Aquí se describe un método robusto para el fraccionamiento de las membranas de plasma de plantas en las membranas solubles resistentes y detergentes detergente a base de una mezcla de no marcado e in vivo completamente 15 N cultivos de células de Arabidopsis thaliana etiquetados. El procedimiento se aplica para los estudios proteómicos comparativos para entender los procesos de señalización.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Metabólicas etiquetado y de membrana de fraccionamiento para Comparativo Proteómica Análisis de
En este artículo
Resumen
Resumen
Microdominios de membrana de plasma son características basadas en las propiedades físicas del entorno de lípidos y esteroles y tienen funciones específicas en los procesos de señalización. La extracción de microdominios de membrana enriquecidos con esteroles a partir de células de plantas para el análisis proteómico es una tarea difícil debido principalmente a múltiples pasos de preparación y las fuentes de contaminación de otros compartimentos celulares. La membrana plasmática constituye sólo alrededor del 5-20% de todas las membranas en una célula de planta, y por lo tanto el aislamiento de la fracción de membrana de plasma altamente purificado es un reto. Un método utilizado con frecuencia implica acuosa de partición de dos fases en glicol de polietileno y dextrano, que produce vesículas de la membrana de plasma con una pureza de 95% 1. Microdominios de membrana rica en esteroles dentro de la membrana de plasma son insolubles tras el tratamiento con detergentes no iónicos en frío a pH alcalino. Esta fracción de membrana resistente al detergente se puede separar de la membrana plasmática a granel por ultracentrifugación en comogradiente ucrose 2. Posteriormente, las proteínas se pueden extraer de la banda de baja densidad de la gradiente de sacarosa mediante precipitación de metanol / cloroformo. Proteína extraída a continuación, se digirió tripsina, se desalaron y finalmente analizado por LC-MS/MS. Nuestro protocolo de extracción para microdominios rica en esteroles está optimizado para la preparación de fracciones de membrana limpias detergente resistentes de cultivos de células de Arabidopsis thaliana.
Utilizamos marcaje metabólico completo de los cultivos celulares suspensión de Arabidopsis thaliana con K 15 NO 3 como única fuente de nitrógeno para los estudios proteómicos comparativos cuantitativos después del tratamiento biológico de interés 3. Mediante la mezcla de iguales proporciones de cultivos de células marcadas y no marcadas para la extracción de proteínas conjunta la influencia de pasos de preparación sobre resultado cuantitativo final se mantiene a un mínimo. También la pérdida de material durante la extracción afectará tanto el control y las muestras de tratamiento de la misma manera, unad, por tanto, la relación entre la luz y el péptido tirón se mantendrá constante. En el método propuesto ya sea marcada o no marcada cultivo celular se somete a un tratamiento biológico, mientras que el otro sirve como control 4.
Introducción
En 1972, Jonathan Singer y Garth Nicolson propusieron el modelo de mosaico fluido un modelo de estructura de las membranas celulares, en sustitución del modelo de sándwich proteína-proteína-lípido que en general se aceptó a principios de 1960. Singer y Nicolson postularon que la membrana biológica puede ser considerado como un líquido de dos dimensiones, donde todas las moléculas de lípidos y de proteínas se difunden libremente y fácilmente 5. Desde ese momento, la estructura del modelo de la membrana plasmática y el conocimiento de la composición de la membrana se hizo aún más complejo. En particular, dentro de la membrana plasmática, se pueden observar e....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
PROCEDIMIENTO
Reactivos y tampones comunes usados en el protocolo de extracción:
- Medio JPL para la suspensión de cultivos celulares de Arabidopsis thaliana
- 3 M H 3 BO 3
- 3 M MnSO4 x H 2 O
- 1,1 M ZnSO 4 x 7 H 2 O
- 0,15 M KJ
- 0,03 M Na 2 Moo 4 x 2 H 2 O
- 3 nM CoCl2 x 6 H 2 O
- 3 nM CuSO 4 x 5 H 2 O
- 0,9 mM CaCl 2 x 2 H 2 O
- 0,5 mM MgSO 4 x 7 H 2 O
- 0,5 M ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Con el protocolo presentado usando cultivos de células de Arabidopsis marcadas metabólicamente que es posible aislar las membranas plasmáticas a partir de tejido de la planta (paso 2, las Figuras 2 y 4), y para enriquecer resistente a detergentes fracciones de membrana dentro de la membrana de plasma (paso 3, las Figuras 3 y 5). Posteriormente, el protocolo permite la extracción de proteínas a partir de estos resistentes a detergentes fracciones de la membrana (paso 4) y la dig.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El protocolo se presenta en este documento contiene muchos pasos y todos ellos son cruciales para obtener el fraccionamiento pura y representante de la membrana plasmática de plantas resistentes a las membranas de detergente y fracciones solubles detergentes. Por lo tanto, es importante seguir cada paso como se indica.
El tratamiento de la fracción de membrana de plasma con detergente no iónico (paso 3.2) tiene la mayor influencia en la calidad de la membrana de microdominios de fraccionamie.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
El autor, Witold Szymanski, es un empleado del Instituto Max Planck de Fisiología Molecular de Plantas. El autor, Waltraud Schulze es un empleado de la Universidad de Hohenheim, Alemania.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| REACTIVOS | |||
| Los productos químicos se encargaron a Sigma-Aldrich a menos que se indique lo contrario | |||
| Amoníaco (stock 25 % solución) | WAKO | 010-03166 | |
| TiO2 10 μ m | GL-Science | 5020-75010 | |
| Disco Empore C18 | Varian | 12145004 | |
| Polietilenglicol(PEG 3350) | Sigma | 88276 | |
| Dextran T500 | Roth | 9219.2 | |
| Tripsina | Promega | V5113 | |
| Cóctel de inhibidores de la proteasa (PIC) | Sigma | P9599 | |
| K15NO3 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-765-PK | |
| EQUIPMENT | |||
| Optima L-80 XP Ultracentrífuga | Beckman | ||
| Lector de placas | BioTek | ||
| EASY-nLC II cromatógrafo nano-líquido | Thermo Scientific | ||
| Espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap | Centrífuga Thermo Scientific | ||
| 5810R | Centrífuga Eppendorf | ||
| 5417R | Eppendorf | ||
| Speed Vac RVC 2-25 | Christ | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph |
Referencias
- Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking. Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).
- Brown, D. A., Rose, J. K.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
