El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

Summary

Análisis citométrico de flujo de Complementación fluorescencia bimolecular proporciona un método cuantitativo de alto rendimiento para estudiar la interacción proteína-proteína. Esta metodología se puede aplicar a los sitios de unión de proteínas y de mapeo para los factores que regulan la interacción proteína-proteína de cribado.

Abstract

Entre los métodos para el estudio de la interacción proteína-proteína dentro de las células, complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) es relativamente simple y sensible. BiFC se basa en la producción de fluorescencia utilizando dos fragmentos no fluorescentes de una proteína fluorescente (Venus, una variante de la proteína fluorescente amarilla, se utiliza aquí). Fragmentos de Venus no fluorescentes (VN y VC) se fusionan a dos proteínas que interactúan (en este caso, AKAP-Lbc y PDE4D3), produciendo fluorescencia debido a la interacción VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 y la formación de una proteína fluorescente funcional dentro de las células.

BiFC proporciona información sobre la localización subcelular de complejos de proteínas y la fuerza de las interacciones de proteínas basado en la intensidad de fluorescencia. Sin embargo, el análisis mediante microscopía BiFC para cuantificar la fuerza de la interacción proteína-proteína es mucho tiempo y es algo subjetivo debido a la heterogeneidad en la expresión de proteínas y la interacción. Por citometría de flujo de acoplamientoanálisis con metodología BiFC, la BiFC señal de la interacción proteína-proteína fluorescente se puede medir con precisión para una gran cantidad de células en un corto período de tiempo. Aquí, demostramos una aplicación de esta metodología para mapear regiones en PDE4D3 que se requieren para la interacción con AKAP-Lbc. Esta metodología de alto rendimiento se puede aplicar a la detección de factores que regulan la interacción proteína-proteína.

Introduction

650.000 interacciones proteína-proteína se estima que existen en el interactome humana, jugando un papel crítico en el mantenimiento de las funciones celulares normales ^1,2. Además de co-inmunoprecipitación (co-IP), el estándar de oro para el estudio de la interacción proteína-proteína a partir de lisado de células, varios ensayos de complementación de fragmentos de proteínas (PCA) se han desarrollado para mejorar la sensibilidad en la detección de la interacción proteína-proteína dentro de las células ^3. Las técnicas incluyen la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET), la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) y complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) ^4,5. BiFC se basa en la asociación facilitado de dos fragmentos de una proteína fluorescente (aquí usamos Venus; una variante YFP) que están cada uno fusionado a un potencial socio de interacción de proteínas (en este ejemplo utilizamos AKAP-Lbc y PDE4D3). La interacción de las dos proteínas de interés dentro de las células resultados en la fluorescencia funcional, que se pueden visualizar por fmicroscopía luorescence utilizando ya sea células vivas o fijas ^6,7,8. En comparación con otros PCAs, BiFC es sensible y técnicamente menos exigente, con potencial para estudiar la localización celular en células vivas. Un inconveniente importante de esta técnica, sin embargo es que una vez formado, el complejo proteína fluorescente puede no ser revertida. Por lo tanto, no es un buen método para estudiar la interacción proteína-proteína dinámico. En este trabajo, utilizamos BiFC para asignar los sitios de interacción de PDE4D3 con AKAP-Lbc controlando la intensidad de fluorescencia de Venus. En comparación con el análisis tradicional utilizando microscopía de fluorescencia, que es mucho tiempo y mano de obra intensiva (si no se lleva a cabo utilizando maquinaria de alto rendimiento automatizado), citometría de flujo proporciona un análisis cuantitativo sencillo de miles de células en una población heterogénea durante un corto período de tiempo ^{9, 10.} Aquí, mediante la realización de una comparación lado a lado de análisis de citometría de flujo-BiFC tradicional y co-IP, se demuestra que las dos métodos de proporcionar información comparable, sin embargo, el flujo de análisis de citometría de BiFC consume menos tiempo y utiliza menos material que puede ser más útil cuando las células de interés son limitados.

Protocol

1. Transfección celular

1. Células de la placa el día antes de la transfección, plateando el menor número de células de inmunofluorescencia.
   1. Por inmunofluorescencia: en una placa de 6 pocillos, escudo cubreobjetos de vidrio (1 por pocillo) con 0,02% de gelatina a 37 ° C durante al menos 4 horas, se lava una vez con medio, y para cada pozo, placa 1 x 10 ⁵ células HEK 293T las células en 2 ml de medio de crecimiento completo [medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) más 10% de FBS].
   2. Para citometría de flujo y análisis de transferencia Western: placa de 1,2 x 10 ⁵ células HEK 293T / pocillo en 2 ml de medio de crecimiento completo en placa de 6 pocillos ⁽⁵ x 10 células HEK 293T 0,3 en 0,5 ml de medio de crecimiento completo por pocillo en placas de 24 pocillos ).
2. Preparar ADN para la transfección de acuerdo con el protocolo de fabricación: Effectene (Qiagen) se utiliza para inmunofluorescencia. TransIT-LT1 (Mirus) se utiliza para citometría de flujo y análisis de transferencia de Western. Cantidad de ADN usada se enumeran a continuación.

   	Placa de 24 pocillos (ng)	Placa de 6 pocillos (ng)
   CFP-vector	10	50
   VN N-AKAP-Lbc	200	1000
   VC N-PDE4D3-FL (longitud completa PDE4D3)	2,5, 5, 10, 20, 40, 80	100
   VC-N-PDE4D3 UCR1 (un fragmento N-terminal de PDE4D3 que contiene el dominio UCR1)		100
   VC-N-PDE4D3 UCR2 + CAT (un fragmento C-terminal de PDE4D3 que contiene los dominios UCR2 y catalítica)		100

   La transfección utilizando Effectene (6 pocillos):
   1. Añadir cantidad indicada de ADN plásmido + 4 l potenciador a 100 l de tampón CE, la mezcla, y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente.
   2. Añadir 5 l Effectene, mezclar e incubar durante 10 minutos atemperatura ambiente. Añadir gota a gota a las células.
   La transfección con tránsito LT1 (6-well/24-well):
   1. Añadir cantidad indicada de ADN plásmido a 250 μl/50 l de Opti-MEM medio libre de suero que en un tubo estéril.
   2. Añadir TransIT-LT1 reactivos a la mezcla de ADN diluido y pipetear suavemente para mezclar. (Tránsito-LT1 Reactivo: relación DNA es de 3 l de tránsito LT1 reactivo por 1 g de ADN).
   3. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente y añadir, gota a gota a las células.

2. Preparación de las células para citometría de flujo, Western Blot e inmunofluorescencia

1. 24 h después de la transfección, compruebe fluorescencia al microscopio de epifluorescencia antes de recoger las células.
2. Preparación de las células para el análisis de citometría de flujo:
   1. Lavar las células con 0,5 ml / 2 ml de PBS enfriado en hielo para las placas 24-well/6-well.
   2. Separar las células utilizando 50 μl/250 l 0,05% de tripsina.
   3. Neutralizar la tripsina con 200 l / 1 ml de medio DMEM.
   4. Collect 250 células l (tanto para la placa de 24 pocillos y 6 pocillos) por centrifugación a 500 xg durante 5 min, se utilizan las células restantes (1 ml) para análisis de transferencia Western.
   5. Resuspender las células en 250 l de tampón FACS [PBS + 0,5% (w / v) de BSA + 2 mM de EDTA], almacenar en hielo para el análisis de citometría de flujo. Las células también pueden ser fijadas en paraformaldehído al 1% (en PBS) si el análisis de citometría de flujo no será inmediata.
3. Preparación de las células para el análisis de Western blot: lleva a cabo en paralelo con la preparación de células para el análisis de citometría de flujo.
   1. Lavar las células 1 vez con 2 ml de PBS enfriado en hielo, lisar las células mediante la adición de 100 l de tampón de lisis celular [10 mM de tampón de fosfato de sodio, pH 6,95, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 5 mM EGTA, 1% de Triton X-100] .
   2. Recoger lisado de células por centrifugación durante 10 min a 21.000 xg a 4 ° C.
   3. Cuantificar la concentración de proteína mediante el ensayo de proteínas Bradford, cargar la misma cantidad de proteína por carril para SDS-PAGE y transferencia a nitrocelulosa para inmunotransferencia.
4. Preparación de las células para inmunofluorescencia.
   1. Lavar las células 3 veces con 2 ml de PBS, fijar las células en 1 ml de paraformaldehído al 3,7% (en PBS) durante 10 min a temperatura ambiente, a continuación, lavar 3 veces con 2 ml de PBS durante 5 min.
   2. Monte cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio, utilizando medio de montaje. Selle los bordes cubreobjetos utilizando esmalte de uñas si es necesario.
   3. Guarde las diapositivas a 4 ° C antes del examen.

3. Citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia

1. La citometría de flujo se realizó utilizando un Beckman Coulter Cian ADP, equipada con 488 nm, 405 nm, 642 nm y los láseres de estado sólido. Cumbre software se utiliza para la adquisición y análisis.
   1. Calibrar citómetro de flujo usando perlas estándar.
   2. Terreno dispersión frontal (FSC) / Inclinación de lado de dispersión (SSC) en una escala lineal para la población de células vivas de puerta.
   3. Terreno FSC / tensión ancho de pulso de la población de células vivas no agregada gating.
   4. Terreno count/FL6 (PPC fluorescence, 405 nm) en una escala logarítmica para las células PPC-positivos en vivo no agregadas de activación periódica.
   5. Terreno count/FL1 (YFP fluorescencia, 488 nm) en una escala logarítmica de la intensidad BiFC.
   6. Ejecutar las muestras negativas YFP-PPC-doble, ajuste FSC, SSC, FL1 y FL6 foto tubo multiplicador (PMT) para ajustar la tensión de umbral para cada señal.
   7. Ejecute un solo positivo (tanto YFP y PPC + +) muestras para futuras compensaciones fuera de línea
   8. Adquirir al menos 10.000 eventos cerradas (células no agregadas en vivo PPC +) para su análisis.
2. La inmunofluorescencia se realizó con un LSM 510 microscopio confocal Zeiss Nota:. Es importante tener todas las configuraciones (como el zoom, pinhole, la ganancia del detector, amplificador de desplazamiento, tamaño, velocidad de exploración, exploración de la media, y la potencia del láser) consistente entre muestras para comparación adecuada de todos los datos.

4. Análisis de Datos (realizó utilizando el software Summit)

1. Configurar el protocolo de análisis similar a la de acquisition con la selección adecuada:
   Puerta 1 en gráfico de puntos de FSC / SSC para las células vivas.
   Puerta 2 de FSC / ancho de pulso de la puerta 1 para las células vivas no agregados.
   Puerta 3 en el recuento / PPC de la puerta 3 de la PPC no agregada + células vivas.
2. Compensar YFP y PPC señal usando + y PPC + células positivas individuales YFP.
3. Vuelva a determinar las líneas de corte para las células CFP / YFP-positivo.
4. Export YFP intensidad media de fluorescencia (MFI) de PPC + células a Excel de datos de trazado.
5. Normalizar YFP IMF a los niveles de expresión de AKAP-Lbc, PDE4D3, y control de carga α-tubulina, según se determinó por Western blot.

Results

AKAP-Lbc y PDE4D3 construcciones (Figura 1B) se fusionaron a VN y fragmentos de VC, respectivamente. Interacción de AKAP-Lbc y PDE4D3 resultados funcionales en YFP fluorescencia (Figura 1A). Aquí se utiliza el método BiFC para asignar sitios AKAP-Lbc vinculantes en PDE4D3. Aguas arriba región conservada 1 (UCR1), región aguas arriba conservada 2 (UCR2) y la región catalítica (CAT) se conservan entre las proteínas de la familia de PDE4, por lo tanto, de longitud completa (FL), UCR1 y UCR...

Discussion

BiFC es un método simple y sensible para estudiar la interacción proteína-proteína. Este método no se puede utilizar para identificar nuevas interacciones proteína-proteína, sin embargo, es especialmente conveniente para confirmar la interacción proteína-proteína dentro de las células y para estudiar las propiedades funcionales, tales como la localización subcelular de complejos de proteínas, mapeo de sitios de interacción proteína-proteína, y para la detección de pequeñas moléculas / péptidos que pueden modular la inte...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REACTIVOS
Dulbecco’ s Águila modificada’ s media (DMEM)	Invitrogen	11965-092
Penicilina-Estreptomicina (pluma/estreptococo), 100x	Invitrogen	15070-063
Suero fetal bovino (FBS)	Invitrogen	16000-044
Anticuerpo anti-bandera	Sigma	M2, F1804
Anticuerpo anti-HA	Covance	16B12, MMS-101R
α-tubulina	Sigma	DM1A, T9026
Anticuerpo anti-GFP	Clontech	632569
Placas de cultivo celular, tratamiento de cultivo de tejidos de 6 pocillos	Células Thermo Fisher Scientific	130184
HEK 293T	ATCC	CRL-11268
Maxiprep kit de purificación de plásmidos, alta velocidad	Qiagen	12663
Dulbecco’ s Solución salina tamponada con fosfato (DPBS), estéril 1x	Invitrogen	14190-144
Tripsina-EDTA, 0,05% (p/v)	Gibco	25300
Tubos de poliestireno de fondo redondo para tinción con FACS	BD Biosciences	352052
Paraformaldehído	Fisher Scientific	S74337MF
Reactivo antidecoloración de oro con DAPI	Invitrogen	P-36931
Portaobjetos de microscopio Superfrost plus	Fisher Scientific	12-550-15
Cubreobjetos de primera calidad Fisher	Scientific	12-548-5P
EQUIPMENT
CO2 con camisa de aire Incubadora	NuAIR DH de flujo
Microscopio confocal LSM510 META	Carl Zeiss, Inc
Unidad de electroforesis y transferencia	Biorad
Cyan ADP Citómetro de flujo	Beckman Coulter