Artículo de método

Aislamiento Manual de células madre derivadas de tejido adiposo de Lipoaspirates Humanos

DOI:

10.3791/50585

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26 de septiembre de 2013

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1Cytori Therapeutics Inc, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Orthopedic Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Regenerative Bioengineering and Repair Laboratory, David Geffen School of Medicine at UCLA

En este artículo

Resumen

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En 2001, investigadores de la UCLA describen el aislamiento de una población de células madre adultas, denominada células madre o las ASC derivadas de tejido adiposo, a partir de tejido adiposo. En este artículo se describe el aislamiento de las ASC de lipoaspirates utilizando un protocolo de digestión manual, enzimática utilizando colagenasa.

Resumen

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En 2001, investigadores de la Universidad de California, Los Ángeles, describen el aislamiento de una nueva población de células madre adultas de tejido adiposo por liposucción que inicialmente denominan células lipoaspirado procesados ​​o células del EPL. Desde entonces, estas células madre se han renombrado como células o ASC madre derivadas de tejido adiposo y han pasado a convertirse en una de las poblaciones de células madre adultas más populares en el campo de la investigación con células madre y la medicina regenerativa. Miles de artículos ahora describen el uso de ASC en una variedad de modelos animales de regeneración, incluyendo la regeneración del hueso, la reparación del nervio periférico y la ingeniería cardiovasculares. Artículos recientes han comenzado a describir la miríada de usos para las ASC en la clínica. El protocolo se muestra en este artículo se describe el procedimiento básico para la mano y el aislamiento de las ASC enzimáticamente a partir de grandes cantidades de lipoaspirates obtenidos de los procedimientos cosméticos. Este protocolo se puede escalar fácilmente hacia arriba o hacia abajo para accommodcomió el volumen de lipoaspirado y puede ser adaptado para aislar las ASC de tejido graso obtenidos a través de abdominoplastías y otros procedimientos similares.

Introducción

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En el año 2001, una población putativo de células madre multipotentes a partir de tejido adiposo se describe en la revista Tissue Engineering 1. Estas células se les dio el nombre de Procesado células lipoaspirado o PLA, debido a su derivación a partir de tejido lipoaspirado procesado obtenidos a través de la cirugía estética. El método de aislamiento se describe en este artículo se basa en las estrategias enzimáticas existentes para el aislamiento de la fracción del estroma vascular (SVF) a partir de tejido adiposo 2. El SVF se ha definido como una población mínimamente procesado de las células rojas de la sangre, fibroblastos, células endoteliales, células de músculo liso, pericitos y pre-adipocitos que aún tienen que adherirse a un sustrato de cultivo de tejido 2, 3. Se propone El cultivo de esta SVF con el tiempo para eliminar muchas de estas poblaciones de células contaminantes y resultar en una, población fibroblástica adherente. Estos fibroblastos han sido identificados en la literatura en los últimos 40 años, como se pre-adipocitos. Sin embargo, nuestro grupo de investigación demostró que estas células poseían multipotencialidad mesodérmico y renombraron la población SVF adherente como células del EPL. Estudios posteriores de otros numerosos grupos de investigación se han sumado a este potencial, lo que sugiere tanto endodérmico y potenciales ectodérmicas (para revisión ver 4). Desde entonces, numerosos términos adicionales para estas células han aparecido en la literatura. Con el fin de proporcionar algún tipo de consenso, se adoptó el término células o ASC madre derivadas de tejido adiposo en la II conferencia anual IFATS 2. Como tal, el término ASC se utiliza en este artículo.

El protocolo descrito en este artículo es un procedimiento relativamente simple que requiere un equipo de laboratorio estándar y utiliza reactivos simples tales como solución salina fosfo-tamponada, reactivos estándar de los medios de cultivo de tejidos y la colagenasa. Se puede producir un gran número de ASC en función de la cantidad de volumen de partida tejido adiposo y la subsiguiente Ctiempo ulture. Sin embargo, el procesamiento de una gran cantidad de tejido adiposo como puede presentar algunos problemas físicos que pueden ser mitigados hasta cierto punto el uso de este protocolo. Además, este protocolo no requiere instalaciones de cultivo de tejidos estériles y campanas de bioseguridad aprobados, necesitando por ello el uso de una instalación de cultivo de tejidos aprobado. Este requisito también puede disminuir la utilidad de la población ASC en aplicaciones clínicas a menos que se aislaron en las buenas prácticas de fabricación de instalaciones aprobadas (GMP) diseñados para el aislamiento y la expansión de los materiales para su uso clínico. Como alternativa, los sistemas automatizados que pueden aislar ASC en un sistema cerrado en el quirófano evitaría este tema clave y permitir el uso inmediato de ASC sin ninguna necesidad para la posterior expansión in vitro. Hasta la fecha, hay seis sistemas automatizados que están disponibles comercialmente para el aislamiento de células a partir de tejido humano. Estos sistemas pueden hacer que sea posible aislar unimportante número de ASC de grandes cantidades de tejido adiposo inmediatamente después de su cosecha. Estos ASC podrían ser reintroducidas en el paciente para una variedad de propósitos regenerativos sin el paciente tener que salir de la sala de operaciones. Además de este protocolo que describe el aislamiento manual de los ASC, un protocolo para el aislamiento automatizado de ASC utilizando el Sistema Celution se da también en un artículo complementario.

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Protocolo

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El protocolo que se muestra aquí describe el aislamiento Manual de ASC de lipoaspirates obtenidos a través de procedimientos cosméticos mediante digestión enzimática y centrifugación diferencial. Este protocolo se publicó por primera vez en la revista Tissue Engineering en 2001 1, en ​​donde las células resultantes se denominan células lipoaspirado procesados ​​o células del EPL a causa de su aislamiento a partir lipoaspirates. Sin embargo, la celda de PLA término ahora ha sido reemplazado por el término células o ASC para dar el campo de una especie de la conformidad en términos de nomenclatura madre derivadas de tejido adiposo. Las células aisladas a través de este protocolo se ha demostrado por muchos que poseen potencial mesodérmico tanto in vitro como in vivo (para revisión ver 4). Además, los ectodérmicas y endodérmicas potenciales de la ASC también se han explorado 4. La técnica de aislamiento es simple y directa y requiere aproximadamente una hora para completar. La célula resultantes se cultivan en condiciones de cultivo de tejidos estándar. Con el tiempo la cultura, la población se vuelve más homogénea ASC, compuesto por células de fibroblasto que se expanden fácilmente y muestran una buena viabilidad en el largo plazo en la cultura.

Nota: Las siguientes piezas de equipo que se requiere se enumeran al final de este artículo. Todos los artículos de vidrio, medios de comunicación y los reactivos deben ser esterilizados mediante autoclave o por filtración a través de 0,22 micras filtros. Asépticas técnicas de cultivo de tejidos se deben seguir en todo momento. Para asegurar esto, todos los materiales colocados en la cabina de bioseguridad deben ser esterilizados por pulverización con una solución de etanol al 70% y limpiar con toallas de papel limpias.

1. Antes de la cosecha, preparar los siguientes:

  1. Estéril 1X buffer fosfato-salino (PBS) para el lavado de los lipoaspirates. Preparar aproximadamente 1 l de 1x PBS por cada 100 ml de lipoaspirado. Autoclave el PBS y todosow enfriar a temperatura ambiente antes de su uso. Como una opción, antibiótico / antimicótico se puede añadir a una concentración final de: 100 UI / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 2,50 mg / ml de anfotericina B una vez que el PBS se ha enfriado.
  2. Estéril 0,075-0,1% de colagenasa tipo IA (de Clostridium histolyticum) para la digestión enzimática de la lipoaspirado. Concentración dependerá de la calidad y el origen de la colagenasa - es decir, frente bruto se purificó. Otros tipos de colagenasa se ​​pueden utilizar (por ejemplo, la colagenasa tipo II o IV) en concentraciones similares. Preparar en 1x PBS y filtro estéril utilizando un sistema de filtración de 1.000 ml con un filtro de 0,22 micras (Figura 1A). Sin embargo, también se pueden usar botellas de vidrio estéril equipado con un filtro superior de la botella. Preparar y usar a la temperatura ambiente. Soluciones colagenasa se pueden almacenar en el corto plazo a 4 º C hasta que se necesite. No congelar la solución de colagenasa ya que puede disminuir su actividad.
  3. Control estéril Medio (CM) para la inactivación de la colagenasa y el cultivo de la población ASC. Para 500 ml de CM, combinar la siguiente: 500 ml de DMEM (glucosa 4,5 g / L, con L-glutamina), suero bovino fetal 50 ml (inactivado por calor), 5 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 IU de penicilina, 10.000 g / ml la estreptomicina). Como opción, también se puede añadir 5 ml de anfotericina B (250 mg de anfotericina B / ml). Se requiere filtración estéril de este medio si se utilizan reactivos no estériles. Coloque el CM en un 37 ° C baño de agua 30 minutos antes de usar para calentar el medio.
  4. Artículos de vidrio estéril y recipientes de plástico para el aislamiento. Autoclave de un vaso de precipitados de vidrio de 1000 ml y dejar enfriar a temperatura ambiente antes del uso. Además, tienen la siguiente plasticware listo: pipetas serológicas aséptica (5 ml, 10 ml y 25 ml), 50 ml tubos de centrífuga, y placas de cultivo de tejidos de cultivo tratadas.

2. Aislamiento de ASC a partir de Lipoaspirates

La mayoría de lipoaspirates se recogen en un recipiente de aspiración (véase Figura 1B) y pueden estar compuestas de tres capas distintas: 1) una capa superior de aceite debido a la lisis de adipocitos maduros, 2) una capa intermedia de tejido adiposo, y 3) un parte inferior, infranadante líquido que contiene solución salina y tipos de células contaminantes tales como las células rojas de la sangre (eritrocitos). La capa de aceite superior puede no estar presente en cantidades significativas. Si está presente, debe ser aspirado como la contaminación del aceite de la cultura ASC resultante podría afectar a la viabilidad del cultivo. El infranadante inferior debe ser removido antes de su procesamiento para minimizar la contaminación de los cultivos de ASC con glóbulos rojos. Esto dejará el medio, la capa de tejido adiposo, que luego se lava y se digirieron enzimáticamente para liberar su fracción celular, del estroma vascular (FVS).

  1. Lavar el lipoaspirado: Abra el contenedor lipoaspirado en el cultivo de tejidos hood y decantar cuidadosamente el lipoaspirado en un vaso de 1 litro de vidrio estéril. Deje que las capas se separen lipoaspirado hasta la capa de tejido adiposo está bien separado (Figura 1B).
    1. Aspirar la capa de aceite (si está presente) utilizando una pipeta de vidrio estéril y el infranadante solución salina parte inferior usando una pipeta serológica de 10 ml. Esto eliminará la mayor mayoría de contaminación de las células rojas de la sangre y solución salina.
    2. Evaluar el volumen de la capa de tejido adiposo resultante y añadir 1x PBS estéril a un volumen igual. Se agita la aspirado con la pipeta usada para la aspiración con el fin de mezclar el lipoaspirado con la PBS. Permita que las dos capas se asienten. Como se señaló anteriormente, el PBS 1x puede ser suplementado con antibióticos / antimicóticos.
    3. Aspirar el infranadante utilizando una pipeta serológica de 10 ml.
    4. Continúe lavando la fracción de tejido adiposo como se indica en los pasos 2.1.2. y 2.1.3. hasta que la capa adiposo tiene un color amarillo / oro. ª Aspirare infranadante por última vez, dejando la fracción de tejido adiposo en el vaso de vidrio. Para asegurar la eliminación adecuada de la infranadante, permiten que las capas lipoaspirado se asienten durante 5 min tras el último lavado y antes de la aspiración final.
  2. La digestión enzimática de la lipoaspirado: Preparar solución de colagenasa 1A estéril como se describe anteriormente en una unidad de filtro. Preparar un volumen igual a la de la fracción adiposo y filtro estéril.
    1. Después de la filtración de la solución de colagenasa, desechar la unidad de filtro superior, se vierte cuidadosamente la fracción adiposo lavado en la solución de colagenasa y cerrar herméticamente la botella.
    2. Coloque la mezcla de colagenasa / adiposo en un 37 ° C baño de agua y digerir a 37 ° C durante 30 min. Agite suavemente la mezcla de colagenasa / adiposo cada 5-10 minutos y colocar de nuevo en el baño de agua. La capa de tejido adiposo debe tomar una apariencia "más suave" (Figure 1B) a medida que avanza la digestión. Tiempos de digestión adicionales (es decir, hasta 2 horas) se pueden utilizar si la capa de tejido adiposo todavía parece tener piezas sólidas de grasa dentro de ella.
  3. Aislamiento de ASC: Coloque la mezcla de colagenasa / adiposo digerido de nuevo en la cabina de bioseguridad. Asegúrese de esterilizar la unidad de filtro con etanol al 70% antes de poner de nuevo en el armario.
    1. Transferir 25 ml alícuotas de la infranadante que contiene el SVF en tubos de centrífuga de 50 ml estériles.
    2. Añadir 25 ml de CM a cada tubo. Permita que el CM para inactivar la colagenasa mediante la incubación a temperatura ambiente en el gabinete durante 5 min.
    3. Centrifugar durante 10 min a 1200 x g para recoger el SVF como un pellet.
    4. En la cabina de bioseguridad, aspirar el sobrenadante de cada tubo. Asegúrese de que la capa de aceite superior y todos los adipocitos flotantes se aspiran con este sobrenadante ( Figura 1B).
    5. Combine los pellets SVF en un tubo de centrífuga de 30 ml utilizando CM y dividir por igual entre dos nuevos tubos de centrífuga de 50 ml. Se centrifuga como en el paso 2.3.3. y aspirar los sobrenadantes de los dos gránulos de SVF (no mostrados en la figura).
      OPCIONAL: Si se desea RBC lisis, resuspender cada pellet SVF en 10 ml de un tampón de lisis de RBC (160 mM NH 4 Cl) y se incuba a temperatura ambiente durante 10 min. Se centrifuga como en el paso 2.3.3. y aspirar los sobrenadantes para producir los gránulos de SVF (no mostrados en la figura).
    6. Combinar las dos bolitas SVF en un nuevo tubo de centrífuga utilizando 5-10 ml CM (Figura 1B).
    7. Para filtrar las partículas más grandes de tejido, pipetear el sedimento se resuspendió SVF sobre un filtro de malla de 100 micras colocado en la parte superior de un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml y permitir para filtrar por flujo de gravedad.
    8. Alícuotas de pipeta de la resuspendido(Y filtrado) pellet SVF que contiene las ASC en cultivo de tejidos tratados placas de cultivo. Suplemento cada plato con un volumen adecuado de CM.
    9. Cultivar las células en CM durante 3-4 días a 37 ° C, 5% de CO 2 sin cambio de medios de comunicación.

Después de este período de cultivo inicial, el medio de cultivo puede ser aspirado y cualquier contaminación de las células rojas de la sangre quita suavemente por lavado con 1XPBS estériles. Reemplazar con CM y continuar con la cultura de los ASC, según sea necesario. El tipo de placa de cultivo de tejido utilizado y cómo el sedimento se resuspendió SVF se divide entre estos platos dependerá del número de células deseadas siguiente cultivo de tejidos convencional.

3. Caracterización de la Población ASC: Citometría de Flujo y Diferenciación multilinaje

Una vez aislado, se debe realizar la caracterización de la población de ASC. Los enfoques convencionales para esto incluyen cito flujometría para caracterizar el perfil de antígeno de CD superficie celular de las células y en la diferenciación in vitro para confirmar su capacidad de diferenciación multilinaje. Si bien múltiples linajes pueden ser evaluados en ASC, este protocolo describe la diferenciación de las ASC en las células de la adipogénica, osteogénica y linajes condrogénicas como un medio para confirmar los potenciales mesodérmicas multilinaje 5.

In vitro diferenciación multi-linaje de ASC

  1. La diferenciación osteogénica de ASC: Antes de la inducción, preparar osteogénica Medio (OM) de la siguiente manera: Para una botella de 500 ml de DMEM (4,5 g / ml de glucosa) añadir 25,0 ml de FBS (concentración final 5,0%) y 5,0 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 UI / ml y concentraciones finales 10 000 mg / ml, respectivamente). Para ello, agregue los siguientes agentes de inducción osteogénica para dar las concentraciones finales indicadas: dexametasona (0,1 mM final), L-ascórbico 2-fosfato (50,0 M finales) Y β-glicerofosfato (10,0 mM final).
    1. Antes de la inducción, la cosecha y la placa a las ASC cultivadas en la placa de cultivo de tejido deseado de manera que se consigue una confluencia del aproximadamente 50%. Para cada plato experimental plateado, placa una fuente adicional para un control no inducido. Noche a la mañana la cultura en CM.
      Nota: 50% de confluencia se recomienda con el fin de permitir la continua proliferación que pueden ocurrir en el transcurso de la inducción
    2. En el día de la inducción, se elimina el medio y agregue la siguiente: OM a los pozos experimentales osteogénicas deseados y CM a los pocillos de control. El volumen de los medios de comunicación utilizados dependerá del tamaño de la placa de cultivo tisular. Para placas de 12 pocillos, 1,0 ml de medio por pocillo es suficiente. Para placas de 6 pocillos, 2,0 ml de medio por pocillo es suficiente. Para placas de 100 mm, se deben utilizar 10,0 ml de medio por placa.
    3. Cultivar las células durante un mínimo de 14 días con los cambios del medio apropiado cada 3-4día. Poblaciones ASC altamente osteogénicas pueden mostrar signos de deposición mineral extracelular ya en 7 días de la inducción.
    4. La diferenciación osteogénica (es decir, la deposición de minerales extracelular) se puede confirmar mediante una tinción histológica von Kossa para el fosfato de calcio. Esta mancha producirá un precipitado negro-marrón identificar la presencia de fosfato de calcio extracelular (véase la Figura 2).
      Para la tinción con reactivo de von Kossa:
      1. Retire la OM de las células experimentales y el CM de las células de control
      2. Fijar las células durante 60 minutos en 4,0% de paraformaldehído preparado en 1x PBS.
      3. Lave las células dos veces con 1x PBS.
      4. Se incuban las células con nitrato de plata 2,0% (preparada en agua) en la oscuridad durante 30 min.
      5. Retire el nitrato de plata, lavar dos veces con agua destilada y secar al aire las células.
      6. Exponer las células a la luz UV durante 60 min para desarrollar la calprecipitado de fosfato de calcio.
      7. Se lavan las células varias veces con 1X PBS.
      8. Contratinción con hematoxilina la célula si se desea.
  1. La diferenciación adipogénica de las ASC: Antes de la inducción, preparar Adipogénico Medio (AM) de la siguiente manera: Para una botella de 500 ml de DMEM (4,5 g / ml de glucosa) añadir 50,0 ml de FBS (concentración final 10,0%) y 5,0 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 UI / ml y 10.000 g / ml concentración final, respectivamente). Para ello, agregue los siguientes agentes de inducción adipogénicos para dar las concentraciones finales indicadas: dexametasona (1,0 mM final), 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX - 0,5 mM final), indometacina (0,2 mM final) e insulina (10,0 M definitiva ).
    1. Antes de la inducción, la cosecha y la placa de las ASC cultivadas en la placa de cultivo de tejido deseada de manera que se consigue una confluencia de aproximadamente 80%. Para cada plato experimental plateado, placa una adiciónal plato para un control no inducido. . Cultivo de una noche en CM Nota: la diferenciación adipogénica de ASC parece ser más eficiente con el aumento de la confluencia.
    2. En el día de la inducción, se elimina el medio y agregue la siguiente: AM a los pozos experimentales osteogénicas deseados y CM a los pocillos de control. El volumen de los medios de comunicación utilizados dependerá del tamaño de la placa de cultivo tisular. Para placas de 12 pocillos, 1.0.ml de los medios de comunicación por pocillo es suficiente. Para placas de 6 pocillos, 2,0 ml de medio por pocillo es suficiente. Para placas de 100 mm, se deben utilizar 10,0 ml de medio por placa.
    3. Cultivar las células durante un mínimo de 14 días con los cambios del medio apropiado cada 3-4 días. Poblaciones ASC altamente adipogénicos pueden mostrar signos de formación de vacuolas de lípidos ya en 7 días de la inducción.
    4. ASC se someten a la diferenciación adipogénica desarrollarán múltiples vacuolas de lípidos que pueden ser fácilmente visualizados al microscopio óptico. Además, la diferenciación adipogénica puedeser confirmado mediante una tinción histológica Oil Red O que se acumulan dentro de estas vacuolas (ver Figura 2).
      Para la tinción con Oil Red O:
      1. Retire el papel de las células experimentales y de control y corregirlos durante 60 minutos usando un fijador de calcio formal de 10%. Para preparar este fijador, se combinan los siguientes: agua 1,0 g de CaCl2, 25,0 ml 16% de paraformaldehído (4,0% final) y 75,0 ml de agua destilada.
      2. Lavar las células dos veces con PBS 1x.
      3. Se lavan las células brevemente con etanol al 70%.
      4. Se incuban las células a temperatura ambiente durante 5 min con la solución de Oil Red O. Para preparar la solución de Oil Red O, disolver 2,0 g Oil Red O en polvo en 50,0 ml de 70% de etanol y 50,0 ml de acetona.
      5. Lavar las células con etanol al 70% y después con agua del grifo.
      6. Visualice las células pronto después de la tinción debido a la decoloración de la mancha con el tiempo.
  1. La diferenciación condrogénica de ASC: diferenciación condrogénica se logra a través de una técnica de cultivo de alta densidad se refiere como "cultura micromass". Antes de la cultura, preparar condrogénica Medio (CHM) de la siguiente manera: Para una botella de 500 ml de DMEM (4,5 g / ml de glucosa) añadir 5,0 ml de FBS (concentración final 1%) y 5,0 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 UI / ml y 10.000 g / concentraciones finales ml, respectivamente). Para ello, agregue los siguientes agentes de inducción condrogénicos para dar las concentraciones finales indicadas: L-ascórbico-2-fosfato (finales 50.0 g / ml), insulina (finales 6,25 g / ml), transferrina (finales 6,25 g / ml) y TGFß1 (10,0 ng / ml).
    1. Cosecha de las ASC y centrifugar durante 5 min a 1200 xg para sedimentar las células. Contar las células para determinar la densidad de la suspensión celular.
    2. Para preparar los gránulos micromasa, preparar dos suspensiones de células: una suspensión experimental preparado en CHM a una densidad de 1 x 10 7 célulass / ml y una suspensión de control preparado en CM a una densidad de 1 x 10 7 células / ml.
      1. Coloque 10,0 mu l "gotitas" de la suspensión celular en pocillos individuales de una placa de múltiples pocillos. Permitir que se adhieran durante 2-3 horas a 37 ° C.
      2. Superponer suavemente las gotas plateadas, ya sea con CHM o CM teniendo cuidado de no disociar las células.
      3. Cultivar las células para un máximo de 14 días en CHM o CM con cambios de medio cada 3-4 días. Las células cultivadas en CHM se condensarán durante este tiempo para formar un sedimento Micromass de alta densidad con poco o no hay células en una monocapa circundante. Control de las células cultivadas no sufrirán esta condensación y muchos se encuentran en forma de monocapa.
      4. Para confirmar la condrogénesis, fijar las pastillas durante 15 min en 4,0% de paraformaldehído (preparados en 1x PBS) a temperatura ambiente. Teñir la presencia de proteoglicanos sulfatados utilizando un Alcian mancha azul histológico.
        Para la tinción con Azul de Alcian:
        1. Lave el papellets de raformaldehyde-fijo, una vez en PBS 1x.
        2. Incubar los pellets en 0,1 N HCl (pH 1,0) durante 5 minutos para reducir su pH.
        3. Eliminar el HCl y añadir 1% de reactivo azul de Alcian (preparado en HCl 0,1 N, pH 1,0). Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
        4. Retire el reactivo azul de Alcian y lavar los gránulos con 0,1 N HCl (pH 1,0) para eliminar el exceso de colorante.
        5. Lavados adicionales utilizando agua del grifo pueden ser utilizados para reducir la tinción de fondo.
        6. Como alternativa, los gránulos micromasa pueden ser cosechadas, se fijaron durante la noche en 10% de formalina, incluidos en parafina y las secciones se tiñeron para Alcian Blue.

4. Citometría de flujo Caracterización de ASC

Caracterización del perfil de antígeno CD de superficie celular puede llevarse a cabo a través de citometría de flujo convencional.

  1. Preparación de la ASC para citometría de flujo: Antespara el análisis, preparar un Citometría de Flujo Buffer (FCB) compuesto de los siguientes: 1,0% de BSA, 2,0% de FBS y 0,025% de saponina preparado en 1x PBS.
    1. Cosecha de las ASC y centrifugar las células durante 5 min a 1200 xg para producir un gránulo.
    2. Resuspender las células en estéril 1XPBS y contar las células usando un hemocitómetro. Determinar la densidad celular de la suspensión.
    3. Divida la suspensión hasta en alícuotas de 5 x 10 5 células totales y de centrifugación para sedimentar.
    4. Eliminar el sobrenadante de PBS y fijar las células durante 60 min a -20 ° C con un exceso de 70% de etanol enfriado con hielo. Si es necesario, estas células se pueden almacenar en este 70% de etanol en un congelador de -20 ° C hasta que se necesite.
    5. Después de la fijación, aspirar cuidadosamente el etanol y lavar suavemente el sedimento dos veces con un exceso de FCB. Para lavar:
      1. Añadir un exceso de FCB y resuspender suavemente el pellet.
      2. Centrifugar durante 5 min a 1200 x g para recoger las células de unpellet sa.
      3. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante FCB.
      4. Repita.
    6. Retire la final sobrenadante de lavado FCB de cada alícuota y resuspender en 100 l de FCB. Añadir el anticuerpo primario conjugado con fluorocromo deseado utilizando dilución sugerido por el fabricante. Se incuban las células en hielo con el anticuerpo durante 30 min.
      Nota: si anticuerpos primarios conjugados con fluorocromo no están disponibles, se pueden usar anticuerpos primarios no conjugados.
    7. Para cada fluorocromo utilizado (por ejemplo, FITC, PE), incubar una alícuota de células con 100 FCB ml que contiene IgG isotipo como control negativo.
    8. Incubar una alícuota en 100 ml de FCB que no contiene anticuerpos como un control adicional.
    9. Lave cada alícuota de las células dos veces con FCB como se detalla en el paso 4.1.5. Tras el último lavado, resuspender las alícuotas en 100 ml de FCB y proceder con el análisis de flujo.
      Nota: Si se utilizaron anticuerpos primarios no conjugados: Después de esta etapa de lavado incubar las partes alícuotas en hielo durante 20 min con FCB suplementado con el anticuerpo secundario conjugado a un fluorocromo usando la dilución apropiada sugerido por el fabricante. Lavar dos veces como se describe en el paso 4.1.5.
  2. Análisis de las ASC de flujo: Para el análisis de flujo, un mínimo de 10.000 eventos debe ser contado. Controles sin teñir y isotipo se deben utilizar para establecer puertas de dispersión frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC). Para esto, los controles de anticuerpos no (es decir, no teñidas) de la etapa 4.1.8 se deben utilizar con el fin de eliminar los desechos y ASC muertos. Los controles de isotipo IgG de paso 4.1.7. debe utilizarse para establecer áreas de fluorescencia positiva.

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Resultados

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El contorno protocolo anterior describe un método manual, enzimática para el aislamiento de un SVF de una gran muestra lipoaspirado volumen. Dentro de este SVF son numerosas poblaciones de células, incluyendo la ASC. Numerosos estudios proponen que el cultivo de esta SVF en condiciones de cultivo de tejidos estándar se seleccione para una población de fibroblastos adherente probable que se compone principalmente del tipo ASC. Consistente con esto, hemos demostrado, usando citometría de flujo e inmunofluorescencia, que p...

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Discusión

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El tejido adiposo para el aislamiento de las ASC puede venir en muchas formas: desde piezas sólidas de tejido obtenidas mediante resección o lipoplastia en trozos más pequeños obtenidos a través de cualquiera de extracción jeringa o lipoplastia asistida por succión (es decir, la liposucción). Ya sea que las células más SVF (y por tanto ASC) pueden obtenerse a partir de muestras de tejido adiposo resecados o aspirado es claro como estudios contradictorios se han presentado 16, 17. Es posible que cualq...

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Divulgaciones

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Los autores de este manuscrito son co-inventores de una patente propiedad de la Junta de Regentes de la Universidad de California y licenciado a Cytori Terapéutica.

Agradecimientos

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Los autores desean reconocer y agradecer a aquellos más personal de investigación que han contribuido al desarrollo del protocolo descrito y su aislamiento de la ASC, incluyendo: Dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr. Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD , el Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Rong Zhang, DDS, PhD, Dr. Larissa Rodríguez, MD, Dr. Zeni Alfonso, PhD, y el Dr. John Fraser, PhD. Los resultados presentados fueron financiados, en parte, por las becas de investigación de los Institutos Nacionales de Salud, incluidos los NIAMS e Institutos NIDCR.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivo
DMEM (Dulbecco’ s Modificación de Eagle’ s Medium)Mediatech Cellgro10-013-CVcon 4,5 g/ml de glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio
Penicilina/EstreptomicinaMediatech Cellgro30-002-CI10.000 UI/ml penicilina/10.000 μ g/ml estreptomicina
Anfotericina BMediatech Cellgro30-003-CF250 μ g/ml anfotericina B
10X PBS (solución salina tamponada con fosfo)Mediatech Cellgro25-053-CIsin calcio, sin magnesio
Tripsina/EDTAMediatech Cellgro20-031-CV0,25 % tripsina/2,21mM EDTA
Colagenasa tipo IA (de Clostridium histolyticum)SigmaC2674preparación bruta; < 125 unidades de digestión de colágeno/mg sólido
FBS (Suero Fetal Bovino) inactivado por calorGemini Bioproducts100106fuente USDA, inactivado por calor
Pipetas serológicas de 10 mlGenesee Scientific12-104
Pipetas serológicas de 25 mlGenesee Scientific12-106
Tubos centrífugos de polipropileno de 50 mlGenesee Scientific21-106
Placas de cultivo de tejidos de 100 mmGenesee Scientific25-202
Placas de cultivo de tejidos de 150 mmGenesee Scientific25-203
Unidades de filtro Stericup de 500 mlMembrana MilliporeSCGPU05REPES, 0.22 μ m pore
Filtros de célulasFisherBrand22-363-549100 μ m malla de nylon
dexametasona - soluble en aguaSigmaD-2915
L-ácido ascórbico 2 fosfatoSigmaA-8960
β-glicerofosfato sal disódica SigmaG-9422también conocida como glicerofosfato
insulinaSigmaI-6634hecha de páncreas bovino
indometacinaSigmaI-7378
apo-transferrinaSigmaT-4382
TGFβ 1R& D Systems240-B-002Aceite humano recombinante
Rojo OSigmaO-0625
Azul alciánSigmaA-5268
Nitrato de plataSigmaS-0319
Ácido clorhídricoFisher ScientificA144
ParaformaldehídoFisher Scientific30525-89-4suministrado como stock al 16 %
[encabezado]
Equipo necesario
Clase II A/B Campana de bioseguridadThermo ScientificEnsure tiene líneas de vacío para la aspiración
Centrífuga de sobremesaHermle LabnetZ383Se requiere rotor basculante para tubos de 50 ml, capaz de 1200xg
Baño de agua Fisher Scientific IsotempS52602Qcapacidad de 5-10 L, capaz de 37C
Ayudas de pipeta automatizadasDrummond Pipette Aid XL4-000-105
CO2 IncubadoraThermo ScientificForma 310de calor directo o agua encamisada

Referencias

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