El aislamiento de las neuronas sensoriales de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Se Patch clamp grabaciones de Corrientes glutamatérgicos

Resumen

Se describe la disección del sistema nervioso de la liebre de mar marino Aplysia Después de la anestesia, el aislamiento de las neuronas para el cultivo a corto plazo de los tejidos, y las grabaciones de las corrientes de iones de células individuales a través de la técnica de patch clamp.

Resumen

El molusco gasterópodo marino Aplysia californica tiene una historia venerable como un modelo de funcionamiento del sistema nervioso, con especial importancia en los estudios sobre el aprendizaje y la memoria. Las preparaciones típicas para este tipo de estudios son aquellos en los que la sensorial y motoneuronas se dejan intactos en un animal disecado mínimamente, o neuronal de co-cultivo técnicamente elaborada de sensorial y motoneuronas individual. Menos común es la preparación neuronal aislado en el que pequeños grupos de neuronas nominalmente homogéneos se disocian en células individuales en cultivo a corto plazo. Tales células aisladas son útiles para la caracterización biofísica de las corrientes de iones utilizando técnicas de patch clamp, y la modulación selectiva de estos conductancias. Se describe un protocolo para la preparación de tales cultivos. El protocolo se aprovecha de los fácilmente identificables las neuronas sensoriales de los ganglios de la glutamatérgicas pleural y bucal, y describe su disociación y un mantenimiento mínimo in la cultura durante varios días sin suero.

Introducción

El molusco opistobranch marino Aplysia, ha sido un modelo neurobiológico útil para muchas décadas. Es mejor conocido como modelo de habituación y condicionamiento clásico ^{7, 8.} Los estudios sobre el aprendizaje y la memoria en este modelo ganó el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2000 por Eric R. Kandel, en un premio que compartió con Arvid Carlsson y Paul Greengard ^10. Los estudios que implican registros eléctricos a partir de preparaciones reducidas, en la que los elementos del sistema nervioso de este invertebrado se diseccionaron a partir del animal con los nervios y los músculos dejaron adjunta, han ayudado a aclarar los pap....

Protocolo

1. Preparación de células

1. En el Día 1, pesar y anestesiar a los animales.
   1. Pesar unos 30 g, 1 kg animal. Se anestesia en animales 5-10 volúmenes de agua de mar 01:01: MgCl isotónica. 6H ₂ 0 durante 1 hora con aireación, tales como una bomba de aire de acuario eléctrico con piedra de aire adjunto.
2. Prepare suministros de disección.
   1. Montar la bandeja de disección limpia con alfileres de acero inoxidable, tales como pasadores de tela. Montar varios platos de Petri que contenían agua de mar artificial (ASW; véanse las Tablas 1 y 3) + penicilina / estreptomicina (P / S).
   2. ....

Resultados

La ubicación de las neuronas sensoriales en los ganglios que están dirigidos en este protocolo, las neuronas BSC y PVC se muestran en la Figura 1. Las neuronas BSC están situados en 2 grupos ovales simétricas en el lado ventral del ganglio vestibular, la superficie que se enfrenta lejos de la masa en el ganglio vestibular intacta (Figura 1A). Las neuronas de PVC forman grupos bilaterales, en forma de V que se envuelven alrededor de la superficie dorsal del ganglio pleural hacia el eje c.......

Discusión

Las técnicas de disociación describen aquí dió cultivos de neuronas sensoriales que contienen 50-100 neuronas aisladas intercalados con pequeños números de células gliales y otras células no identificados. Los pasos más críticos en el protocolo son el tiempo de los ganglios permanecen en solución de enzima, y ​​agitando, la disociación de los grupos de células digeridas para romper el clúster en las células individuales. Digestión enzimática (paso 1.8) debe ser optimizado a la temperatura disponibles. A 23 ° C con agita.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agua de mar artificial ASW	Sigma-Aldrich	surtido	(mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7,6
Solución intracelular	Sigma	surtido	(mM): 450 KCl, 2,9 CaCl2 (2 H2O), 2,5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA y 40 HEPES-KOH, pH 7,4
Poly-D-lisina	Sigma	P6407
penicilina/estreptomicina añadida a ASW en 1:100	Lonzo Walkersville, Inc.	17-603E	5.000 Unidades/ml de penicilina más 5.000 mg/ml de estreptomicina
Dispasa neutra II	Diagnostics	10165859001
hialuronidasa	Sigma-Aldrich	H4272
colagenasa tipo XI	Sigma-Aldrich	C9407
L-glutamato (L-Glu)	Sigma-Aldrich	49601-100G
D-aspartato (D-ASP)	Sigma-Aldrich	11200-10G
N-metil-D-aspartato (NMDA)	Biomol	100002-268
L-ASP	Sigma	A6683-25G
ácido alfa-amino-3-hidroxil-5-metil-4-isoxazol-propiónico (AMPA)	Sigma	A6816-5MG
Antagonistas de L-Glu R	varios	varios
agar
quinurenato	Sigma-Aldrich	61250
APV	Sigma-Aldrich	A5282
Ácido DL-2-amino-5-fosfonopentanoico (antagonista NMDAR)
2-propanol	VWRSP	BDH1133
Chloride solución	surtida	Sigma	25 g FeCl3 + 25 ml HCl concentrado + 50 ml H2O
Sylgard silicona polímero de 2 partes	World Precision Instruments (WPI)	SYL184	Proporciona una superficie de clavija para platos de disección pequeños
Microscopio de aumento con zoom de 0-40x para disecciones	Wild
Techniquip 150 vatios Iluminador de fibra óptica	Microóptica de Florida	TQ FOI-150
		orbital RotoMix 50800
Microscopio de contraste de fase invertida Nikon Diaphot con objetivos de 4x, 20x (opcional) y 40x	SR Research Ltd.	Enlace Ocular II&	nbsp;
Osciloscopio digital Tektronix	SR Research Ltd.
software de adquisición y análisis de datos pClamp 10	Molecular Devices
PC con sistema operativo Windows XP o superior	Soluciones		Thinkserver con discos duros de estado sólido (80 GB) y monitores de bajo ruido Tirador de
micropipetas Flaming/Brown P87	Sutter Instruments, Novato, CA&		nbsp;
Amplificador de pinza Axopatch 200B de Axon Instruments con un rango de compensación de capacitancia de 1-1000 pF; preamplificador	Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Conjunto de soporte de electrodos de Axon instruments para el preamplificador Axopatch 200B	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	CV203BU
Convertidor A/D Digidata 1200	Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Picospritzer, accionado por N2 ajustable en presión y duración	Parker Hannifin, Cleveland, OH
TMC Micro-G Mesa de aislamiento de vibraciones	Ametek
		de Faraday	, fabricación a medida
Micromanipuladores piezoeléctricos Burleigh, Burleigh Instruments	; Thorlabs		actualmente PCS-5000; -serie 6000 + monta
manipuladores manuales Narishige M-152 (para sistema de perfusión y picospritzer)	Narishige USA
Vidrio de pipeta de filamento, 1,5 mm de diámetro exterior, 0,84 mm de diámetro interno -	WPI	1B150-3
3 pulgadas de largo
Ag/AgCl media celda	WPI	EP4
Tubos de centrífuga de 15 ml, 35-2097 BD Falcon* Tubos de centrífuga	VWRSP	21008-918
Tijeras en ángulo Fine	Science Tools	15006-09
Dumostar Pinzas finas	Herramientas de ciencia fina	11295-00
Placas de cultivo de tejidos de halcón de 35 mm	VWRSP	25382-064
falcon 150 x 25 mm placas de cultivo de tejidos; 1013	VWRSP	1013	también se puede convertir en pequeñas placas de disección con sylgard
sylgard	WPI	SYL184
bandeja de disección animal	varios
Tubos de centrífuga de 15 ml, 35-2097 BD Falcon	VWRSP	21008-918	Para sistema de perfusión alimentado por gravedad de 6 orificios
Clips de aluminio con extremos de orificio para tornillos	Ferretería		Para sistema de perfusión
Agujas de calibre 23 (puntos de limado manual)	VWRSP		Para sistema de perfusión
Tubo de polietileno de 0,022" de diámetro interno x 0,042" de diámetro exterior; 427411	Becton-Dickinson		para sistema de perfusión
H-7 soporte/soporte de pipetas para matriz de perfusión Microcap	Narishige USA		perfusión
válvulas			Para sistema de perfusión
Drummond Microcaps 1 μ l	VWRSP		para el sistema de perfusión
agujas de calibre 18 para succión (puntos limados)
Tubo de polietileno	Cole Parmer	4.27436E+11
clavijas de disección fina	Fine Science Tools	26002-20
tubos capilares	Kimble 71900-100		pulidos al fuego y en forma de U en una llama de mechero Bunsen y rellenos con agar al 3% en
la tienda		artesanía de arcilla para modelar	ECS
Soporte de plato para platina de microscopio con baño			Pipetas pasteur de fabricación a medida
	VWRSP	14672-412
bombillas de pipeta	VWRSP	53283-911
filtros de jeringa acrodisk	VWRSP	28144-040
vidrio de filamento de borosilicato de pared gruesa de 1,5 mm de diámetro	WPI	1B150F-3
Cilindro de nitrógeno de alta pureza y regulador
Tablas 1-3. Listas de Reactivos, Materiales y Equipos.

Roche Mezclador para PC Jaula , Para sistema de unidireccionales , de de suelo aislado bifurcado