerpo de las larvas semi-intacta, que forma interactiva activada o inhibe la actividad neuronal con canalrodopsina 16,17 Or halorhodopsina 18-20, respectivamente. Por iluminación espacialmente y temporalmente restringida del tejido neural, podemos manipular la actividad de las neuronas específicas en el circuito en una fase específica de la conducta. Este método es útil para el estudio de la relación entre las actividades de un conjunto neuronal local en el cordón nervioso ventral y el patrón espacio-temporal de la salida del motor.

Introducción

Locomoción Delantero peristáltica en larvas de Drosophila se produce por la propagación de la contracción muscular de posterior a segmentos anteriores. Este movimiento se realiza por la activación secuencial de las neuronas motoras en el cordón nervioso ventral a lo largo del eje del cuerpo longitudinal. Para examinar el circuito detrás de esta actividad de propagación modelado, perturbaciones locales de la actividad neuronal podría ser un enfoque informativo. A pesar de ensayo farmacológico puede controlar sustancia específica, tales como neurotransmisores, en el tejido neural, el efecto de los fármacos farmacológicos puede ser similar entre los segmentos casi todos debido a que el cordón nervioso ventral larvas es estructura repetitiva compuesto de neuromeres similares a lo largo del eje longitudinal. Alternativamente, se podría expresar optogenético o moléculas de la sonda sensibles a la temperatura en un pequeño número de segmentos. Sin embargo, tales GAL4 líneas específicas son muy difíciles de generar. Aquí presentamos un método para manipular las neuronas en pocos segmentos utilizando iluminación láser. Tomando ventaja de la iluminación espacialmente confinados en microscopía confocal, se puede perturbar la actividad de las neuronas en un área local. Combinado con el patrón de expresión de la sonda por subconjuntos de GAL4 líneas específicos de neuronas, este método de iluminación con láser mejora en gran medida la resolución espacial de la perturbación. Y debido a que este método sólo requiere de un microscopio confocal convencional, la compra de equipo de laboratorio adicional no suele ser necesario.

Usando esta técnica, se examinó el papel de la actividad neuronal del motor durante la propagación de la salida del motor 13. Mediante el bloqueo de la actividad de las neuronas motoras en algunos segmentos durante el movimiento peristáltico, hemos podido comprobar si es necesaria la actividad de las propias neuronas motoras para la propagación de la señal de salida del motor. Bloqueo local y transitoria de las neuronas motoras detenido la propagación del movimiento peristáltico. Después de retirar el bloqueo, propagation apareció en el segmento en el que la ola había sido detenido. Este fenómeno sugiere que sin la activación de las neuronas motoras, la onda de propagación no puede progresar a lo largo del cordón nervioso ventral más lejos, y por lo tanto es necesario para el movimiento peristáltico de la activación de las neuronas motoras. Hemos informado anteriormente de datos detallados y debates sobre este fenómeno en Inada et al. (2011) 13. Aquí, se describe el método para perturbar la actividad neuronal interactiva mientras se monitoriza el movimiento de las larvas diseccionado. Usando varias líneas GAL4 y series de patrones espacio-temporales para la manipulación de la actividad, se puede investigar la lógica de circuitos a través de las propiedades de respuesta de perturbación del circuito del motor.

Protocolo

1. Preparación larvas

  1. Mantener volar líneas de OK6-Gal4, UAS-ChR2 o OK6-Gal4, UAS-NpHR2 en frascos de plástico que contienen los alimentos marcha estándar.
  2. Levadura Spread pasta que contiene todo-trans retinal (ATR) en concentraciones adecuadas (1 mM de ChR2, 10 mM de NpHR2 ("NpHR" para abreviar) en una placa de agar jugo de manzana.
  3. Recoge 2 ª o 3 ª instar larvas de los viales y los puso en el plato ATR que contiene.
  4. Criarlos a 25 ° C en la oscuridad durante un período adecuado de tiempo (1 día para ChR2, 2 días para NpHR.)

2. Configuración Microscopio

  1. Conecte una cámara CCD (XCD-V60, Sony) a un microscopio confocal convencional (en nuestro caso, FV1000, Olympus) con un accesorio de montaje C (ampliación 0.35x).
  2. Si hay una obturación a lo largo de la trayectoria de la luz de la lente del objetivo a la cámara CCD, que se cierra durante el escaneo láser, quitar con cuidado. Como este paso depende de los microsfrente de configuración, póngase en contacto con el fabricante del microscopio para el apoyo técnico, si es necesario.

3. Disección

  1. Enjuague las larvas ATR-alimentados con agua para eliminar restos de alimentos del cuerpo.
  2. Ponga la larva en un plato recubierto Sylgard, lado dorsal hacia arriba (el lado dorsal tiene dos tubos traqueales que ejecutan longitudinalmente, uno a cada lado de la línea media dorsal). El espesor de la Sylgard es de aproximadamente 5 mm.
  3. Inserte un pasador de insectos (patas de insectos Austerlitz, Φ0.10mm, acero) en la cola entre los tubos traqueales con forceps (# 5 Inox, FST por Dumont, Suiza). Los pasadores, unos 10 mm de largo, se deben doblar o cortar para ser lo suficientemente corto (~ 2 mm de largo) para evitar golpear y dañar la superficie de la lente del objetivo. A continuación, poner el segundo pasador de insectos en la cabeza de la larva cerca del gancho de la boca, negro garra-como la estructura en el extremo anterior.
  4. Añadir Ca 2 + solución salina libre normal (NaCl 140 mM, KCl 2 mM, MgCl2 6 mM, HEPES-NaOH 5 mM,Sacarosa 36 mM (pH 7,1)) para mantener la larva húmedo.
  5. Haga una pequeña incisión cerca de la cola con unas tijeras micro (MB-50-7, Napox, Japón).
  6. A partir de la incisión, hacer un corte longitudinal a lo largo de la línea media dorsal hacia la cabeza. Tenga cuidado de no dañar el cordón nervioso ventral (VNC) y axones.
  7. Haga una pequeña incisión en la cabeza lateralmente.
  8. Coloque 4 clavijas en cada esquina de la bodywall diseccionado. La pared del cuerpo se debe estirar lo suficiente para visualizar un patrón segmentario de la pared del cuerpo, pero no tanto como para impedir movimiento peristáltico.
  9. Eliminar los órganos internos, excepto para el cerebro y el VNC y enjuagar la muestra con solución salina normal Ca 2 +-libre.
  10. Ajuste la orientación del cordón nervioso ventral al ser bilateralmente simétrico mediante el cambio de la posición y orientación de los pins de insectos en la pared del cuerpo. Para fijar la posición del cordón nervioso ventral, insertar un pasador a través del tejido entre el cerebro y la boca hacia abajo para enganchar el Sylgard.
  11. Reemplazar el buffer con 2 mM Ca 2 + solución de Ringer (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, MgCl 2 2 mM, CaCl2 2 mM, HEPES-NaOH 5 mM, sacarosa 36 mM (pH 7,3)).

4. De imágenes con láser de iluminación

  1. Adjuntar una lente objetivo seco 4x (UPlanSApo 4x, NA 0.16, Olympus, Japón) en el microscopio confocal y establecer la preparación larva en el escenario.
  2. Obtener una imagen de transmisión de la preparación disecada con un láser rojo (633 nm) para localizar el cordón nervioso ventral mediante microscopio confocal. Para este análisis, asegúrese de no utilizar un láser de 488nm o 559nm, que induce la estimulación no deseada de ChR2 o NpHR, respectivamente.
  3. Definir la región de interés (ROI) en la imagen de transmisión. Modo zoom podría ser útil para la determinación detallada de la ROI.
  4. Cambiar el conjunto de filtros del microscopio para iluminar con la luz 488nm o 559nm.
  5. Ilumine la preparación con una lámpara halógena para visualizar la pared del cuerpo. Thpreparación de correo puede ser controlado con una cámara CCD adjunta al microscopio confocal.
  6. Registre el movimiento de la pared del cuerpo y conmutar el haz de láser dentro y fuera mientras se monitoriza el movimiento.

Resultados

Activación local y transitoria de las neuronas motoras con ChR2.

Expresamos ChR2 en las neuronas motoras. Los axones de las neuronas motoras que salen de cada proyecto segmento VNC a un segmento correspondiente de la pared del cuerpo. Cuando estimulamos uno o dos segmentos de la VNC con un láser azul, los músculos en los segmentos correspondientes exhibieron contracciones (Figura 1).

La inhibición local y transitoria de las neuronas motoras con NpHR.

Expresamos NpHR en las neuronas motoras. Cuando estimulamos unos (1 ~ 2) segmentos de la VNC con un láser de color amarillo durante las contracciones musculares peristálticos, la onda de propagación fue detenido en los segmentos correspondientes de la pared del cuerpo (Figura 2). Luego la ola reinicia desde los segmentos detenidos cuando cambiamos la iluminación del láser 13.

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Figura 1. Activación local de las neuronas motoras con ChR2. A. Esquema de la activación local de la preparación de filetes. Mediante la iluminación de luz azul de algunos segmentos del cordón nervioso ventral ChR2 expresan en las neuronas motoras, los músculos de los segmentos correspondientes son contratados (cabeza de flecha). B. Las imágenes de transmisión de una larva diseccionado. Iluminación local del cordón nervioso ventral (cabezas de flecha) induce la contracción segmentaria de músculos de la pared del cuerpo (flechas).

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Figura 2. La inhibición local de las neuronas motoras con NpHR. A. Esquema de la inhibición local de la preparación de filetes. Por amarillo-liluminación ight de algunos segmentos del cordón nervioso ventral NpHR expresan en las neuronas motoras, los músculos durante la contracción espontánea-producido movimiento peristáltico (punta de flecha en la parte superior) están relajados (punta de flecha en la parte inferior.) B. Transmisión de imágenes de una larva diseccionado . Iluminación Local del cordón nervioso ventral (puntas de flecha) relajó los segmentos de pared del cuerpo espontáneamente contratados (flechas).

Discusión

Perturbación temporal y local de la actividad neuronal es una técnica muy valiosa para el análisis de la dinámica de la red de circuitos neuronales. En este protocolo, se presenta un método para manipular la actividad neuronal mediante la optogenética utilizando un láser. Alta direccionalidad del láser permite la estimulación optogenética más localizada que la estimulación de campo amplio uso de mercurio o la lámpara de xenón. Aunque iluminaciones láser ya se han aplicado a la optogenética en los estudios anteriores, las configuraciones especiales tales como fibra de vidrio, micromanipulador, y la fuente de láser, se requieren en la mayoría de estudios anteriores. En este protocolo, se utiliza un microscopio confocal convencional para la iluminación local. Dado que el sistema de microscopio confocal es ampliamente utilizado, este método se abrirá la oportunidad de aplicar la optogenética de mayor resolución en muchos laboratorios.

El protocolo tiene dos puntos críticos: la disección de larvas y la potencia del láser. En primer lugar, si el cerebro, el cordón nervioso ventral o un nervio motor está dañado duridisección ng, las larvas presentan menos o ninguno movimiento peristáltico espontánea. Por lo tanto, la precisión es esencial, especialmente cuando se hace una incisión en el lado dorsal con tijeras de primavera y la eliminación de los órganos internos con fórceps. Detalles acerca de la disección se ha informado anteriormente 21. En segundo lugar, si la estimulación es suficiente para ser logrado, una potencia de láser de alrededor de 0,1 ~ 1 mW / mm 2 para ChR2 o 1 se requiere ~ 10 mW / mm 2 para NpHR. Se evaluó la potencia del láser como la potencia total de la luz por debajo de una lente de objetivo dividido por una superficie estimada de iluminación. Se midió la potencia total de la luz usando un medidor de potencia (mobiken, Sanwa MI Technos, Japón). Se estimó la superficie de iluminación que circular la constante del cuadrado de la longitud de onda del láser, que más o menos da área iluminada en límite de difracción. Poder eficaz de la iluminación en la muestra se puede ajustar no sólo por la potencia de la salida del láser, sino también por el cambio de la velocidad de exploración y entumecidoer de repeticiones. Se examinaron láser con 20-100 microsegundos / pixel de 63 veces. Además, el nivel de expresión de la optogenética proteína y la cantidad de ATR también son críticas para la eficiencia de la estimulación. En consecuencia, si las larvas no mostró respuesta optogenética, los siguientes puntos deben ser revisados ​​y corregidos: 1) la potencia del láser (mediante la optimización de sistema de microscopio), 2) el nivel de expresión de la proteína optogenética (marcando genotipo y temperatura de cría), y 3) la cantidad de ATR (mediante el ajuste de la concentración de ATR y período de alimentación). NpHR requiere mayor concentración de ATR que ChR2 hace por razones desconocidas 13. ChR2 funciona bien en larvas criadas en alimentos que contienen menor ATR (por ejemplo, 0,1 mm) que se describe aquí (1 mM). Como la alimentación de las larvas a 1 mM ATR es suficiente para hacer ChR2 foto-reactivo, se recomienda esta concentración para el primer juicio en ChR2 experimentos. La concentración de ATR posteriormente se puede titular por debajo de 1 mM. En cuanto a la duración de la exposición de ATR, le recomendamosla duración se describe aquí para el control de optogenético robusta. A menudo fallamos en observar la respuesta optogenetic cuando se alimentan las larvas de ATR de menor duración.

En este protocolo, iluminación con láser y la adquisición de imágenes son operados por un equipo independiente. Por lo tanto, la detección clara del patrón espacio-temporal de iluminación láser por la cámara CCD es fundamental para el análisis de datos. Si el punto del láser o de la línea es tenue imagen CCD, usted debe optimizar la potencia de la lámpara halógena y el valor de la ganancia de la cámara CCD para visualizar la iluminación láser manteniendo pared del cuerpo visible.

Iluminación Spatiotemporal muestra en este protocolo proporciona información sobre circuitos de motores de larvas, sin embargo, el método tiene algunas limitaciones. En cuanto al aspecto "espacial", la ubicación de la iluminación se graba la imagen CCD de bajo aumento que se usa para grabar en vídeo los movimientos de la pared del cuerpo de. En consecuencia, el área de iluminación puede ser asignado a nivel de segmento, pero no a nivel celular. En cuanto a la "temporal "aspecto, lapso de tiempo entre el cambio en la exploración por láser microscopio confocal y la iluminación por láser depende del sistema de microscopio confocal de barrido y condiciones. Por consiguiente, se requiere algunas pruebas por prueba y error para ajustar la sincronización de iluminación. Desde el momento de la iluminación puede se determinará de imagen CCD de películas con el software adecuado como ImageJ, el factor crítico en la resolución temporal es la velocidad de fotogramas de la cámara de imagen CCD. Normalmente nos fijamos la velocidad de fotogramas de 7,5 a 15 fotogramas por segundo.

Los avances en herramientas optogenetic nos dan la oportunidad de modificar este protocolo. Utilizamos 3 º estadio las larvas poseen OK6-Gal4 y UAS-ChR2 [H134R] o UAS-NpHR2. Otras herramientas optogenética en lugar de ChR2 [H134R] o NpHR2 como ChR2 [T159C/E123T], NpHR3 o Arch pueden aumentar la eficiencia de la actividad de control 22. Además, el uso de otras líneas Gal4 o analizar en otras etapas de desarrollo puede dar más información acerca de la circui motorts.

En este protocolo, la actividad motora se controló por imágenes de transmisión de la contracción bodywall con una cámara CCD. La actividad de las neuronas motoras con moléculas fluorescentes sensibles al calcio (por ejemplo GCaMP) también se puede controlar directamente, mientras que la manipulación de la actividad neuronal con ChR2 o NpHR. En este caso, iluminación de luz azul en un área amplia y una cámara CCD de alta sensibilidad (por ejemplo, cámara EMCCD) se utiliza en lugar de una lámpara de halógeno y la cámara CCD normales se ha descrito anteriormente en este documento. Para mejorar la resolución espacial de la estimulación durante la monitorización movimiento bodywall, utilizando una lente de objetivo adicional puede ser un método más avanzado: iluminación del cordón nervioso ventral por una lente de objetivo de gran aumento (por ejemplo, 40x) de encima de la muestra y el seguimiento bodywall por la lente de bajo aumento (por ejemplo, 4x) debajo de la muestra. Este sistema de doble lente puede permitirnos para estimular el sistema nervioso de una mayor resolución espacial.

El protocolo que se muestra aquí se puede aplicar a otros circuitos neuronales, herramientas optogenetic proporcionadas pueden ser expresados ​​en el sistema nervioso y preparación en la que luz suficiente puede ser entregado en el tejido neural se pueden establecer.

Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica en áreas innovadoras "Mesoscopic neurocircuitry" (N º 22115002) y "Red de Ciencia del Cerebro Integral" (No. 221S0003) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia, y Tecnología de Japón para la AN y subvención-en-Ayudas a Jóvenes Científicos (B) (N º 21700344), de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP) de Hong Kong

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microscopio BX61WIOlympus CorporationBX61WI
Fluoview FV1000 sistema confocalOlympus CorporationFV1000
Cámara CCDSonyXCD-V60
all-trans retinalSigmaR2500-500MG200 mM stock en 95% EtOH
Silpot184Dow Corning Toray3255981

Referencias

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