Las muestras de prueba para optimizar STORM Super-Resolución de Microscopía

Summary

Se describe la preparación de tres muestras, y cómo pueden ser utilizados para optimizar y evaluar el desempeño de los microscopios TORMENTA. El uso de estos ejemplos nos muestran la forma de adquirir los datos en bruto y luego procesarla para obtener imágenes de super-resolución en las células de aproximadamente 30 a 50 nm de resolución.

Abstract

STORM es una técnica de microscopia de super-resolución de reciente desarrollo con hasta 10 veces mejor resolución que las técnicas de microscopía de fluorescencia estándar. Sin embargo, como la imagen se adquiere de una manera muy diferente de lo normal, mediante la creación de una molécula de molécula-por-imagen, hay algunos desafíos significativos para los usuarios para tratar de optimizar su adquisición de la imagen. Con el fin de ayudar a este proceso y obtener una visión más clara de cómo funciona STORM presentamos la preparación de 3 muestras de prueba y la metodología de adquisición y procesamiento de imágenes STORM super-resolución con las resoluciones típicas de entre 30 a 50 nm. Mediante la combinación de las muestras de ensayo con el uso del software de procesamiento de tormenta libremente disponible, es posible obtener una gran cantidad de información acerca de la calidad y la resolución de la imagen. El uso de estos indicadores es entonces posible para optimizar el procedimiento de imagen de la óptica, para la preparación de muestras, selección de colorantes, condiciones del tampón y los ajustes de adquisición de imágenes. Tenemos unmuestran ejemplos de lso de algunos problemas comunes que dan lugar a la mala calidad de imagen, como la deriva lateral, donde los movimientos de la muestra durante la adquisición de imágenes y la densidad relacionadas problemas derivados del fenómeno 'mislocalization'.

Introduction

Recientemente se han desarrollado una serie de técnicas de microscopía óptica, normalmente se conoce como microscopia de super-resolución o nanoscopía, que puede pasar por alto el límite de difracción y generar imágenes con resoluciones de 100 nm o mejor ^1,2. Desde el anuncio de super-resolución de la microscopía como el método de Nature Methods del año en 2008, ha habido un gran desarrollo de los microscopios basados ​​en la localización. Por ejemplo, hay aplicaciones multi-color de ^{3-6, 7-12} implementaciones 3D, y aplicaciones de células incluso en vivo ^5,13-17. Por otra parte, ya que estos sistemas están siendo comercializados y ahora están haciendo su manera de salir de los laboratorios de óptica en manos de los biólogos celulares no es probable que sea un nuevo aumento en su uso y aplicación a las cuestiones biomédicas.

Una rama de esta familia son los métodos basados ​​en la localización que trabajan por la construcción de una molécula de molécula-por-imagen. Yoorden n para hacer esto, la mayoría de las moléculas fluorescentes dentro de la muestra se debe desconectar de manera que sólo unas pocas moléculas separadas espacialmente-están activos en un momento dado. Estas moléculas se conmutan a continuación, rápidamente del apagado y se toman muchas imágenes de manera que una parte significativa de la población se forma la imagen para reflejar la estructura subyacente con precisión de sub-difracción. Un número de enfoques han sido publicados incluyendo GSDIM ^18, PALM ^19, fPALM ^20, STORM ²¹ y RESOLFT ^22. Los algoritmos que miden la posición de una sola molécula de detección se pueden utilizar para localizar la posición real de la molécula con precisiones mejores que 20 nm utilizando apropiado gaussiana ^23, por ejemplo rapidSTORM ^24,25 QuickPALM ^26, palm3d ¹² y tormenta de lluvia ^27. Cuando imágenes de células u otras muestras biológicas, que tienen una alta densidad de molécula, que por lo tanto es necesario tener muchos miles de marcos deEl parpadeo, espacialmente separada, de la señal con el fin de imagen una proporción significativa de las moléculas marcadas.

Microscopía estocástico reconstrucción óptica (TORMENTA) y el dSTORM altamente relacionados y métodos GSDIM son métodos de super-resolución basada en la localización, que se han demostrado para trabajar con tintes orgánicos disponibles en el mercado ^21. Desde entonces, han demostrado ser aplicable a un número de diferentes colorantes ^28-30, lo que hace que la metodología particularmente atractiva debido a la especificidad y la comodidad relativa de enfoques immunolabeling bien establecidos para llevar a cabo la microscopía de fluorescencia. En consecuencia, no es fácil acceso a una amplia gama de conjugados colorante-anticuerpo-colorante y biomolécula, que tienen el potencial de ser utilizado en formación de imágenes de super-resolución basada en la localización. Mientras que los principios generales de la tormenta y enfoques similares son relativamente simples, ya primera vista la preparación del hardware y de la muestra parecen relativamente straightforward, hay una serie de pasos en el proceso que son críticos para el logro de alta calidad, libres de artefactos, imágenes de super-resolución.

Al igual que con todas las técnicas de microscopía el proceso se puede considerar en 3 pasos principales: primero, la preparación de muestras, segundo, la adquisición de imágenes y, tercero, procesamiento de imágenes y / o análisis de imágenes y la interpretación. El poder de resolución adicional y método de generación de imágenes de super-resolución utilizando un enfoque basado en la localización introduce algunos nuevos problemas y consideraciones ^31-33. A partir de la preparación de la muestra, cuando se realiza inmunomarcaje, particularmente inmunofluorescencia indirecta cuando se utiliza una combinación de anticuerpos primaria y secundaria, hay que señalar que el colorante fluorescente puede ser de hasta 20 nm de distancia de la molécula de interés. En el caso de los microtúbulos, esto se traduce en diámetros de 35-50 nm en comparación con un diámetro de microtúbulos esperado de 25 nm ^28,30. Además, la densidad de etiquetado debe mEEG, el criterio de Nyquist a fin de generar una imagen de alta calidad ^14. Por ejemplo, para una resolución de imagen prevista de 20 nm a lo largo de una estructura filamentosa no debe haber una molécula de colorante por lo menos cada 10 nm ^27. Mientras que muchos colorantes se han publicado a trabajar para los enfoques basados ​​en la localización de los resultados globales del colorante es una mezcla de por lo menos cuatro criterios importantes, a saber, los fotones detectados por evento de conmutación (el brillo de cada parpadeo - más brillante es mejor), el equilibrio en -off ciclo de trabajo (la relación de contraste de tintes en el off contra el Estado - más fuera es generalmente mejor), la fracción de supervivencia (una tasa de blanqueo bajo es mejor) y el número de ciclos de conmutación (el número de parpadeos por fluoróforo - más es mejor para alta resolución, aunque 1 parpadeo por fluoróforo puede ser una ventaja para los propósitos de recuento de molécula). La situación se complica aún más por el hecho de que estas propiedades para cualquier tinte dado pueden variar en diferentes condiciones de tampón ycon ^28,29 potencia del láser. Además, así como estas consideraciones STORM únicas, la calidad de imagen puede mejorarse mediante la optimización de la preparación de muestras de la misma manera como técnicas de microscopía de fluorescencia más tradicionales, por ejemplo, reduciendo al mínimo la autofluorescencia por modificación de las condiciones de fijación y el uso de reactivos de enfriamiento. También, minimizando fluoróforos unidos de forma no específica es importante, lo que puede hacerse mediante el ajuste de las concentraciones de etiquetas, los tiempos de incubación y etapas de bloqueo y lavado.

El segundo paso de adquisición de la imagen también es crítica. Los ajustes óptimos en el microscopio dependerán del colorante, condiciones de tampón, la densidad de etiquetado, y el tipo de muestra, por ejemplo, monocapas sobre el vidrio, células o muestras de tejido. Las principales consideraciones son el tiempo de exposición de la cámara, número de cuadro, ángulo de iluminación (TIRF, HILO, Epi) y la potencia del láser. El objetivo es recoger la mayor cantidad de brillantes parpadeos separados espacialmente lo más rápido posible. Si el fondo is muy altos o los parpadeos no son muy brillantes, en otras palabras, la relación señal a ruido es pobre, el algoritmo de reconstrucción no será capaz de localizar las posiciones con la mayor precisión. Así como maximizar la precisión de localización, es decir, la precisión con la posición de cada molécula se puede medir, calidad de la imagen depende también de un elevado número de localizaciones. Si son expuestas un número insuficiente de las moléculas de interés, ya sea debido a la falta de etiquetado de eficiencia, fotoblanqueo excesiva o un número de cuadro inadecuada, entonces la imagen de super-resolución resultante será punteada y discontinua ya que no se han cumplido los criterios de Nyquist ^14,27 .

Y, por último, el tercer paso, el procesamiento de imágenes, es particularmente importante en comparación con técnicas de microscopía de fluorescencia estándar. Hay una variedad de forma libre y comercialmente disponibles algoritmos, que es a la vez una ventaja, en términos de elección, y una desventaja, ya que puede ser confuso saber which es el más apropiado para usar. Si, por ejemplo, los datos en bruto tiene bien espaciados espacialmente distintas parpadea entonces un algoritmo de ajuste de una sola molécula puede ser muy precisa y eficiente, por ejemplo, por los algoritmos de ajuste escasos disponibles en Rainstorm ^27, rapidSTORM ^24,25, palm3d ¹² y el software QuickPALM ²⁶ . Si los datos en bruto contiene una gran cantidad de superposición de señales a continuación algoritmos que pueden ser más apropiado incluir DAOSTORM ^{34, 35} y 3B deconSTORM ^36. Por otra parte, estos algoritmos contienen umbrales para diversos criterios tales como recuentos de señal, o fotones por abrir y cerrar, así como distintas opciones de visualización de imágenes diferentes, tales como la visualización con funciones gaussianas suavizadas o como histogramas con rejillas de píxel, donde el tamaño de píxel de super-resolución puede ser seleccionado por el usuario. Todas estas opciones de cambiar el aspecto de la imagen final y tienen implicaciones para la interpretación y análisis de imágenes.

Por lo tanto, presentamos 3 muestras de prueba que constituya el nuevo usuario con un punto de partida para los experimentos a base de colorantes basados ​​en localización de super-resolución, que en aras de la claridad, nos referiremos como tormenta, y los usuarios más experimentados, la oportunidad de optimizar aún más sus experimentos. En primer lugar, es posible recubrir la superficie de vidrio con una capa fluorescente de dextrano-colorante conjugado. Esto proporciona una forma rápida y simple para establecer que el microscopio, tinte y tampón están trabajando para generar el parpadeo de la señal fluorescente. El método puede ser extendido mediante la comparación de las métricas media de precisión de localización y número generados por temporal de lluvia para optimizar las condiciones de tampón, la configuración de adquisición de imágenes y probar diferentes tintes. En segundo lugar, se presenta un protocolo sencillo para la preparación de los filamentos de actina en el vidrio que puede ser etiquetada fácilmente utilizando conjugados phalloidin-dye. Estos proporcionan estructuras ideales para tomar mediciones de la resolución ²⁷ y por lo general el ancho medio máximo (FWHM)de un filamento se da como una estimación empírica de la resolución ^37. Cabe señalar que la resolución varía entre las muestras y entre las imágenes dentro de la misma muestra porque la resolución en super-resolución de la microscopía basada en la localización es una función del brillo fluoróforo, ruido de fondo y la densidad de localización ²⁷ y estos no son necesariamente constantes en todo el espécimen. Los filamentos de actina se utilizan para demostrar posibles artefactos tales como mislocalizations y la deriva y cómo pueden ser identificadas con las características del software dentro de tormenta. Por otra parte, se describe el uso de marcadores de referencia fluorescentes tanto a medida y la deriva correcta. Y en tercer lugar, se describe la tinción de las células con factor de crecimiento epidérmico (EGF) conjugados de tinte. EGF proporciona un indicador útil de la calidad de la imagen de super-resolución, porque una proporción del receptor en la superficie celular experimenta endocitosis a través de vesículas, que son estructuras de tamaño sub-difracción de aproximadamente 50-150 Nm de diámetro ^27,38,39.

Protocol

Nota: A lo largo de este protocolo, consejos y sugerencias se encuentran siguiendo ciertos pasos. La notación "* 1" indica que la nota 1 es relevante para esta etapa específica, y así sucesivamente.

1. Fluorescente dextrano Revestimiento del Vidrio

1. Añadir 200 l de solución de poli-L-lisina 0,01% a cada pocillo de un cubreobjetos 8-cámara y se incuba durante 10 min. Retirar con una pipeta para asegurar que no es líquido restante.
2. Reconstituir dextrano-Alexa 647 ^{* 1} de acuerdo con las instrucciones del fabricante para crear una solución de 2 mg / ml. A partir de este, diluir 0,25 l en 25 l de agua desionizada para crear una solución de 20 g / ml.
3. Para crear un recubrimiento de alta densidad de dextrano-Alexa 647 solución diluida 20 l de la solución 20 mg / ml en un total de 200 l de agua desionizada. Para una solución de densidad media diluyen 2 l en 200 l de agua desionizada (1:10000 dilución de la solución madre del original). Por un bajosolución diluida de densidad 0,2 l en 200 l de agua desionizada (1:100.000 dilución de la solución madre del original).
4. Añadir 200 l de las diluidas dextrano-Alexa 647 soluciones a cada pocillo e incubar durante 10 min. Tiempos de incubación más largos se pueden utilizar que puede resultar en un revestimiento de dextrano más densa. Quitar y lavar con H ₂ O tres veces ^{* 2}

Nota 1: Otros conjugados de dextrano en colorantes se pueden utilizar. Dextrano no conjugado también puede conjugarse con colorantes combinaciones deseadas si no están disponibles comercialmente.

Nota 2: Las mismas cámaras de dextrano se pueden reimaged durante un período de semanas a pesar de la uniformidad de la fluorescencia puede disminuir. Se recomienda el almacenamiento a 4 ° C en ausencia de cualquier tampón.

2. Fluorescente filamentos de actina sobre el vidrio

1. Añadir 200 l de solución de poli-L-lisina 0,01% a cada pocillo de la cámara y se incuba durante 10 min ^{* 3.} Remover con una pipeta para asegurarse de que ningún líquido se queda.
2. Añadir 90 l de tampón de actina general (reconstituido de acuerdo con las instrucciones del fabricante) a cada cámara. Añadir 10 l de 10 mM preformados solución de filamentos de actina y 1 l phalloidin-Alexa 647 (0,2 unidades, cuando se disuelve en 1,5 ml de metanol, según las instrucciones del fabricante) y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Incubar durante 30 min ^{* 4.}

Nota 3: Incrementar el volumen de la solución de filamento dentro de los resultados de la cámara en un menor número de filamentos de unión al vidrio, recubiertas con poli-L-lisina.

Nota 4: Los tiempos de incubación de hasta 48 horas a 4 ° C se han probado con buenos resultados. Calidad de la imagen de filamentos de actina se deteriora una vez a la cámara de ha sido expuesto a la memoria intermedia de conmutación por lo que no se recomienda el uso de la misma muestra para más de un día.

3. Perlas fluorescentes de microesferas como marcadores Fiducial

1. Diluir 1 l de perlas TetraSpeck en 200 l de PBS y mezclar.
2. Agregue las cuentas diluidas en una cámara de imágenes y esperar 15 min ^{* 5.} Eliminar la solución y lavar 3 veces con PBS antes de la imagen.

Nota 5 - la dilución y tiempo de incubación se puede ajustar para obtener diferentes densidades de perlas. Este protocolo da lugar típicamente entre 3 - 10 granos por 20,5 m x 20,5 m campo de visión.

4. Factor de Crecimiento Epidérmico Marcaje de Células

1. Células de cultivo de HeLa en cámaras de formación de imágenes a aproximadamente 80% de confluencia en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y solución de penicilina-estreptomicina al 1%.
2. Retire el medio de cultivo y lavar con PBS. A continuación, añadir 500 l de solución de 4% de formaldehído (solución 4 ml de formaldehído al 10%, 1 ml de PBS 10X, 5 ml de agua) durante 10 min. Retire el formaldehído y lavar 3 veces con PBS. No permita que las células permanezcan dPBS ry y utilice siempre amortiguada soluciones para evitar el estrés hipotónico.

PRECAUCIÓN - formaldehído es extremadamente tóxico. Asegúrese de que los guantes, protección ocular y batas de laboratorio son usados. Revise las directrices locales para la eliminación de formaldehído.

3. Reconstituir EGF-Alexa 647 de acuerdo con las instrucciones del fabricante para crear una solución madre 50 mg / ml. Añadir 2 l de esta solución madre a 200 l de solución de BSA al 0,1% (en PBS). Retire la PBS de las células, añadir la solución de EGF y se incuba durante 30 min.
4. Retire la solución y lavar 3 veces con PBS antes de la adición de una solución de bloqueo de 0,1% de BSA (en PBS) durante 15 min. Eliminar a esta y lavar 3 veces más con PBS antes de la imagen.

5. Conmutación Preparación Buffer

1. Hacer una solución madre de enzima (A) con 10 l de catalasa (20 g / ml), 20 l de 1 M de Tris clorhidrato de (2-carboxyelthyl) fosfina (4 mM), 2,5 ml de glicerina (50%), 125 lde 1 M de KCl (25 mM), 100 l de 1 M, pH 7,5 Tris-HCl (20 mM), 5 mg de glucosa oxidasa (1 mg / ml) y la parte superior hasta 5 ml de volumen con diH20. Esto es suficiente para hacer 100 x 50 alícuotas, que pueden ser almacenadas a -20 ° C y utilizarse hasta por 1 año.
2. ) Hacer una solución madre de glucosa (B) con 4 g de glucosa (100 mg / ml), 4 ml de glicerina (10%) y 36 ml diH20. Esto es suficiente para hacer 100 x 400 alícuotas, que pueden almacenarse a - 20 ° C y utilizarse hasta por 1 año.
3. Hacer un agente de la solución reductora (C) con 113,6 mg de MEA-HCl (1 M) y 1 ml de diH ₂ 0. Utilice fresco o de 10 x 100 alícuotas, que pueden ser almacenadas a -20 ° C y se utiliza para un máximo de 1 mes (no volver a congelar alícuotas).
4. Justo antes de la proyección de imagen, mezclar la enzima (A), la glucosa (B) y el agente reductor (C) soluciones madre juntos en la proporción de 50 l, 400 l, 100 ly completar hasta 1 ml con PBS ^{* 6.} Este buffer ahora recoger oxígeno y tienen un ambiente reductor (MEA-100 mMHCl) ^{* 7.} El pH final debe estar en el rango de 6.0 - 8.5 (ajuste no es normalmente necesario) ^{* 8.}

Nota 6 - este tampón es adecuado para su uso con colorantes a base de carbocianina tales como Cy5 y Alexa 647.

Nota 7 - las concentraciones de la enzima finales son 50 g / ml (5 unidad / ml) de la glucosa oxidasa y 1 g / ml (40-60 unidades / ml) de la catalasa. La actividad enzimática (unidades) está dada por los proveedores, y puede variar. Los cálculos para la catalasa asumen que 1 mg / ml de concentración final después de la etapa 5.4 contendrá 50 unidades de enzima. Varias composiciones tampón incluyendo componentes eliminación de oxígeno similares se pueden encontrar ^21,30,40. Para un resumen de combinaciones de tampones y de tinte ver referencias ^28,29. La glicerina y TCEP se requieren para el almacenamiento a largo plazo a -20 ° C.

Nota 8 - si los filamentos de actina de imágenes añaden 2 mM MgCl ₂ y 0,2 mM ATP para ayudar a estabilizar tél filamentos.

6. Microscopio Adquisición de Datos STORM (usando Alexa 647 tinte)

1. Encienda el microscopio TORMENTA / PALMA, preferiblemente al menos 3 horas antes de exponer para permitir un equilibrio térmico a ser alcanzado. Imaging antes de que este tiene una mayor posibilidad de deriva.
2. Inserte la cámara de imágenes en el soporte de la muestra platina del microscopio. Asegúrese de que la muestra esté firmemente en su titular y es plana.
3. Retire la PBS de la cámara de imágenes y luego llenar hasta el tope con el búfer de conmutación. Coloque cuidadosamente un cubreobjetos sobre la parte superior de la cámara, asegurándose de que no haya burbujas en absoluto y que la totalidad de la cámara está cubierto. Rellene con tampón PBS adicional o si se ven las burbujas de otra manera a amortiguar el rendimiento puede disminuir.

PRECAUCIÓN - para minimizar las posibilidades de la deriva lateral y axial de la muestra en relación a la lente de objetivo se recomienda que la muestra y el tampón se dejan equilibrara la temperatura ambiente durante al menos 15 min antes de la imagen.

4. Localice una estructura fluorescente de interés para explorar. Seleccionar el ángulo deseado de la iluminación, en este caso, un ángulo TIRF o altamente inclinada se recomienda ya que esto mejora la relación señal-ruido, reduciendo al mínimo la luz fuera de foco, que es particularmente beneficioso para las muestras de células. Tome una imagen de difracción limitada de referencia de la estructura antes de la imagen TORMENTA.
5. Aumentar el láser de excitación (con una longitud de onda de excitación apropiada de aproximadamente 640 nm) y un máximo de potencia, lo que corresponde a aproximadamente 2 kW / cm ^2, mientras que las imágenes con ajustes de la cámara de la exposición 10 ms y un tiempo de ciclo de aproximadamente 50 Hz (cuadros por segundo) . Una vez que los fluoróforos han hecho la transición a un patrón de parpadeo escasa (probablemente dentro de 10 segundos para la mayoría de las muestras) reunir 10.000 marcos ^{* 9.}

Nota 9 - 10000 marcos es adecuado para las muestras descritas aquípero puede ser necesario aumentar el número de trama a 50.000 o más para otras muestras.

7. La reconstrucción de Super-Resolución Imágenes de Raw Data (utilizando temporal de lluvia)

1. Abrir el archivo rainSTORM.m desde dentro de MATLAB y ejecutar (Figura 1A).
2. En la ventana temporal de lluvia (Figura 1B), seleccione el archivo de imagen para ser analizados utilizando el botón Examinar. Esto debe ser un archivo tif. (ImageJ se puede utilizar para convertir otros tipos de archivos en un formato tif). Modificar el ancho de píxel para que coincida con los datos en bruto del sistema de microscopio usado para adquirir los datos ^{* 10.} Deje los demás valores por defecto.

Nota 10 - Una cámara típica EMCCD tiene un tamaño de píxel de 16 micras por lo que en un sistema con un lente objetivo 100X el tamaño del píxel en la imagen será de 160 nm. En los sistemas comerciales el tamaño del píxel está por lo general aparece en el software. Tamaños de pixel varían entre 100 nm y 160 nm para la mayoría de los microscopios de localización.

3. Pulse el botón "Procesar imágenes 'y espere hasta que aparezca una imagen preliminar. La duración del tratamiento dependerá del tamaño del archivo, especificación de equipo y el número de parpadeos candidatos dentro de los datos en bruto ^{* 11.}

Nota 11 - 10000 secuencias de fotogramas de actina y los datos EGF tomaron 23 segundos y 25 segundos para procesar, respectivamente, utilizando un PC con una CPU Intel Xeon E5420. Usando el mismo equipo sin una caja de herramientas de procesamiento paralelo en MATLAB, o con un ordenador sin el procesamiento de múltiples núcleos, los tiempos eran 66 segundos y 81 segundos respectivamente.

4. Para generar una actualización super-resolución de la imagen, pulse el botón 'Open Revisor "y aparecerá una segunda ventana (Figura 1C). Pulse el botón "Ajustar contraste 'con el fin de cambiar la visualización de la imagen como desee (Figura 1D). En algunos casos, donde la imagen es muy oscura el valor máximo debe ser disminuida.
5. Utilice la revdel Visor de ventana (Figura 1C) para generar métricas de calidad de imagen útiles y afinar la imagen de super-resolución más. Ajuste los tres primeros parámetros de control de calidad a los valores de 4000, 0,1 y 0,8-2,0, respectivamente ^{* 12.} Actualice las cuentas por valor de fotones, lo que debería ser, ya sea basado en una medición de calibración de fotones o utilizando valores de la curva de calibración de fotones curva especificados por el fabricante de la cámara para un ajuste de ganancia EM particular. Esto es crítico para la obtención de la precisión exacta y mediciones de resolución ^{* 13.}

Nota 12 - Cuenta de señal parpadea rechaza sobre la base de criterios de brillo. Cuanto más alto sea el valor, más brillante es el parpadeo debe ser aceptado como una localización en la imagen final. Esto puede ser necesario modificar en función de la salida de fotones del colorante y el tiempo de exposición y la sensibilidad de la cámara. Tolerancia rechaza parpadea si hay error cuadrado significativa entre la señal y el empotrado de Gauss es decir, dpicos ouble. PSF Gama Sigma rechaza parpadea si el ancho equipada del PSF se encuentra fuera de este rango, es decir, un rango más estrecho se puede utilizar para rechazar señales fuera de foco y grandes gotas agregadas de fluorescencia constante. El uso de una gama más amplia puede resultar en artefactos mislocalization que aparecen en la imagen final. En la práctica, se recomienda para realizar el control de calidad inicial utilizando el parámetro de corte de precisión de localización.

Nota 13 - Para más información sobre las métricas de resolución de ver referencias ^23,27. En breve conociendo el número de fotones producidos por cada parpadeo es posible calcular la precisión de localización de cada localización y, en consecuencia obtengan el general significa estimaciones de precisión para toda la imagen. El uso de un Andor Ixon DU-897E con un ajuste de ganancia de 200 los Condes por valor Photon es 9.04.

6. Modifique el corte de precisión de localización (Figura 1C) para compensación entre la optimización precis medios de localizacióniones contra el número de localización en la imagen final. Se recomiendan valores de 30-50 nm en función de la calidad de los datos y la muestra. Tanto los histogramas y los archivos Info.txt se pueden utilizar para informar de esta decisión (Figuras 1F y 1G).
7. El factor de escala de reconstrucción (Figura 1C) por defecto es 5, lo que generará píxeles de super-resolución de 32 nm suponiendo que el ancho de píxel de la imagen original es de 160 nm. Si las imágenes en bruto tienen un tamaño de píxel de 100 nm esto producirá imágenes de super-resolución con píxeles de 20 nm. Incrementar el factor de escala para producir más pequeños píxeles de super-resolución de la imagen final ^{* 14.}

Nota 14 - Resolución de la microscopía de localización depende de la alisado requerido para la visualización (es decir, el tamaño de píxel de una sencilla reconstrucción histograma), así como la precisión de localización. En la práctica, el tamaño de píxel de reconstrucción debe generalmente ser más pequeña que la localizaciónprecisión (véase la métrica Mean precisión Estimación en el archivo de texto de información - los pasos 6.11 y 6.12). En este caso, la pérdida de resolución debido al tamaño de la reconstrucción de píxeles será pequeña ^23,27. Por ejemplo, las estimaciones de precisión media en la fila y la columna de dirección de la figura 4E son 16,1 nm y 16,2 nm. Un tamaño de píxel de 16 nm ha sido usado para visualizar estos datos (factor de escala reconstrucción de 10 con un ancho de píxel original de 160 nm).

8. Modificar el intervalo de fotogramas límite (Figura 1C) para restringir la reconstrucción a subconjuntos de los datos en bruto, por ejemplo [2001-inf] excluiría los 2.000 fotogramas iniciales de los datos en bruto.
9. Pulse el botón 'Run Revisor' (Figura 1C) para generar una super-resolución de imagen actualizada (Figura 1E).
10. Pulse el botón 'Ver' Los histogramas (Figura 1C), con el fin de mostrar las métricas de calidad de imagen (Figura 1F) ^{* 15.}

Nota 15 - El gráfico de la parte superior derecha que representa el número de localizaciones aceptadas junto al número de bastidor de la cámara y el histograma Thompson localización Precisiones en la parte inferior derecha (Figura 1F) se puede utilizar para informar a la opción de precisión de localización crítica de corte. Por ejemplo, usando una ley de corte 50 nm excluiría todas las localizaciones con peor precisión que se incluyan en la imagen final de super-resolución.

11. Pulse el botón 'Guardar' en el revisor (Figura 1 C) con el fin de salvar a todos estos datos ^{* 16.}

Nota 16 - Entre 3 y 5 archivos pueden guardarse en función de las opciones seleccionadas (imagen Suma, STORMdataImage, STORMprocessed, información y hists), ver Figura 1G. La imagen procesada STORM se muestra con mapas contraste y color modificados. El STORMdataImage es una imagen en escala de grises, en la que el nivel de gris de cada pixel es igual a la entumecidaer de localizaciones que se identificaron dentro de ella.

12. Después de examinar los datos (por ejemplo Info.txt archivo e histogramas) de retorno al paso 7.6 y repita los pasos subsiguientes con distintos parámetros revisor si se desea. Al presionar 'Guardar' en el paso 7.11 sobrescribe los datos previamente guardados.

8. Seguimiento de la caja y Corrección de la sincronización (con aguacero)

1. Siga los pasos 7.1 a 7.9 para generar una imagen de la forma normal.
2. Pulse el botón 'Tracking Box' en el revisor (Figura 1C) y haga clic y arrastre un cuadro sobre el marcador de referencia o estructura de interés en la imagen revisada.
3. Espere hasta que aparezca una nueva imagen, que mostrará las "Posiciones en caja" (Ver Fig. 6B, 6C y 6F para ver ejemplos). Guarde esta imagen si se desea.
4. Si el objeto de interés es un marcador de referencia a continuación deriva de corrección se puede realizar haciendo clic en el botón 'Set Anchor' seguido por el 'Subbotón Drift vías '. Por último, haga clic de nuevo en "Ejecutar Revisor" para generar una nueva imagen STORM, que tendrá ahora todas las localizaciones corregirse de acuerdo con las posiciones de marcador de referencia. Las posiciones de cuentas se borran de la imagen revisado final.
5. Si hay otros marcadores de referencia dentro de la imagen deriva corregida final, éstos pueden eliminarse pulsando 'Seguimiento de la caja', 'Eliminar en caja "y luego tantas veces' Run Crítico 'si lo deseas.

Results

El dextrano

Un recubrimiento con éxito de dextrano debe producir una monocapa fluorescente. En la alta concentración de este debería aparecer relativamente uniforme. A concentraciones más bajas que aparecerá más escasas (Figura 2A). Muchos microscopios TORMENTA / PALM tienen la capacidad de cambiar el ángulo de la iluminación de epifluorescencia para TIRF. Cuando se utiliza una vista completa de la cámara del marco, por ejemplo, a 512 x 512 píxeles en una cámara típica EMCCD, debe observarse una iluminación uniforme. Si hay rayas o regiones fuera de foco esto puede indicar que la muestra debe ser reinsertado en el soporte de la muestra con aceite nuevo en la lente del objetivo. Alternativamente, puede indicar un problema con el microscopio.

Cuando la adquisición de datos en bruto de super-resolución del láser de imágenes se debe aumentar en poder de aproximadamente 2 kW / cm ^2. Habrá una explosión inicial de la fluorescencia seguido de parpadear como los fluoróforos son accionados ena los estados oscuros temporales. A altas densidades de dextrano los parpadea son probable que se solapen, en particular cerca del comienzo de la adquisición de imágenes (vídeo 1). A densidades medias y bajas parpadea estos deben ser escasa, es decir, espacialmente separada, y en el foco sin fondo obvia (ver marcos de 2,000, 5,000 y 8,000, Figura 2A, Vídeos 2 y 3). Durante esta fase de adquisición de la imagen, en la iluminación de láser constante, el número de parpadeos disminuirá con el tiempo (comparar marco de 2000 con el marco 8000 de la muestra de alta densidad, Figura 2A). La principal diferencia entre las diversas imágenes de super-resolución de las diferentes concentraciones de dextrano (alto, medio y bajo) es la disminución del número de localizaciones (Figuras 2A y 2B). En otras palabras, la concentración de las moléculas fluorescentes, número de parpadeos en los datos en bruto y el número de localizaciones tienen una relación proporcional. Esta relación,sin embargo, no es lineal simple a muy alta densidad de la molécula de software no es capaz de localizar con éxito moléculas (comparar las líneas roja y azul, la figura 2C). La razón de esto es que a la alta concentración que no es posible para el software de procesamiento para adaptarse a las posiciones utilizando el algoritmo de ajuste de Gauss donde los parpadeos no son escasos. Como los parpadea disminuyen a través de la fase de adquisición, debido a photobleaching el software puede ajustarse más y más de los parpadea a medida que se dispersa (Figuras 2A y 2C). Por otra parte, las moléculas de tinte individuales pueden parpadear, y por lo tanto ser localizado más de una vez ^28,41,42.

Un problema común al imaginar ninguna de estas muestras, pero particularmente el dextrano de alta densidad, puede ser la presencia de neblina fluorescente brillante pero fuera de foco que parece estar difundiendo rápidamente durante la fase de adquisición de imágenes TORMENTA. Esto es distinto de los fluoróforos de alto contraste enla superficie del vidrio, que se puede ver a parpadear (Figura 3A, vídeo 5). Estas moléculas fluorescentes separados pueden ser prevenidas o eliminadas por el aumento del número de etapas de lavado con PBS antes de añadir el tampón de conmutación o mediante la adición de tampón de conmutación fresco a la cámara (Figura 3B, vídeo 6). Procesar y comparar los datos de cada imagen de la secuencia resultados en muy diferentes imágenes de super-resolución que tienen una disminución tanto en el número de localizaciones y la precisión con la que pueden ser equipados del software para localizar los parpadea (Figuras 3C, 3D, 3E y 3F).

Los filamentos de actina

Los filamentos de actina preformado puede verse pegado a la superficie del vidrio mediante formación de imágenes de difracción limitada (Figura 4A-4C). Si el número de filamentos aparece muy bajo, a continuación, un tiempo de incubación más largo se puede utilizar o una disminución en el volumen de la actinasolución filamento también ayuda. Selección de filamentos individuales relativamente brillantes (Figura 4D) en lugar de las áreas enredadas resultados en imágenes de mejor calidad. Durante la fase de adquisición, brillantes parpadea en-enfoque deben ser vistos a lo largo de la longitud del filamento (vídeo 7). Parpadeo Sparse debe ser visto durante la fase de adquisición y, posteriormente, en los datos procesados ​​no debe ser un filamento continuo delgada (Figura 4E) y las localizaciones por trama debería una disminución gradual (Figura 4F), a diferencia de en la Figura 3E.

Si el parpadeo es no escaso, o si el software no es capaz de localizar las moléculas, un artefacto más sutil, llamado mislocalization ^32, puede resultar. Esto surge cuando los promedios de software de la posición de dos moléculas de superposición y la localización es la posición a medio camino entre ellos. Una indicación de que no ha habido un número significativo de superposición de BLINKS, y, en consecuencia mislocalizations, es que las estimaciones de las medias de precisión debe ser el mismo en las direcciones de fila y columna, es decir, horizontal y verticalmente; donde hay mislocalizations estos se han producido a lo largo de la longitud del filamento, producen una más grande que abrir y cerrar normal ( es decir extiende sobre más de píxeles), lo que en consecuencia se han localizado con menos precisión en una de las direcciones. Esto se observa más fácilmente cuando hay un solo filamento de actina en la zona de formación de imágenes y que se ha quedado horizontal o verticalmente. En este caso, el microscopio STORM, logra una precisión media de 16 nm en ambas direcciones. Esto resulta en un límite de precisión, una medida de la resolución de imagen efectiva de aproximadamente 34 nm. Estas métricas son proporcionados por aguacero ^{de 27 años,} sin embargo, ya que tenemos una estructura filamentosa de diámetro uniforme, 7 nm con lo muy pequeño phalloidin-Alexa 647 etiqueta podemos tomar una medida de FWHM para estimar la resolución de la imagen. Por draala una línea recta a través del filamento de la imagen de super-resolución en ImageJ (Figura 4G), utilizando la función de perfil de parcela (Figura 4H) y, posteriormente, realizar un ajuste de Gauss (Figura 4I) la FWHM se calcula como 43,2 nm. Al intentar esta medida se recomienda que el tamaño del pixel debe coincidir o ser ligeramente menor que la estimación de la media de precisión de la imagen (véase el archivo info.txt Figura 1G). En este caso, se utilizaron 16 pixeles nm para reconstruir una imagen.

Dos problemas relacionados pueden ocurrir con la tormenta, donde los fluoróforos parpadeo, es decir, se convierten en moléculas individuales no dispersas dentro de aproximadamente 250 nm abrir y cerrar al mismo tiempo y por lo tanto las señales se superponen. La primera es que dependiendo del algoritmo y los criterios de control de calidad que utiliza, los parpadea pueden no estar localizados en absoluto. Esto se traduce en imágenes de super-resolución con pocos o ningún localizaciones. El segundo problema de losmislocalizations se produce cuando las dos parpadeos ocurrieron suficientemente cerca unos de otros para aparecer como un solo parpadeo. En este caso la posición en la imagen final representa un promedio de los dos. Para más detalles sobre esto, véase la referencia ^32. En ambos casos, esto puede ocurrir con muestras de muy alta densidad, potencia del láser insuficiente o con problemas de conmutación de amortiguamiento. Este problema es evidente en un número de filamentos de actina está ramificando y / o se cruzan entre sí (Figuras 5A-D, vídeo 9). Mediante el procesamiento de subconjuntos de marcos, y la comparación de los primeros y últimos 5.000 marcos podemos ver una imagen resultante diferente. En la imagen de super-resolución utilizando los primeros 5.000 marcos (Figura 5C), podemos ver que hay muchas localizaciones en el centro de la imagen, sin embargo cuando se utilizan los últimos 5.000 marcos, muy pocos de ellos son evidentes y nos quedamos con sólo los filamentos, aunque algo discontinuo deber al bajo número de localizaciones en la image (Figura 5D). Si se sospecha de una muy alta densidad de parpadeo comparación de las imágenes con la localización de los datos por frame puede sugerir fuertemente que este problema se está produciendo, y durante la primera serie de fotogramas que hay un número medio de localizaciones por cuadro de más de 10 en comparación con el último conjunto de cuadros en los que es de aproximadamente 4 (Figura 5E). Con el fin de minimizar la probabilidad de mislocalizations ocurriendo es ideal para tener el menor número de localizaciones por trama como sea posible, aunque si hay un gran número de moléculas para formar una imagen, es decir, para una muestra de alta densidad, esto requiere que un gran número de adquisición tomarse marcos que lleva a otro problema en microscopía STORM que es la deriva.

Lateral Drift - filamentos de actina y marcadores fiduciales

Deriva se produce cuando los movimientos de la muestra en relación con la lente de objetivo a través de la fase de adquisición de datos. Esto es difícil o imposible ver During la fase de adquisición de la imagen, particularmente si es lateral en lugar de axial, o a menos que se está midiendo específicamente, ya que es típicamente menos de 50 nm en el transcurso de varios minutos para los sistemas de microscopio relativamente estables. Sin embargo, en las imágenes reconstruidas de estructuras conocidas, tales como los filamentos de actina con estructura bien definida, que puede ser detectada en las imágenes de super-resolución. La primera señal de que la deriva lateral puede haber ocurrido es que la estructura es más grande de lo esperado (Figura 6A, Video 8), por ejemplo, con una proporción relativamente grande FWHM comparación con los datos de límite de precisión de tormenta, en este caso 90 nm en comparación con los 67 nm. Sin embargo, una mejor manera de detectar la deriva es mediante la comparación de las localizaciones como una función del tiempo, es decir, ver si las localizaciones en las tramas posteriores se desplazan en comparación con los primeros marcos. Esto se puede ver claramente en el caso de los filamentos de actina, que son muy pequeñas y de estructura uniforme, cuandomuestra con un código de color utilizando la función de seguimiento de caja en tempestad de la lluvia (Figuras 6B y 6C).

La deriva es un problema bien reconocido y hay un número de estrategias que se pueden utilizar para minimizar el que ¹⁹ o corregirlo posterior a la adquisición, ya sea usando marcadores de referencia ^21,43 o correlaciones cruzadas ^44. Con el fin de medir la deriva y correcta para que, perlas fluorescentes de 100 nm de diámetro se pueden usar como marcadores de referencia (Figura 6D). Debido a que son pequeños y brillantes de su posición se puede medir con precisión el uso de algoritmos de ajuste Gaussianas, como tormenta. En un ejemplo donde hay deriva relativamente severa de aproximadamente 100 nm en el transcurso de 3 min 10 seg, durante la fase de adquisición (Figura 6E), la función de seguimiento misma caja se puede utilizar para el código de color y confirmar ocurrió que la deriva (Figura 6F ). Como las cuatro cuentas de este ejemplo muestran la deriva casi idéntica es posibles para seleccionar uno de ellos, en este caso de talón 2, para usar como referencia y restar la deriva de las otras perlas (Figura 6G). Mediante la adición de marcadores de referencia a una muestra biológica de interés entonces se hace posible medir y corregir cualquier desviación que resulte desconocida o mucho más variables de lo que un filamento de actina o un cordón fluorescente la estructura subyacente.

Factor de Crecimiento Epidérmico

Por último, las células HeLa teñidas con EGF se pueden utilizar para dar un ejemplo realista de resolución de imagen en las células (Figura 7A, Vídeo 10). Estas células son relativamente sencillos de imagen, ya que deben tener la mayoría de la EGF-fluorescencia en el foco plano-de-en la superficie celular en estrecha proximidad con el cubreobjetos. La región menos brillante en el centro de la correspondiente a la posición del núcleo. Iluminación TIRF puede mejorar la calidad de la imagen mediante la eliminación de la fluorescencia fuera de foco procedentes de partes de la célula membrane no en las proximidades del vaso (aproximadamente 150 nm de penetración en las células). zoom en regiones de interés en la imagen de difracción limitada suelen ser indistinta (Figuras 7B y 7C), sin embargo en las imágenes de super-resolución no debe ser una mezcla de de racimos y ocasionales píxeles individuales aisladas (Figuras 7D-7F). Estos se representan a ninguno de los receptores de EGF aislados en la superficie celular o posible una pequeña cantidad de unión no específica. Los grupos serán de aproximadamente 100 nm de diámetro y es probable que corresponden a los hoyos y vesículas que forman, la vía a través de la cual EGF es predominantemente el regulado y endocitosis. Estimaciones de precisión medios típicos que son alrededor de 20 nm para este tipo de muestra con un límite de precisión de aproximadamente 45 nm. Cabe señalar que esta medida límite de precisión de la resolución efectiva no tiene en cuenta el tamaño de la etiqueta, o cualquier deriva, que se puede medir con marcadores de referencia, pero es todavía Noticeable por "colas de los cometas" en las agrupaciones o utilizando la función de seguimiento de la caja como se indica en la figura 6 y se describe en la sección 8 del protocolo.

Componente	Concentración final
La catalasa	1 g / ml (50 unidades)
Glucosa	40 mg / ml
La glucosa oxidasa	50 g / ml
Glicerina	12,50%
KCl	1,25 mM
MEA-HCl	100 mM
TCEP	200 M
Tris	1 mM

Tabla 3. Conmutación tampón

Configuraciones típicas de adquisición	Valor
Pixel Tamaño (nm)
Tiempo de exposición (ms)	10
Ganancia	200
Tamaño de caja (píxeles)	128 x 128
Tiempo de ciclo (fps)	52.5
Número de cuadro	10000
640 nm la densidad de potencia del láser (kW / cm 2)	2

160

Tabla 4. Ajustes de adquisición

Figura 1. STORM Reconstrucción imagen utilizando tormenta. (A) La apertura temporal de lluvia desde dentro de MATLAB. (B) Interfaz gráfica de usuario aguacero (GUI). (C) Rainstorm GUI Revisor. (D) Ajustar ventana de contraste. (E) Imagen TORMENTA después de la revisión y ajuste de contraste. (F) Suhistogramas de las métricas de calidad de imagen. (G) Los archivos generados después de pulsar el botón Guardar imagen en revisor GUI. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Imágenes Figura 2. (A) Difracción limitado (DL) muestran diferentes concentraciones de dextrano antes de la imagen TORMENTA. Super-Resolución (SR) reconstrucciones de imágenes tienen un tamaño de píxel de 25 nm. 10,000 imágenes fueron recogidos con un tamaño de píxel de 128 x 128 marco y marcos individuales se muestran a partir de esa secuencia (2000, 5000, 8000). Adquirido con un tiempo de 10 milisegundos de exposición, de 52,5 fotogramas por segundo. Las imágenes tienen un tamaño de píxel de 160 nm. Para claridad de la visualización de un pixel aumento del contraste de saturación de 0,1% se aplicó utilizando ImageJ. La precisión mediaLas estimaciones son de 28 nm (alto), 24 nm (medio) y 16 nm (baja) para las diferentes imágenes de dextrano. Las densidades de localización son 724 por m ² (alto), 526 por m ² (medio) y 13 por um ² (bajo). (B) Gráfico que muestra un promedio de tres secuencias de 10000 de trama de cada concentración de dextrano. Las barras de error indican la desviación estándar. (C) Gráfico representando el número de localizaciones aceptadas por cuadro con un promedio de bastidor rodante 100. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 3. Pobre Calidad de Datos dextrano. (A) Difracción marco limitado de una secuencia de 15.000 marco TORMENTA. Nota de la bruma fluorescente difusa en la imagen. Esto es causado por fluoropho res de difusión a través del medio. 128 x 128 píxeles de tamaño del marco, un tiempo de exposición de 10 ms y adquiridas a 52,5 fotogramas por segundo. (B) Lo mismo que (A) después de que el tampón se habían cambiado. Note el contraste mejorado como fluoróforos no consolidados han sido lavados. (C) Un super-resolución de imagen de reconstrucción que corresponde a los datos recogidos en (A). Tamaño de la imagen idéntica pero con píxeles de 25 nm. La estimación media de precisión es de 35 nm. (D) Un super-resolución de imagen de reconstrucción que corresponde a los datos recogidos en (B). Tamaño de la imagen idéntica pero con píxeles de 25 nm. La estimación media de precisión es de 30 nm. (E) Gráfico representando el número de localizaciones aceptadas por trama, utilizando un promedio marco rodadura 100. La línea roja corresponde a la secuencia de STORM (A & C) donde hay un alto fondo. La línea azul muestra los datos correspondientes a (B & D), donde el fondo es bajo. (C) Gráfico que muestra el número de localización aceptado para las imágenes correspondientes a alta (C) y (D) de datos bajo fondo.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg" target = "_blank"> Haga clic aquí para ver más grande la figura.

Figura 4. Datos Actina típica. (AC) imágenes de difracción limitada de los filamentos de actina antes de la adición de tampón y de formación de imágenes STORM conmutación. Longitudes variables de filamentos se pueden ver. Filamentos muy brillantes son a menudo varios filamentos enredados juntos. El tamaño de pixel es 160 nm. (D) Una imagen de difracción limitada de un solo filamento de actina. (E) Imagen STORM (0,1% aumento del contraste aplicada en ImageJ). A partir de una secuencia de 10000 marco con un tamaño de píxel de 128 x 128 marco, un tiempo de exposición de 10 mseg y adquiridas a 52,5 fotogramas por segundo. El tamaño del píxel es de 16 nm. La estimación media de precisión es de 16 nm. (F) Gráfico representando el número de la localización aceptadas por fotograma, utilizando un promedio marco rodadura 100. (G) Un zoom en la región de los filamentos de actina a partir de (E) antes de la mejora de contraste con un perfil de la línea amarilla dibujada a través. (H) Una vista de perfil parcela de la línea amarilla trazada a través de los filamentos de actina. Generado en ImageJ. (I) Un ajuste de Gauss del perfil de trama utilizando la herramienta de ajuste de curvas en ImageJ. La desviación estándar, d, se multiplica por 2,35 para obtener una medición de 43,2 nm FWHM. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 5. Mislocalized filamentos de actina. (A) de filamentos de actina de difracción limitada. 160 píxeles nm. (B) Imagen TORMENTA de filamentos de actina se muestra en (A). A partir de una secuencia de 20.000 marco con un fram 128 x 128 píxelestamaño e, un tiempo de exposición de 10 ms y adquiridas a 52,5 fotogramas por segundo. El tamaño de píxel STORM es 16 nm. Se procesaron 20.000 Todos los marcos. La estimación media de precisión es de 17 nm. (C) Como (B), pero con sólo los primeros 5000 marcos de la secuencia de 20000 marco procesados. La estimación media de precisión es de 18 nm. (D) Como (B), pero con sólo los últimos 5.000 fotogramas de la secuencia 20000 marco procesados. La estimación media de precisión es de 17 nm. (E) Gráfica de localizaciones por los datos del marco de completa 128 x 128 píxeles de vista de imagen.

Figura 6. Lateral Drift. (A) Imagen TORMENTA de un filamento de actina reconstruido a partir de una secuencia de 10.000 marco con un tamaño de 64 x 64 marco píxeles, un tiempo de 10 ms y la exposición tomada en 64,6 fotogramas por segundo. El tamaño de píxel STORM es 32 nm. La estimación media de precisión es32 nm. (B) Una imagen STORM visualiza usando la función 'Tracking Box' en tormenta. Localizaciones se muestran con un color correspondiente al número de bastidor de momento de la adquisición, por ejemplo, localizaciones desde temprano en la secuencia de adquisición son azules; localizaciones de tarde en la secuencia de adquisición son rojos. Los colores desplazadas indican que se ha producido la deriva. (C) Un zoom en la región de (A) se muestra el uso de la función de seguimiento de la caja en la tormenta. Los colores indican los desplazados se ha producido la deriva. (D) Una imagen de difracción limitada de cuatro perlas fluorescentes 100 nm, que se puede utilizar como marcadores fiduciales. Pixel Tamaño de 160 nm. Números 1-4 espectáculo recortada y ampliada cuentas individualmente. (E) Cada cuenta fluorescente correspondiente a (D) reconstruido en tormenta de lluvia a partir de una secuencia de 10.000 marco con un tamaño de píxel de 128 x 128 marco, un tiempo de exposición de 10 ms y adquiridas a 52,5 fotogramas por segundo. El tamaño de píxel STORM es de 5 nm. La estimación media de precisión es de 7 nm. (F) Cuentas correspondientes a (D) y (E),visualizado utilizando la opción 'Tracking Box'. Los colores indican los desplazados se ha producido la deriva. (G) colocar una cuenta de número 2 como referencia, cuentas de 1, 3 y 4 se muestran después de la función "Reste Drift 'se utiliza en tormenta. Comparación con (E) muestra que el desplazamiento lateral se ha corregido. El tamaño de píxel STORM es de 5 nm. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 7. Datos de EGF típica. (A) Difracción de imagen limitado de parte de una célula HeLa centrado en la superficie de células basales. Cajas amarillas indican zoom en regiones de interés se muestran en (B) y (C). (B) Zoomed de difracción imagen limitada de la región cerca del borde de la celda (cuadro B) en. (C) Enfocado en la difracción limitada la imagen de la región bajo el núcleo (casilla C). (D) Imagen TORMENTA correspondiente a (A). A partir de una secuencia de 10000 marco con un tamaño de píxel de 128 x 128 marco, un tiempo de exposición de 10 mseg y adquiridas a 52,5 fotogramas por segundo. El tamaño de píxel STORM es 25 nm. La estimación media de precisión es de 21 nm. (E) Imagen TORMENTA correspondiente a la casilla E (D). (F) Imagen TORMENTA correspondiente a la casilla F (D). (G) Localizaciones por los datos del marco de (D). Haz click aquí para ver más grande la figura .

Videos 1-4. Videos corresponden a la figura 2A con concentraciones de dextrano variables: 1 = alto, 2 = medio, 3 = bajo, 4 = ninguno). 10.000 secuencias de fotogramas con 128 x 128 píxeles, tamaños de marco adquiridos con un tiempo de 10 milisegundos de exposición, de 52,5 fotogramas por segundo. Haz click aquí para ver el video 1 ,load/50579/50579video2.mov "target =" _blank "> de vídeo 2, vídeo 3 , vídeo 4

Videos 5-6. Videos corresponden a la Figura 3 A y B. Video 5 es pre-lavado y Video 6 es post-lavado tras la retirada de fluoróforos unidos. 15.000 secuencias de fotogramas utilizando un tamaño de píxel de 128 x 128 fotogramas, un tiempo de exposición de 10 ms y adquiridas a 52,5 fotogramas por segundo. Haz click aquí para ver el vídeo 5 , vídeo 6 .

Video 7. Video que muestra la secuencia de marco cruda que fue procesada para generar la imagen STORM en la figura 4E. 10000 marco Sequena vez con un tamaño de píxel de 128 x 128 marco, un tiempo de exposición de 10 ms y adquiridas a 52,5 fotogramas por segundo. Haga clic aquí para ver el vídeo 7 .

Video 8. Video que muestra la secuencia de marco cruda que fue procesada para generar la imagen STORM en la Figura 5B. 20000 secuencia de tramas con un tamaño de píxel de 128 x 128 marco, un tiempo de exposición de 10 ms y adquiridas a 52,5 fotogramas por segundo. Haga clic aquí para ver el video 8 .

Video 9. Video que muestra la secuencia de marco cruda que fue procesada para generar la imagen STORM en la Figura 6A. 10000 secuencia de tramas con un tamaño de 64 x 64 marco píxeles, un tiempo de 10 ms y la exposición tomada en 64,6 fotogramas por segundo. Click aquí para ver el vídeo 9.

Video 10. Video que muestra la secuencia de marco cruda que fue procesada para generar la imagen STORM en la figura 7D. 10000 secuencia de tramas con un tamaño de píxel de 128 x 128 marco, un tiempo de exposición de 10 ms y adquiridas a 52,5 fotogramas por segundo. Haga clic aquí para ver el video 10 .

Discussion

Se demuestra con algunas muestras de prueba simples y la libre disposición de procesamiento temporal de lluvia software es posible optimizar STORM imágenes de super-resolución. Estas herramientas y métodos proporcionarán puntos de partida útiles para los nuevos usuarios y los modos para los usuarios con experiencia para aumentar la confianza en sus microscopios y su uso de ellos para estudiar las estructuras biológicas y celulares con un detalle sin precedentes. Mediante el uso de una combinación de muestras con estructuras conocidas o bien entendidas y un algoritmo que puede producir una serie de indicadores de calidad de imagen de utilidad, como las estimaciones de precisión media, el número de localización e histogramas mostrando que es posible mejorar la calidad de la imagen y para tener una mayor confianza en el proceso de formación de imágenes TORMENTA. No hay una talla única aproximación a la adquisición de los datos, ya que hay un número de diferentes configuraciones de microscopio comerciales y de construcción propia que se puede utilizar. Por otra parte, hay muchos de preparación y de imágenes de ejemplo pasos de adquisición que puede influirEnce la imagen final, por tanto, contar con herramientas de software y muestras de prueba es fundamental para la comprensión y la optimización de la calidad de imagen TORMENTA.

Además, estos protocolos pueden proporcionar formas útiles y menos ambiguas de la solución de cualquier problema que pueda surgir. Por ejemplo, la muestra de dextrano es una manera muy útil para identificar si hay cualquier desalineación del haz láser o iluminación desigual de la muestra. Si existen dudas de que el búfer de conmutación puede no estar funcionando una prueba visual muy simple para ver si hay alguna 'parpadear' ayudará. Los filamentos de actina son una forma útil de medir la resolución utilizando comparaciones FWHM así como destacar la deriva y mislocalization artefactos. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que a medida que los métodos de super-resolución basada en la localización puede ser la densidad fluoróforo sensible, a pesar de los otros factores que contribuyen, como los tiempos de exposición, velocidades, potencias de láser y la forma en que la imagen se procesa, es imposible asignar una resolución para unparticular, microscopio y asumir que todas las imágenes tengan esa resolución. Lo que es posible, sin embargo, es la medición de diversos aspectos de la resolución, como precisiones de localización media, número de la localización y de la deriva ^27. Incluso si los marcadores de referencia no se pueden incorporar en cada experimento que pueden, al menos, ser utilizado para caracterizar un sistema de microscopio, su entorno y comprender mejor las consideraciones operativas, tales como cómo se requiere mucho tiempo para alcanzar el equilibrio térmico después del arranque. Además de la corrección de la deriva lateral, marcadores de referencia pueden ser utilizados para caracterizar y corregir la deriva axial, aunque esto requiere el uso de una lente astigmática y un mecanismo de retroalimentación para corregir la posición de la muestra, mientras que las imágenes están siendo adquiridas ^43. Sistemas de super-resolución comerciales por lo general incluirán algún tipo de control de estabilidad o de bloqueo de enfoque mecanismo, que puede ser una solución más práctica para corregir el enfoque deriva.

Hay unre alternativas a recubrir de forma no específica el cristal con dextrano, tales como el uso de colorantes directamente u otras moléculas conjugadas, tales como anticuerpos secundarios. Una limitación de estos enfoques es que el número de moléculas unidas al vidrio no se conoce. Estructuras filamentosas alternativos que se han utilizado incluyen los microtúbulos ²⁸ y el ADN ^21. Sin embargo, la combinación de muy pequeño tamaño y convenientes reactivos disponibles comercialmente hacer actina una alternativa atractiva, especialmente en lo que la distancia de separación de los filamentos divergentes o ramificados que también puede ser una medida útil de rendimiento del sistema ^27.

Hay espacio para un mayor desarrollo de las muestras de ensayo, a pesar de los recientes avances en esta área ^28,29,46,47. En particular, formación de imágenes de varios colores presenta un número de retos en todos los 3 aspectos principales de la formación de imágenes, el etiquetado de la muestra, de adquisición de imágenes (de hardware), y el software (procesamiento de imágenes y la alineación). Ha sido ununa serie de publicaciones que abordan estos aspectos ^4-6 y por lo tanto, está claro que las muestras y los métodos de prueba apropiados son fundamentales para generar e interpretar con fiabilidad de este tipo de imágenes. De hecho, recientemente se ha demostrado que dSTORM se podría utilizar para tomar dos imágenes en color de, y resolver, la naturaleza altamente simétrico del complejo del poro nuclear y los autores sugirieron que esto sería una forma ideal para evaluar el desempeño de las correcciones de aberración cromática ^45. Otro enfoque interesante es el uso de origami de ADN para crear un nanoruler, lo que crea la posibilidad de fluoróforos posicionamiento a distancias específicas sub-difracción de distancia ^46. Esto proporciona una manera de evaluar la resolución y haciendo mediciones de distancia. Sin embargo, el objetivo final es aplicar estas técnicas de super-resolución para muestras no idealizados, como las células, que son estructuras tridimensionales complejas. En este caso, una combinación de comprensión más completa de Tque técnica combinada con herramientas de software que ayudan al usuario en la adquisición de datos, su procesamiento de manera apropiada, y proporcionar mediciones de la imagen es probable que sea la última respuesta. ^28,29,47,48

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labtek Cámara de imagen de vidrio	Fisher	CBR-166-390E Preparación de	muestras
Microscopio invertido	Olympus	IX71	* Consulte a continuación las alternativas
Lente de objetivo 100 X TIRF	Olympus	UAPON 100XOTIRF	* Consulte a continuación las alternativas
EMCCD	Andor	iXon 897	* Consulte a continuación las alternativas Láser
	de 640 nmToptica	iBEAM-SMART-640-S	*150 mW - para la toma de imágenes Alexa 647 o Cy5 tintes
LabVIEW	National Instruments		*Software de adquisición (hardware de control)
PC	Dell		Windows XP (64 bits), CPU Intel Xeon E5420, 16 GB de RAM *Control de instrumentos y procesamiento de imágenes
ImageJ			Análisis y procesamiento de imágenes http://rsbweb.nih.gov/ij
rainSTORM	Laser Analytics Group (Cambridge) software		http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources
MATLAB	Running rainSTORM		http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/
*Ejemplo de microscopios			Ver también referencia 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope
*Microscopios			Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss, Elyra P.1, DeltaVision, OMX Blaze (Monet Localization) Alternativas a los microscopios de construcción propia
Tabla 1. Materiales & Equipo
[header]
PBS (10X)	Fisher	VX70013065	1; 2; 3; 4
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707	1.1; 2.1
Dextran-Alexa fluor 647	Invitrogen	D-22914	1.2
Tampón de actina general	Cytoskeleton Inc	BSA01	2.2
Filamentos de actina prereformados	Cytoskeleton Inc	AKF99	2.2
Phallodin-Alexa fluor 647	Invitrogen	A22287	2.2
Microesferas TetraSpeck (0.1 micras)	Invitrogen	T-7279	3.1
Células HeLa	ATCC	CCL-2	4.1
DMEM	Fisher	VX31966021	4.1
FBS	Fisher VX10500064		4.1
Pluma/Paso	Invitrogen	15070063	4.1
Platos de plástico	Invitrogen	734-0006	4.1
EGF - Alexa fluor 647	Invitrogen	E35351	4.3
BSA	Sigma	A7906	4.3, 4.4
Formaldehído - Solución al 10 %	grado Polysciences	04018-1	4.2
Catalasa	Sigma	C100	5.1
Glucosa oxidasa	Sigma	G2133	5.1
KCl	Sigma	P9541	5.1
TCEP	Sigma	C4706	5.1
Tris	Sigma	93352	5.1
Glucosa	Sigma	C7528	5.2
MEA-HCl	Sigma	M6500	5.3
Glicerina	Sigma	G2289	5.1; 5.2
Tabla 2. Reactivos