Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

Lyuba Khavrutskii; Joanna Yeh; Olga Timofeeva; Sergey G. Tarasov; Samuel Pritt; Karen Stefanisko; Nadya Tarasova

doi:10.3791/50541

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Artículo de método

Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

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DOI:

10.3791/50541

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15 de agosto de 2013

Lyuba Khavrutskii¹^,² , Joanna Yeh¹ , Olga Timofeeva³ , Sergey G. Tarasov⁴ , Samuel Pritt¹ , Karen Stefanisko¹ , Nadya Tarasova¹

¹Cancer and Inflammation Program, National Cancer Institute, ²Basic Science Program, SAIC-Frederick, Inc., ³Departments of Oncology and Radiation Medicine, Georgetown University Medical Center, ⁴Structural Biophysics Laboratory, National Cancer Institute

En este artículo

Resumen

Termoforesis microescala (MST) puede ser ampliamente utilizado para la determinación de la afinidad de unión sin la purificación de la proteína diana a partir de lisados celulares. El protocolo implica la sobreexpresión de la proteína GFP-fundido, lisis de las células en condiciones no desnaturalizantes, y la detección de la señal de MST en presencia de concentraciones variables del ligando.

Resumen

Caracterización cuantitativa de las interacciones proteína es esencial en prácticamente cualquier campo de las ciencias de la vida, en particular el descubrimiento de fármacos. La mayoría de los métodos actualmente disponibles de determinación de K _D requieren acceso a la proteína de interés, la generación de los cuales puede ser mucho tiempo y es caro purificada. Hemos desarrollado un protocolo que permite la determinación de la afinidad de unión por termoforesis microescala (MST) sin purificación de la proteína diana a partir de lisados celulares. El método implica la sobreexpresión de la proteína GFP-fundido y lisis de las células en condiciones no desnaturalizantes. Aplicación del método de STAT3-GFP expresa transitoriamente en células HEK293 permitieron determinar por primera vez la afinidad del factor de transcripción bien estudiado a oligonucleótidos con diferentes secuencias. El protocolo es sencillo y puede tener una variedad de aplicaciones para el estudio de interacciones de proteínas con moléculas pequeñas, péptidos, ADN, ARN, y proteins.

Introducción

Caracterización cuantitativa de la afinidad de las interacciones intermoleculares es importante en muchas áreas de la investigación biomédica. Encuadernación constante de disociación _(KD) es esencial no sólo en el descubrimiento de fármacos, pero también es un parámetro importante en la caracterización de cualquier interacción binaria en cualquier sistema biológico. Métodos bioquímicos utilizados para la detección de interacciones proteína-proteína, como la inmunoprecipitación y la levadura híbrido de dos pantallas, no nos informan sobre el grado de tensión son las interacciones, mientras que la afinidad define si existe este complejo particular, en determ....