El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

Summary

Análisis citométrico de flujo de Complementación fluorescencia bimolecular proporciona un método cuantitativo de alto rendimiento para estudiar la interacción proteína-proteína. Esta metodología se puede aplicar a los sitios de unión de proteínas y de mapeo para los factores que regulan la interacción proteína-proteína de cribado.

Abstract

Entre los métodos para el estudio de la interacción proteína-proteína dentro de las células, complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) es relativamente simple y sensible. BiFC se basa en la producción de fluorescencia utilizando dos fragmentos no fluorescentes de una proteína fluorescente (Venus, una variante de la proteína fluorescente amarilla, se utiliza aquí). Fragmentos de Venus no fluorescentes (VN y VC) se fusionan a dos proteínas que interactúan (en este caso, AKAP-Lbc y PDE4D3), produciendo fluorescencia debido a la interacción VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 y la formación de una proteína fluorescente funcional dentro de las células.

BiFC proporciona información sobre la localización subcelular de complejos de proteínas y la fuerza de las interacciones de proteínas basado en la intensidad de fluorescencia. Sin embargo, el análisis mediante microscopía BiFC para cuantificar la fuerza de la interacción proteína-proteína es mucho tiempo y es algo subjetivo debido a la heterogeneidad en la expresión de proteínas y la interacción. Por citometría de flujo de acoplamientoanálisis con metodología BiFC, la BiFC señal de la interacción proteína-proteína fluorescente se puede medir con precisión para una gran cantidad de células en un corto período de tiempo. Aquí, demostramos una aplicación de esta metodología para mapear regiones en PDE4D3 que se requieren para la interacción con AKAP-Lbc. Esta metodología de alto rendimiento se puede aplicar a la detección de factores que regulan la interacción proteína-proteína.

Introduction

650.000 interacciones proteína-proteína se estima que existen en el interactome humana, jugando un papel crítico en el mantenimiento de las funciones celulares normales ^1,2. Además de co-inmunoprecipitación (co-IP), el estándar de oro para el estudio de la interacción proteína-proteína a partir de lisado de células, varios ensayos de complementación de fragmentos de proteínas (PCA) se han desarrollado para mejorar la sensibilidad en la detección de la interacción proteína-proteína dentro de las células ^3. Las técnicas incluyen la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET), la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscen....

Protocol

1. Transfección celular

1. Células de la placa el día antes de la transfección, plateando el menor número de células de inmunofluorescencia.
   1. Por inmunofluorescencia: en una placa de 6 pocillos, escudo cubreobjetos de vidrio (1 por pocillo) con 0,02% de gelatina a 37 ° C durante al menos 4 horas, se lava una vez con medio, y para cada pozo, placa 1 x 10 ⁵ células HEK 293T las células en 2 ml de medio de crecimiento completo [medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) más 10% de FBS].
   2. Para citometría de flujo y análisis de transferencia Western: placa de 1,2 x 10 ⁵ células HEK 293T / pocillo en 2 ml de medio de crecimi....

Results

AKAP-Lbc y PDE4D3 construcciones (Figura 1B) se fusionaron a VN y fragmentos de VC, respectivamente. Interacción de AKAP-Lbc y PDE4D3 resultados funcionales en YFP fluorescencia (Figura 1A). Aquí se utiliza el método BiFC para asignar sitios AKAP-Lbc vinculantes en PDE4D3. Aguas arriba región conservada 1 (UCR1), región aguas arriba conservada 2 (UCR2) y la región catalítica (CAT) se conservan entre las proteínas de la familia de PDE4, por lo tanto, de longitud completa (FL), UCR1 y UCR.......

Discussion

BiFC es un método simple y sensible para estudiar la interacción proteína-proteína. Este método no se puede utilizar para identificar nuevas interacciones proteína-proteína, sin embargo, es especialmente conveniente para confirmar la interacción proteína-proteína dentro de las células y para estudiar las propiedades funcionales, tales como la localización subcelular de complejos de proteínas, mapeo de sitios de interacción proteína-proteína, y para la detección de pequeñas moléculas / péptidos que pueden modular la inte.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REACTIVOS
Dulbecco’ s Águila modificada’ s media (DMEM)	Invitrogen	11965-092
Penicilina-Estreptomicina (pluma/estreptococo), 100x	Invitrogen	15070-063
Suero fetal bovino (FBS)	Invitrogen	16000-044
Anticuerpo anti-bandera	Sigma	M2, F1804
Anticuerpo anti-HA	Covance	16B12, MMS-101R
α-tubulina	Sigma	DM1A, T9026
Anticuerpo anti-GFP	Clontech	632569
Placas de cultivo celular, tratamiento de cultivo de tejidos de 6 pocillos	Células Thermo Fisher Scientific	130184
HEK 293T	ATCC	CRL-11268
Maxiprep kit de purificación de plásmidos, alta velocidad	Qiagen	12663
Dulbecco’ s Solución salina tamponada con fosfato (DPBS), estéril 1x	Invitrogen	14190-144
Tripsina-EDTA, 0,05% (p/v)	Gibco	25300
Tubos de poliestireno de fondo redondo para tinción con FACS	BD Biosciences	352052
Paraformaldehído	Fisher Scientific	S74337MF
Reactivo antidecoloración de oro con DAPI	Invitrogen	P-36931
Portaobjetos de microscopio Superfrost plus	Fisher Scientific	12-550-15
Cubreobjetos de primera calidad Fisher	Scientific	12-548-5P
EQUIPMENT
CO2 con camisa de aire Incubadora	NuAIR DH de flujo
Microscopio confocal LSM510 META	Carl Zeiss, Inc
Unidad de electroforesis y transferencia	Biorad
Cyan ADP Citómetro de flujo	Beckman Coulter