Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

Summary

Termoforesis microescala (MST) puede ser ampliamente utilizado para la determinación de la afinidad de unión sin la purificación de la proteína diana a partir de lisados ​​celulares. El protocolo implica la sobreexpresión de la proteína GFP-fundido, lisis de las células en condiciones no desnaturalizantes, y la detección de la señal de MST en presencia de concentraciones variables del ligando.

Abstract

Caracterización cuantitativa de las interacciones proteína es esencial en prácticamente cualquier campo de las ciencias de la vida, en particular el descubrimiento de fármacos. La mayoría de los métodos actualmente disponibles de determinación de K _D requieren acceso a la proteína de interés, la generación de los cuales puede ser mucho tiempo y es caro purificada. Hemos desarrollado un protocolo que permite la determinación de la afinidad de unión por termoforesis microescala (MST) sin purificación de la proteína diana a partir de lisados ​​celulares. El método implica la sobreexpresión de la proteína GFP-fundido y lisis de las células en condiciones no desnaturalizantes. Aplicación del método de STAT3-GFP expresa transitoriamente en células HEK293 permitieron determinar por primera vez la afinidad del factor de transcripción bien estudiado a oligonucleótidos con diferentes secuencias. El protocolo es sencillo y puede tener una variedad de aplicaciones para el estudio de interacciones de proteínas con moléculas pequeñas, péptidos, ADN, ARN, y proteins.

Introduction

Caracterización cuantitativa de la afinidad de las interacciones intermoleculares es importante en muchas áreas de la investigación biomédica. Encuadernación constante de disociación _(KD) es esencial no sólo en el descubrimiento de fármacos, pero también es un parámetro importante en la caracterización de cualquier interacción binaria en cualquier sistema biológico. Métodos bioquímicos utilizados para la detección de interacciones proteína-proteína, como la inmunoprecipitación y la levadura híbrido de dos pantallas, no nos informan sobre el grado de tensión son las interacciones, mientras que la afinidad define si existe este complejo particular, en determ....

Protocol

1. Preparación de lisado celular

Este protocolo está diseñado para las células adherentes que expresan cualquier proteína GFP-fundido. Se necesita el número de células puede variar desde tan bajo como 10 ⁶ a un máximo de 20 x 10 ⁶ células, dependiendo del nivel de expresión de la proteína. Por ejemplo, lisado de células HEK que sobreexpresan GFP-STAT3 se preparó mediante el tratamiento de las células cultivadas en matraces T75 10 a cerca de 70% de confluencia con 1 ml de tampón de lisis. Sin embargo, este lisado tuvo que ser diluida 150 veces para proporcionar el nivel óptimo de la fluorescencia para el experimento MST....

Results

La medición de la afinidad de los no fosforilados STAT3 proteína de unión a oligonucleótidos.

Células HEK293 que expresan STAT3-GFP se utilizaron como una fuente de la etiqueta fluorescente STAT3 para el ensayo de unión al ADN. Los lisados ​​celulares se prepararon utilizando tampón RIPA (20x10 ⁶ células / ml). Para los estudios de unión, los lisados ​​se diluyeron 150 veces con tampón de unión a ADN MST para proporcionar el nivel óptimo de la proteína fluorescente e.......

Discussion

Expresión y purificación de proteínas es un paso laborioso y costoso, que es, sin embargo, necesario para la determinación de las interacciones de los K _D por el método más utilizado actualmente. Aplicación del MST permite evitar la purificación de proteínas simplificando y acelerando significativamente caracterización cuantitativa de las interacciones. Presenta ventajas particularmente importantes en el caso de difíciles de expresar y purificar proteínas, como las proteínas de membrana y factores de transcri.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tampón RIPA	Millipore	20-188	tampones de otros fabricantes también funcionan
Cóctel de inhibidores de proteasa	Sigma-Aldrich	P2714
Monolito NT.115	NanoTemper Technologies GmbH	G008
Monolito NT.115 Bandeja capilar	NanoTemper Technologies GmbH	T001
Monolito NT.115 Estándar Tratado Capilares	NanoTemper Technologies GmbH	K002
NT Software de control	NanoTemper Technologies GmbH	2.0.2.29
NT Software de análisis	NanoTemper Technologies GmbH	1.4.27
Centrífuga refrigerada de sobremesa	Eppendorf	5417R	Otras centrífugas refrigeradas de microtubos que proporcionan
Protein LoBind Tube 0,5 ml	Eppendorf	22431064