Localización y cuantificación relativa de nanotubos de carbono en las células con multiespectral de imágenes de Citometría de Flujo

Resumen

En este estudio, el objetivo principal fue monitorear la absorción celular y la eventual exocitosis de los nanotubos de carbono (CNTs). Desde esta perspectiva, propusimos aquí un método único que utiliza la citometría de flujo de imágenes multiespectrales que permite la cuantificación y localización de CNTs en un número estadísticamente relevante de células.

Resumen

Nanomateriales a base de carbono, como los nanotubos de carbono (CNT), pertenecen a este tipo de nanopartículas que son muy difíciles de diferenciar de las estructuras celulares ricos en carbono y de hecho todavía no hay método cuantitativo para evaluar su distribución en los niveles de células y tejidos. Lo que proponemos aquí es un método innovador que permite la detección y cuantificación de los nanotubos de carbono en las células usando un flujo de imágenes multiespectrales citómetro (ImageStream, Amnis). Este dispositivo recién desarrollado integra tanto un alto rendimiento de las células y formación de imágenes de alta resolución, proporcionando de este modo imágenes para cada celda directamente en el flujo y por lo tanto el análisis de imágenes estadísticamente relevante. Cada imagen de la célula se adquiere en campo claro (BF), campo oscuro (DF), y los canales de fluorescentes, que da acceso, respectivamente, con el nivel y la distribución de la absorción de la luz, la luz dispersa y fluorescencia de cada célula. El análisis consiste entonces en una comparación píxel por píxel de cada imagen, de la 7,000-10,000 células adquiridas para cada condición del experimento. La localización y cuantificación de los nanotubos de carbono se hace posible gracias a algunas propiedades intrínsecas particulares de CNT: fuerte absorción de luz y la dispersión, de hecho CNT aparecen como absorbe fuertemente las manchas oscuras en BF y puntos brillantes en DF con una colocalización precisa.

Esta metodología podría tener un impacto considerable en los estudios acerca de las interacciones entre los nanomateriales y las células ya que este protocolo es aplicable a una amplia gama de los nanomateriales, en la medida en que son capaces de absorber (y / o difusión) con suficiente fuerza a la luz.

Introducción

Durante las últimas décadas, el lugar de las nanopartículas ha ganado en importancia en una amplia gama de aplicaciones. En particular, los nanotubos de carbono (CNT) se exploran cada vez más como nanoherramientas para diversas aplicaciones diagnósticas y terapéuticas; gracias a sus particulares propiedades eléctricas, térmicas y espectroscópicas, los CNT pueden actuar como vehículos de administración de diversos fármacos o agentes de contraste, o también pueden participar en la ingeniería de tejidos¹.

Sin embargo, las preocupaciones sobre la toxicidad potencial de tales nanomateriales aún están bajo debate, principalmente porque el destino de los CNTs en el organismo sigue siendo muy controvertido. De hecho, hay una falta de métodos apropiados para detectarlos y cuantificarlos en células y tejidos vivos: por ejemplo, se han sugerido técnicas como la espectroscopia Raman, la fotoacústica y la fotoluminiscencia en el infrarrojo cercano, pero cada método muestra limitaciones según el tipo de nanotubos y/o su entorno^2-8.

Aquí, el método propuesto podría ser aplicable para la detección y cuantificación de nanopartículas en células. Esto fue posible gracias al uso de ImageStream, un dispositivo que combina citometría de flujo e imágenes de alta resolución. Combina las ventajas de adquirir una gran cantidad de celdas (hasta 5000 eventos/seg) y los beneficios de los datos estadísticos y las imágenes de alta resolución de cada celda al mismo tiempo (resolución espacial de 0,5 μm). Generalmente, las imágenes se recopilan utilizando una cámara CCD y son una representación bidimensional en escala de grises de la célula. La luz se cuantifica para cada píxel de la imagen e identifica tanto la intensidad como la ubicación de la fluorescencia o de los componentes con un tamaño subcelular (en BF, por ejemplo), lo que permite una poderosa capacidad para discriminar las células en función de su apariencia^9,10.

El objetivo era diseñar un método de nanometrología que permitiera una evaluación cuantitativa de la distribución y el comportamiento de los CNTs en las células. En particular, este método se desarrolló para estudiar la absorción, el procesamiento y la exocitosis celular de los CNT por parte de las células. Evidenciamos, en primer lugar, el complejo tráfico celular de CNTs y, en segundo lugar, la transferencia de estos nanomateriales entre células: los CNTs internalizados escapan de sus células huésped cuando están estresados, se diseminan en el espacio extracelular y son reinternalizados por células naif, ya sean homotípicas o heterotípicas¹¹

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Un estudio previo mostró que podrían ocurrir diferentes mecanismos de absorción celular, ya sean activos o pasivos, dependiendo de la funcionalización de CNT y el estado de agregación¹². Aquí, los CNT de pared múltiple se funcionalizaron a través de cicloadición y amidación 1,3-dipolar y luego se derivatizaron con una sonda fluorescente, fluoresce en isotiocianato (FITC). En la microscopía electrónica de transmisión, parecen ser internalizados por las células, ya sea individualmente con localización citosólica o como haces, que se encuentran principalmente en los compartimentos endosomales y lisosomales¹¹. En ImageStream, los CNT agrupados aparecen con una alta correlación como manchas oscuras en BF y puntos brillantes en DF, lo que permite una distinción clara entre las células marcadas con CNT y las células de control. Por otro lado, la distribución de la señal fluorescente emitida por el marcador fluorescente funcionalizado con CNTs no estaba tan bien colocalizada: de hecho, probablemente debido a un fenómeno de extinción, las manchas fluorescentes verdes no coinciden necesariamente con las manchas en BF y DF. Esto indica que, en primer lugar, una sonda fluorescente no es obligatoria para la detección de CNTs con el ImageStream, y en segundo lugar, a fortiori, que no es totalmente representativa tanto para la cuantificación como para la localización de CNTs.

Más allá de proporcionar una cuantificación relativa estadística de las nanopartículas, este método también proporciona información sobre la localización de los CNTs en las células, lo que significa que discrimina, por ejemplo, los CNTs en el interior de la célula frente a los que están unidos a la membrana plasmática. La capacidad de localizar CNTs en imágenes celulares supera claramente la limitación del análisis convencional de citometría de flujo¹³. El procedimiento se desarrolló aquí mediante la creación de máscaras que se ajustan a regiones específicas de la célula y seleccionando también las manchas oscuras correspondientes a los CNT cargados.

En términos generales, este método podría aplicarse a una amplia gama de experimentos que impliquen la necesidad de visualización, o cuantificación, en células con la condición de que las nanopartículas utilizadas sean capaces de absorber (y/o dispersar) fuertemente la luz.

Protocolo

1. Preparación de Nanotubos de Carbono Dispersables en Agua (CNTs)

1. Dispersar primero los CNT en agua de cultivo celular, antes de sonicarlos durante 20 min en un sonicador de agua de baño a 20 °C. Si los CNT se funcionalizan con una sonda fluorescente, protéjalos tanto como sea posible de la luz durante todo el experimento.

2. Etiquetado de células con CNTs

1. Cultive células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) (por ejemplo) en placas de 25 cm² en medio DMEM, que contengan un 10% de suero fetal bovino y un 1% de estreptomicina de penicilina.
2. Preparar soluciones de CNTs a concentraciones de 0, 10, 20 y 50 μg/ml en medio completo e incubar las células a 37 °C durante 20 h o a 4 °C durante 20 h (2 ml de suspensión de CNT para una placa de 25 cm²).

3. Fijación celular

1. Retire el medio de incubación después; enjuague las células con PBS, tripsinícelas y vuelva a suspender las células en medio DMEM completo. Centrífuga durante 5 min a 1.200 rpm.
2. Reemplace el medio primero por paraformaldehído al 4% durante 1 hora a 4 °C, luego por PBS para conservarlos. Si es necesario, las células se pueden almacenar en esta etapa del proceso a 4 °C durante varios días hasta el análisis por citometría.
3. Cada muestra debe contener alrededor de 10⁶ células concentradas en 50 μl de PBS. Suspenderlos correctamente para evitar agregados durante el análisis y filtrarlos a través de un tintor de malla de 50 μm.
   Nota: Cada paso debe realizarse con mucha suavidad para preservar las células.

4. Adquisición de ImageStream

Utilice el citómetro de flujo de imágenes multiespectrales ImageStream para adquirir imágenes de células.
Hay que respetar algunos puntos:

1. Seleccione un aumento adaptado (aquí se utiliza un objetivo de 40X).
2. Si se utilizan fluorocromos:
   - Preparar una muestra de control sin fluorocromo.
   - Prepare las células con un control positivo de un solo color para cada fluorocromo utilizado en
   además de sus muestras.
3. Utilice el láser de 488 nm para excitar el FITC y el canal 02 para recoger la emisión de fluorescencia (paso de banda 480-560 nm). Además, utilice también los canales 01 y 06 para el campo claro (BF) y el campo oscuro (DF) respectivamente.

5. Post Procesamiento - Software de Análisis IDEAS (Versión 4.0)

1. Entre todos los eventos adquiridos, el análisis debe restringirse primero a la población de celdas individuales: utilice un diagrama de puntos biparamétrico que represente la "relación de aspecto" (es decir, ancho/alto) frente al "área de celda" (parámetros aplicados a las celdas en BF) (Figura 1). Las células individuales incluidas en la región de interés con un área estándar y una relación de aspecto cercana a 1 se distinguen de eventos multicelulares (área grande y relación de aspecto pequeña) y escombros (área extremadamente pequeña).
2. Para seleccionar celdas en el plano enfocado, utilice un diagrama de puntos biparamétrico adaptado para celdas marcadas con CNT altamente contrastadas: trace el 'contraste' frente al 'gradiente RMS' (que mide la calidad de nitidez de una imagen) en la imagen BF: permite la exclusión de celdas desenfocadas que muestran un gradiente rms bajo y un contraste bajo en sus imágenes BF (Figura 1).
3. 1. Determine el parámetro que proporciona la mejor separación estadística entre las celdas etiquetadas y no etiquetadas mediante el uso de la opción "encontrar la mejor característica". En nuestro estudio, la característica media del objeto de píxel es el parámetro más adecuado (Figura 2).
   2. Traza un histograma utilizando este parámetro en comparación con la frecuencia normalizada para comparar la cantidad de CNTs absorbidos para las concentraciones probadas (Figura 3).
   3. Trazar el gráfico biparamétrico 'mean pixel object on BF' (Notación: Mean Pixel_Object (M01,Ch01,Tight)_Ch01) frente a 'intensity on DF'(Intensity_MC_Ch06), con el fin de estudiar la correlación entre estos dos parámetros (Figura 4).
4. La cuantificación también se valora mediante mascarillas:
   1. Dado que los CNT aparecen como puntos oscuros fuertemente absorbentes en BF, primero cree una máscara de umbral que se ajuste a ellos con precisión seleccionando un rango restringido de píxeles con una intensidad baja comprendida entre 0-533 en este estudio (Máscara 1, notación: Intensidad (M01, BF, 0-533)) (Figura 5). La elección de la intensidad umbral se realiza en celdas marcadas en comparación con las celdas de control.
   2. Por el contrario, cree también una máscara que se ajuste a los píxeles de alta intensidad (150-4095 en este caso) del DF (Máscara 2, notación: Intensidad (M06, DF, 150-4095)) (Figura 6).
   3. Traza un gráfico usando el área de la máscara (ya sea 1 o 2; (notación: Area_Intensity(M01, BF, 0-533)para la mascarilla 1): proporcionará una cuantificación relativa de la internalización de CNTs a diferentes concentraciones (Figura 7).
   4. Compruebe el grado de correlación entre estas dos máscaras (gracias al gráfico biparamétrico 'área de la máscara 1' frente a 'área de la máscara 2') (Figura 7).
5. Cree otras máscaras para localizar CNT en celdas:
   1. Una máscara que se ajusta al interior de la celda: Erode (M01, 7) - correspondiente a la máscara de toda la celda (M01) (Figura 8), que se erosiona aún más de 7 píxeles (Figura 9).
   2. Una máscara que se ajusta a la membrana solo usando la ecuación booleana: M01 y no Erode(M01,7) - máscara de toda la célula (M01) sustraída del interior (Erode(M01,7)) (Figura 10).
   3. Para considerar los píxeles oscuros en la membrana (correspondientes a los CNT), cree entonces la máscara: Intensidad(M01 y no Erode(M01, 7), BF, 0-533) (Figura 11).
   4. Visualice las diferentes máscaras aplicadas en una colección de celdas para verificar su relevancia (Figura 12) para celdas etiquetadas y no etiquetadas.
   5. Aplique el área característica en la máscara seleccionando los píxeles negros en la membrana 'Area_Intensity(M01 and not Erode(M01, 7), BF, 0-533)' llamada área negra. Permitirá la cuantificación de los CNTs en la membrana.
      
      Para discriminar finalmente los CNTs que han sido internalizados de los adsorbidos solo en la membrana, trace el área negra en la membrana frente al área negra en toda la célula (es decir, 'Area_ Intensidad (M01 y no Erode(M01, 7), BF, 0-533' versus 'Area_ Intensidad (M01, BF, 0-533)').
      
      nota: El mismo tipo de procedimiento se aplica con la señal fluorescente FITC: comparar el aumento de la intensidad de la fluorescencia FITC frente a la disminución de la señal media del píxel en el BF, o la colocalización entre las manchas oscuras en el BF y la intensidad de la fluorescencia FITC. En nuestro caso, este tipo de análisis no es relevante porque la señal de fluorescencia no coincide correctamente con las manchas oscuras en BF, por un lado, y con el campo claro en DF, por el otro, lo que demuestra que las propiedades intrínsecas de los CNTs (absorbancia y dispersión de la luz) son más apropiadas que la señal relacionada con la sonda de fluorescencia.
6. Una vez que se hayan creado todos los gráficos en una condición experimental, cree una "plantilla de informe estadístico", guarde la plantilla como archivo .ast y agrupe todos los archivos de datos.

Resultados

En la Figura 1 se ofrece una descripción general del principio del dispositivo ImageStream. Produce múltiples imágenes de alta resolución de cada célula en flujo, incluyendo campo claro (BF), campo oscuro (DF o luz dispersada lateralmente) y canal de fluorescencia, como se ejemplifica en la Figura 2 con tres células diferentes marcadas con CNT. También se muestran las superposiciones de estos canales, que a primera vista ilustran la correlación.

Dado que todo el análisis de posprocesamiento se basa en imágenes celulares, la selección de las células enfocadas es crucial para el estudio (Figura 3). De hecho, la presencia de CNTs induce cambios tanto en el contraste como en el gradiente en comparación con las células no marcadas: las células enfocadas, que han internalizado una cantidad importante de CNTs, tienden a tener un gradiente rms bajo (que suele ser el único parámetro utilizado para la discriminación de las células enfocadas frente a las no enfocadas) pero también un contraste importante, lo que explica por qué un gráfico biparamétrico es esencial. En la Figura 3 se muestra la discriminación entre celdas desenfocadas (área amarilla) versus enfocadas (área azul).

Las CNT internalizadas por células se distinguen claramente, particularmente en BF que aparecen como manchas oscuras fuertemente absorbentes (ver el efecto de la concentración de etiquetado diversa, Figura 4). Además, se analizó la señal media de píxeles en BF, dando una cuantificación relativa de la absorción: los gráficos de la Figura 5 muestran su aumento significativo con la concentración de marcado CNT (resultados para alrededor de 7.000 células por condición experimental).

En segundo lugar, la cuantificación de CNTs también es posible mediante el uso de máscaras, aplicadas ya sea en un rango restringido de píxeles oscuros del BF o en el píxel de alta intensidad del DF (ver ejemplos en la Figura 6), correspondientes a los puntos resultantes de la presencia de CNTs. Por lo tanto, el trazado del área de estas máscaras permite resaltar y aumentar la absorción (ejemplificado en la Figura 7 con el área de la máscara en BF, seleccionando píxeles que van de 0 a 533).

Además, la correlación entre las manchas en BF y DF se puede evaluar trazando la intensidad de DF frente a la señal de píxel media de BF (como en la Figura 8) (análisis independiente de la máscara) o el área de la máscara en BF (Máscara 1) frente al área en DF (Máscara 2).

Con respecto al procedimiento creado para la localización de CNTs dentro de las células, la Figura 9A muestra las diferentes máscaras que se crearon. Tenga en cuenta que la solidez de las máscaras de localización (basada en la erosión de la máscara de celda predeterminada) debe comprobarse visualmente en una colección de celdas etiquetadas y sin etiquetar. Se utilizan las mismas mascarillas para todas las muestras.

El trazado del área total de manchas negras en la membrana celular frente a la de toda la célula proporciona una puntuación de internalización para las células que han sido incubadas durante 20 horas a 37 °C en comparación con la incubación de 2 horas a 4 °C (ver Figura 9B); indica que los CNT se localizan principalmente en la membrana a 4 °C, mientras que a 37 °C los CNT se internalizan en más del 90% de las células.

Por último, en lo que respecta a la fluorescencia, este parámetro no se utilizó como indicador para la cuantificación de CNTs debido a una correlación demasiado baja entre las manchas fluorescentes y las manchas en BF (y DF). De hecho, la correlación entre la intensidad del FITC y el píxel medio del campo claro indica un coeficiente de correlación de Pearson de -0,2. En la Figura 10 se ilustran dos casos en los que la señal de fluorescencia coincide correctamente o no con el punto negro de campo claro.

Figura 1. El sistema de imágenes multiespectrales adquiere hasta 12 imágenes/célula en tres modos diferentes: campo claro, campo oscuro y fluorescencia. La configuración consta de 5 láseres de excitación, incluidos 405, 488, 560 y 658 nm. La luz se recoge de las células que fluyen en la cubeta con diferentes lentes de objetivo (en este estudio, se utilizó la lente de objetivo de 40X) y se transmite al elemento de descomposición espectral, que consiste en un conjunto de filtros de paso largo en una matriz angular. La cámara CCD que recoge imágenes de células se utiliza mediante una técnica llamada integración de retardo de tiempo para evitar el rayado de la imagen. La profundidad de campo extendida (EDF) es una opción.

Figura 2. Galería de imágenes de células marcadas con nanotubos de carbono (50 μg/mL) capturadas por ImageStream a través de diversos canales (campo claro (BF), campo oscuro (DF), fluorescencia (FITC) y sus superposiciones). Los CNT confinados dentro de los lisosomas intracelulares aparecen como grandes manchas negras en imágenes de campo claro. Por el contrario, crean puntos brillantes en el campo oscuro y en las imágenes de fluorescencia.

Figura 3. Selección de celdas enfocadas. El diagrama de puntos bivariado que representa el gradiente de raíz cuadrática media (rms) frente al contraste en imágenes BF permite la exclusión de celdas desenfocadas. Aquí, el área amarilla representa las celdas desenfocadas, mientras que las celdas enfocadas se representan en azul. Las células desenfocadas se caracterizan por un bajo contraste y un bajo gradiente rms en la imagen de campo claro. Además del gradiente rms, la función de contraste es necesaria para discriminar las celdas enfocadas después de su etiquetado con CNT.

Figura 4. Absorción de CNTs dependiente de la dosis visualizada por ImageStream. El número y el área de manchas negras en las imágenes de campo claro aumentan con la dosis de CNT durante la incubación con células (que oscila entre 0 y 50 μg/ml). Tenga en cuenta que las celdas de control están desprovistas de puntos negros.

Figura 5: Cuantificación relativa de la absorción de CNT basada en las imágenes de campo claro. Los histogramas de la característica del píxel medio aplicada al "objeto" de la máscara con toda la celda muestran claramente un comportamiento dependiente de la dosis, que se puede utilizar para la cuantificación. El rango R9 encierra las celdas CNT positivas.

Figura 6: Creación de máscaras seleccionando puntos negros en BF y puntos brillantes en imágenes DF. Dado que los CNT aparecen como manchas oscuras fuertemente absorbentes en la imagen BF, se crea una máscara de umbral para seleccionar un rango restringido de píxeles con una intensidad baja comprendida entre 0-533 en este estudio (Máscara 1, notación: Intensidad(M01, BF, 0-533)). Por el contrario, se utiliza una máscara que se ajusta con los píxeles de alta intensidad (150-4095 en este caso) en la imagen DF (Máscara 2, notación: Intensidad (M06, DF, 150-4095)) para seleccionar el punto brillante en DF, correspondiente a las áreas de alta dispersión.

Figura 7. La absorción de CNTs dependiente de la dosis se demuestra mediante la cuantificación del área de la mancha negra en las imágenes de BF. Utilizando la máscara umbral (mascarilla 1) aplicada en BF, se puede cuantificar el área de puntos negros para cada célula, mostrando una distribución dependiente de la dosis.

Figura 8. Se correlacionan los métodos de cuantificación de CNT basados en imágenes BF (absorción) y DF (dispersión). A la izquierda, el píxel medio de la imagen BF frente a la intensidad en la imagen DF muestra una buena correlación para las células marcadas con CNTs (50 μg/ml) (coeficiente de correlación de Pearson r = -0,68). A la derecha, área de la mascarilla que se ajusta a las manchas oscuras en BF frente al área de la mascarilla que se ajusta a los puntos brillantes en DF para las células marcadas con CNT (50 μg/ml). El coeficiente de correlación de Pearson es r = -0,83.Se trazan los valores de 7.000 celdas.

Figura 9: Localización de CNT en células mediante mascarillas específicas. (A) Las máscaras se crean para adaptarse a una ubicación particular de la célula, es decir, de izquierda a derecha: toda la célula, solo la membrana y el interior de la célula. Otra máscara se adapta a los puntos negros gracias a un umbral de intensidad (Máscara 1, notación: Intensidad(M01, BF, 0-533))). (B) La evaluación de la localización de CNTs se puede obtener midiendo el área de puntos negros en diferentes localizaciones de las células utilizando las máscaras de localización descritas en A. La incubación con CNTs (50 μg/ml) se realizó tanto a 37 °C como a 4 °C para inhibir la vía de internalización. El gráfico que representa el área negra en la membrana frente al área negra en toda la célula muestra una absorción dependiente de la dosis de CNT en la membrana a 4 °C, mientras que la internalización completa de CNT es efectiva a 37 °C.

Figura 10. Colocalización de manchas negras inducidas por CNT en BF con manchas brillantes de fluorescencia en la imagen FITC. Los puntos brillantes de fluorescencia no siempre están colocalizados con los puntos negros de BF. Coinciden correctamente para las dos primeras celdas que se muestran, pero no para las dos últimas.

Discusión

1. Modificación y solución de problemas

En este estudio, el primer objetivo fue evaluar la cantidad y la localización de los CNT en las células. La microscopía confocal podría haber sido a priori el método de oro para evaluar la distribución intracelular de los CNT funcionalizados con el marcador fluorescente FITC^8,14. Sin embargo, el principal inconveniente es la limitación de las imágenes unicelulares y, por lo tanto, la falta de datos estadísticamente relevantes. El ImageStream permite trabajar más allá de estos obstáculos: de hecho, al examinar un gran número de células (5.000-10.000) en poco tiempo (

En comparación con la citometría de flujo convencional, la ventaja única de ImageStream es proporcionar imágenes multiespectrales de cada célula y una comparación píxel por píxel de la intensidad de la señal. Por lo tanto, ImageStream combina el poder estadístico de la citometría de flujo de alto rendimiento con las ventajas analíticas de las imágenes confocales para cada célula analizada. Es crucial para una cuantificación y localización relativa sin etiquetas de los CNT en las células.

2. Pasos críticos dentro del protocolo

El paso crítico consiste en la elección de los parámetros más adecuados para cada estudio. En nuestro caso, la mejor manera fue basar el análisis en las propiedades de absorción y dispersión de los nanotubos: la buena correlación entre la localización de las manchas oscuras en BF y los puntos brillantes en DF respalda que el método desarrollado es relevante y confiable, y puede que no haya sido posible sin imágenes celulares.

3. Limitaciones de la técnica

Debe enfatizarse que la visualización de los CNT en las células fue posible solo porque tienden a acumularse en las vesículas intracelulares endosomales y luego aparecen como fuertes puntos de absorción y dispersión. Los nanotubos individuales no deben detectarse con este método, mientras que eventualmente podrían detectarse con fluorescencia, lo que constituye una clara limitación. En segundo lugar, la cuantificación no es "absoluta" sino relativa para diferentes concentraciones de etiquetado y en comparación con las células de control no marcadas. Algunas características cuantitativas (píxel medio, intensidad, etc.) son parámetros absolutos, mientras que otras dependen de la elección de las máscaras (máscara de umbral, máscaras de localización).

4. Importancia con respecto a los métodos existentes

En lo que respecta a la fluorescencia, el análisis de ImageStream destaca la mala colocalización de los grupos de CNT entre la señal brillante FITC y los puntos en los otros canales. Por lo tanto, parece que la fluorescencia no fue un indicador confiable para la cuantificación y localización de CNT. Sin embargo, superando la limitación de la citometría de flujo convencional, que se basa principalmente en la cuantificación de fluorescencia, el ImageStream multiespectral de alto rendimiento allana el camino para una cuantificación estadística sin etiquetas , al tiempo que proporciona la localización de nanotubos de carbono dentro de las células.

5. Aplicaciones futuras

Este método de nanometrología estadística de alto rendimiento podría generalizarse a cualquier nanomaterial, que muestra una alta absorción y dispersión de la luz al interactuar con las células. Por lo tanto, puede tener aplicaciones importantes para las investigaciones de la nano-bio-interfaz, la nanotoxicología y la nanomedicina.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ImageStream	Amnis