Growth La medición y de la Expresión Génica Dinámica de Tumor-Targeted S. Typhimurium Las bacterias

Resumen

La meta de estos experimentos es para generar datos de tiempo-por supuesto cuantitativas a la la el crecimiento y el dinámica de la expresión de genes de atenuada S. typhimurium Colonias de bacterias que crecen dentro de tumores. Este video cubre la preparación tumor de células de y el implante de, la preparación bacteria y la inyección, proyección de imagen su conjunto-animal de luminiscencia, la excisión tumor, y el conteo de colonia bacteriana.

Resumen

La meta de estos experimentos es para generar datos de tiempo-por supuesto cuantitativas a la la el crecimiento y el dinámica de la expresión de genes de atenuada S. typhimurium colonias bacterianas que crecen dentro de los tumores.

Hemos generado los tumores de xenoinjerto modelo en ratones mediante inyección subcutánea de una línea celular de cáncer de ovario humana, OVCAR-8 (NCI Repositorio de Tumor DCTD, Frederick, MD).

Se transformaron cepas atenuadas de S. bacterias typhimurium (ELH430: SL1344 ^phoPQ-1) con una luciferasa expresada constitutivamente (luxCDABE) plásmido para la visualización ^2. Estas cepas colonizan específicamente los tumores mientras que restante esencialmente no-virulenta a la del ratón ^1.

Una vez que se establecieron los tumores medibles, las bacterias fueron inyectados por vía intravenosa a través de la vena de la cola con diferentes dosis. Del Tumor-localizada, la expresión de genes bacteriana se monitorizó en el tiempo real a través de el curso de 60 horas utilizando unen sistema de imágenes in vivo (de IVIS). En cada punto de tiempo, los tumores se extirparon, se homogeneizó, y se sembraron para cuantificar las colonias bacterianas para la correlación con datos de expresión génica.

Juntos, este de datos rinde un medida cuantitativa de la en crecimiento in vivo y dinámica de la expresión de genes de las bacterias que crecen dentro de los tumores.

Introducción

La biología sintética ha progresado rápidamente en la última década y ahora está posicionada para impactar los problemas importantes de la energía y la salud. Sin embargo, expansión en el arena clínica ha sido ralentizado por las preocupaciones de seguridad y una ausencia de el desarrollo de criterios de diseño para en los circuitos de genéticos in vivo. Acelerar las aplicaciones médicas de alto impacto requerirá métodos que interactúan directamente con la infraestructura médica, circuitos genéticos que funcionan fuera del entorno de laboratorio controlado, y los huéspedes microbianos seguros y clínicamente aceptado utilizar.

Un número de cepas han sido investigado para la terapia de cáncer de debido a la su capacidad para crecer preferencialmente en los tumores de. Estos han incluido C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, y la S. typhimurium ^3-8. S. typhimurium ha generado particular, interés, ya que han exhibido la seguridad y la tolerancia en un número de los ensayos clínicos humanos ^9-12. Estos bacteri un fueron mostrados inicialmente para crear efectos anti-tumorales a través de la estimulación de la sistema de inmune del huésped y por el agotamiento de nutrientes requeridos para el metabolismo de celular de cáncer de. De Producción de de carga terapéutica más tarde se añadió a través de modificaciones genéticos. Mientras que estos estudios representan importantes avances en el uso de las bacterias para las terapias de tumorales, la mayoría de los esfuerzos de existentes se han basado en de alta-nivel de expresión que típicamente da como resultado en la entrega de de alta dosificaciones, efectos de fuera de objetivo, y de desarrollo de la resistencia del huésped ^{13-16 de} .

Ahora, la biología sintético puede añadir producción de de carga programable de mediante la utilización de circuitos de genéticos computacionalmente-diseñados que pueden realizar sensing y la entrega ^17-20 avanzados. Estos circuitos de pueden ser diseñados para actuar como los sistemas de de entrega que detectan estímulos del tumor-específicas y de la libre-regular la de producción de carga como sea necesario. Sin embargo, el estudio de la función de estos circuitos en vivo hasta el momento ha sido difícil.

ve_content "> Dado que plásmidos son la marco común para los circuitos de sintéticos, nos describimos un método para caracterizar la dinámica de la la expresión de genes plásmido-basado en en in vivo el uso de un modelo de ratón. Estos métodos utilizan proyección de imagen luminiscencia de lapso de tiempo y la medición cuantitativa de la biodistribución. Juntos, estos enfoques proporcionan un marco para el estudio de redes de plásmido-basados ​​en in vivo para las aplicaciones clínicas.

Protocolo

1. Preparación de células

1. Líneas de células Passage que utilizan técnicas de cultivo celular estándar. En este experimento, se utilizaron células OVCAR-8 (NCI Repositorio tumor DCTD, Frederick, MD). Se cultivan las células a un objetivo confluencia del 80 - 100%.
2. Se incuban las células con 5 ml de tripsina durante 5 min, a continuación, añadir 5 ml de medio RPMI + FBS para inactivar la tripsina.
3. Harvest y el recuento de las células sobre un hemocitómetro. Volver a suspender en fenol DMEM que rojo-libre de a una concentración de destino de 5 x 10 ⁷ células / ml, o acerca de 200 l por matraz de.
4. Añadir 15% reducida el crecimiento factor de de Matrigel (BD Biosciences) y mantener a la suspensión de células en el hielo hasta la implantación.

2. La implantación del tumor

1. Anestesie 4 semanas de edad las mujeres NCR / nu ratones utilizando 3% isoflurano y esperar unos 5 minutos para asegurar la anestesia profunda. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
2. Cargue las células (100 l por tumor) en una jeringa de 1 ml y adjuntar un 27 1/ 2 aguja de calibre.
3. Para cada uno de dos sitios de inyección flanco trasero bilaterales, levantar la piel suavemente con fórceps para hacer una tienda de campaña e inyectar las células en la base. Tenga cuidado de no para penetrar en demasiado profundo, produciendo sangre. Use unas pinzas para quitar suavemente la jeringa sin salpicaduras.
4. Monitorear el crecimiento del tumor todos los días para el 10 de - 20 días hasta que un diámetro del tumor de 2 - se alcanza 4 mm.

3. Las bacterias Preparación

1. Inicie un cultivo nocturno de bacterias en 3 ml de medio LB + ampicilina de un -80 C Stock congelador o placa refrigerada. En este experimento, se utilizó S. typhimurium cepa ELH430 (SL1344 phoPQ-aroA de-).
2. Por la mañana, se diluye la cultura 1:100 en LB filtrada y crecer a OD600 0,4 a ,6.
3. Decantar y lavar 3 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y resuspender en un final de DO600 de 0,1 (aproximadamente 1 x 10 ⁷ células / ml).

4. Inyección Bacteria

1. Anestesiar al animal unaposición d en su lado con la cola apuntando hacia su mano dominante. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
2. Dilatar la vena de la cola con agua caliente o una lámpara de calor.
3. Cargar las bacterias (100 l por ratón) en una jeringa de 1 ml y doblar la punta un poco menos de 90 grados.
4. Alinee la punta jeringa con la vena de la cola, penetrar por lo una profundidad poco profunda (debería sentir ningún resistencia), e inyectar bacteria. Observar el desplazamiento flujo de sangre para una inyección de éxito.

5. Ratón Imagenología

1. Anestesiar a los animales en la cámara de inducción y luego coloque cada ratón en la plataforma de imágenes. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Mantener posicionamiento preciso para asegurar resultados cuantitativas entre los puntos de tiempo.
2. Animales de imagen utilizando el sistema de imágenes IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences). Si la imagen de más de 1 animal, lugar barreras de luz entre ellos para evitar cross-illuminación. Los animales deben ser reflejados primero en el lado ventral para confirmar la localización de las bacterias.
3. Animales de imagen dorsalmente el uso de de IVIS todos los 2 hr para la duración de el experimento (36 hora). Generar un curso de tiempo para un retorno de la inversión determinada.

6. Cuantificación de biodistribución bacteriana

1. La eutanasia de los animales utilizando CO ₂ y el lugar en la parte posterior de un pañal absorbente.
2. Girar el animal para exponer los dos tumores subcutáneos flanco trasero. Cortar el tejido de la piel circundante para separar y eliminar los tumores. Sosteniendo el tumor con unas pinzas, retire la piel usando un movimiento de scissor invertida. Cuando la mayoría de los la piel ha sido separado, eliminar totalmente el tumor que usa las pinzas.
3. Coloque los órganos en tubos de microcentrífuga pesados ​​previamente. Dado que la masa de estos tubos de puede variar de manera significativa es importante a pre-sopesar ellos para resultados cuantitativos.

7. Cuantificación de biodistribución bacteriana

1. Para cada punto del tiempo, los impuestos especiales y sopesar los tumores.
2. Añadir 500 l de PBS + 15% de glicerol y homogeneizar con un tejido-Tearor (BioSpec). Enjuague el homogeneizador 3 veces con etanol entre las muestras.
3. Generar diluciones en serie y la placa para el recuento de colonias bacterianas. Para placa de múltiples diluciones en una sola placa uso placas de pre-seccionados.

Resultados

El uso de este protocolo, que son capaces de generar datos sobre el crecimiento in vivo y la dinámica de la expresión de genes de bacterias específicas del tumor. El flujo de trabajo general se resume en la Figura 1.

En la primera etapa de, nos inyectamos bacterias (verde) y de la imagen el animal el uso de de IVIS para medir la expresión gen con luminiscencia (azul) como un reportero.

Luego, en la segunda etapa, que los impuest...

Discusión

El uso de este procedimiento, que son capaces de generar cursos a tiempo para el crecimiento y la dinámica de la expresión de genes de bacterias que colonizan los tumores. Si bien estas mediciones se realizan rutinariamente in vitro en cultivo discontinuo o dispositivos de microfluidos, que son mucho más difíciles de realizar in vivo.

Hay varias modificaciones que se pueden aplicar a estos métodos. Mientras que se utilizó la línea celular OVCAR-8 para generar nuestros model...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de 1 ml	BD Biosciences	309602
3/10 cc Jeringa de insulina	BD Biosciences	309301
PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	301629
RPMI Medium 1640 (1X), líquido, con L-glutamina	Invitrogen	11875-119
Ampicilina	Sigma Aldrich	A0166-5G
LB Agar Caldo	Sigma Aldrich	L2897
Caldo Luria-Bertani	BD Biosciences	244610