En 2001, investigadores de la UCLA describen el aislamiento de una población de células madre adultas, denominada células madre o las ASC derivadas de tejido adiposo, a partir de tejido adiposo. En este artículo se describe el aislamiento de las ASC de lipoaspirates utilizando un protocolo de digestión manual, enzimática utilizando colagenasa.
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Artículo de método
Aislamiento Manual de células madre derivadas de tejido adiposo de Lipoaspirates Humanos
En este artículo
Resumen
Resumen
En 2001, investigadores de la Universidad de California, Los Ángeles, describen el aislamiento de una nueva población de células madre adultas de tejido adiposo por liposucción que inicialmente denominan células lipoaspirado procesados o células del EPL. Desde entonces, estas células madre se han renombrado como células o ASC madre derivadas de tejido adiposo y han pasado a convertirse en una de las poblaciones de células madre adultas más populares en el campo de la investigación con células madre y la medicina regenerativa. Miles de artículos ahora describen el uso de ASC en una variedad de modelos animales de regeneración, incluyendo la regeneración del hueso, la reparación del nervio periférico y la ingeniería cardiovasculares. Artículos recientes han comenzado a describir la miríada de usos para las ASC en la clínica. El protocolo se muestra en este artículo se describe el procedimiento básico para la mano y el aislamiento de las ASC enzimáticamente a partir de grandes cantidades de lipoaspirates obtenidos de los procedimientos cosméticos. Este protocolo se puede escalar fácilmente hacia arriba o hacia abajo para accommodcomió el volumen de lipoaspirado y puede ser adaptado para aislar las ASC de tejido graso obtenidos a través de abdominoplastías y otros procedimientos similares.
Introducción
En el año 2001, una población putativo de células madre multipotentes a partir de tejido adiposo se describe en la revista Tissue Engineering 1. Estas células se les dio el nombre de Procesado células lipoaspirado o PLA, debido a su derivación a partir de tejido lipoaspirado procesado obtenidos a través de la cirugía estética. El método de aislamiento se describe en este artículo se basa en las estrategias enzimáticas existentes para el aislamiento de la fracción del estroma vascular (SVF) a partir de tejido adiposo 2. El SVF se ha definido como una población mínimamente procesado de las células rojas de la sangre, fibroblastos, células endoteli....
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Protocolo
El protocolo que se muestra aquí describe el aislamiento Manual de ASC de lipoaspirates obtenidos a través de procedimientos cosméticos mediante digestión enzimática y centrifugación diferencial. Este protocolo se publicó por primera vez en la revista Tissue Engineering en 2001 1, en donde las células resultantes se denominan células lipoaspirado procesados o células del EPL a causa de su aislamiento a partir lipoaspirates. Sin embargo, la celda de PLA término ahora ha sido reemplazado por el término células o ASC para dar el campo de una especie de la conformidad en términos de nomenclatura madre derivadas de tejido adiposo.
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Resultados
El contorno protocolo anterior describe un método manual, enzimática para el aislamiento de un SVF de una gran muestra lipoaspirado volumen. Dentro de este SVF son numerosas poblaciones de células, incluyendo la ASC. Numerosos estudios proponen que el cultivo de esta SVF en condiciones de cultivo de tejidos estándar se seleccione para una población de fibroblastos adherente probable que se compone principalmente del tipo ASC. Consistente con esto, hemos demostrado, usando citometría de flujo e inmunofluorescencia, que p.......
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Discusión
El tejido adiposo para el aislamiento de las ASC puede venir en muchas formas: desde piezas sólidas de tejido obtenidas mediante resección o lipoplastia en trozos más pequeños obtenidos a través de cualquiera de extracción jeringa o lipoplastia asistida por succión (es decir, la liposucción). Ya sea que las células más SVF (y por tanto ASC) pueden obtenerse a partir de muestras de tejido adiposo resecados o aspirado es claro como estudios contradictorios se han presentado 16, 17. Es posible que cualq.......
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Divulgaciones
Los autores de este manuscrito son co-inventores de una patente propiedad de la Junta de Regentes de la Universidad de California y licenciado a Cytori Terapéutica.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer y agradecer a aquellos más personal de investigación que han contribuido al desarrollo del protocolo descrito y su aislamiento de la ASC, incluyendo: Dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr. Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD , el Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Rong Zhang, DDS, PhD, Dr. Larissa Rodríguez, MD, Dr. Zeni Alfonso, PhD, y el Dr. John Fraser, PhD. Los resultados presentados fueron financiados, en parte, por las becas de investigación de los Institutos Nacionales de Salud, incluidos los NIAMS e Institutos NIDCR.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo | |||
| DMEM (Dulbecco’ s Modificación de Eagle’ s Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | con 4,5 g/ml de glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio |
| Penicilina/Estreptomicina | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10.000 UI/ml penicilina/10.000 μ g/ml estreptomicina |
| Anfotericina B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μ g/ml anfotericina B |
| 10X PBS (solución salina tamponada con fosfo) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | sin calcio, sin magnesio |
| Tripsina/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0,25 % tripsina/2,21mM EDTA |
| Colagenasa tipo IA (de Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | preparación bruta; < 125 unidades de digestión de colágeno/mg sólido |
| FBS (Suero Fetal Bovino) inactivado por calor | Gemini Bioproducts | 100106 | fuente USDA, inactivado por calor |
| Pipetas serológicas de 10 ml | Genesee Scientific | 12-104 | |
| Pipetas serológicas de 25 ml | Genesee Scientific | 12-106 | |
| Tubos centrífugos de polipropileno de 50 ml | Genesee Scientific | 21-106 | |
| Placas de cultivo de tejidos de 100 mm | Genesee Scientific | 25-202 | |
| Placas de cultivo de tejidos de 150 mm | Genesee Scientific | 25-203 | |
| Unidades de filtro Stericup de 500 ml | Membrana Millipore | SCGPU05RE | PES, 0.22 μ m pore |
| Filtros de células | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μ m malla de nylon |
| dexametasona - soluble en agua | Sigma | D-2915 | |
| L-ácido ascórbico 2 fosfato | Sigma | A-8960 | |
| β-glicerofosfato sal disódica | Sigma | G-9422 | también conocida como glicerofosfato |
| insulina | Sigma | I-6634 | hecha de páncreas bovino |
| indometacina | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrina | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ 1 | R& D Systems | 240-B-002 | Aceite humano recombinante |
| Rojo O | Sigma | O-0625 | |
| Azul alcián | Sigma | A-5268 | |
| Nitrato de plata | Sigma | S-0319 | |
| Ácido clorhídrico | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehído | Fisher Scientific | 30525-89-4 | suministrado como stock al 16 % |
| [encabezado] | |||
| Equipo necesario | |||
| Clase II A/B Campana de bioseguridad | Thermo Scientific | Ensure tiene líneas de vacío para la aspiración | |
| Centrífuga de sobremesa | Hermle Labnet | Z383 | Se requiere rotor basculante para tubos de 50 ml, capaz de 1200xg |
| Baño de agua | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | capacidad de 5-10 L, capaz de 37C |
| Ayudas de pipeta automatizadas | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubadora | Thermo Scientific | Forma 310 | de calor directo o agua encamisada |
Referencias
- Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
- Rodbell, M. Metabolism of isolated fat cells. J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).
- Poznanski, W. ....
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Reimpresiones y permisos
