Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos

Resumen

Se describe un protocolo para el aislamiento y purificación de los neutrófilos de médula ósea de ratón por centrifugación en gradiente de densidad y para el etiquetado de neutrófilos usando colorantes CellTracker. Esto representa un método sencillo, rápido, reproducible y económico para la obtención de un gran número de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo o experimentos de transferencia adoptivos y seguimiento.

Resumen

Los neutrófilos son las células efectoras críticas del sistema inmune innato. Ellos son reclutados rápidamente en sitios de inflamación aguda y ejercen efectos protectores o patógenos dependiendo del medio inflamatorio. No obstante, a pesar de la función indispensable de los neutrófilos en la inmunidad, la comprensión detallada de los factores moleculares que median efectos efectoras y inmunopatogénico neutrófilos 'en diferentes enfermedades infecciosas y condiciones inflamatorias que aún falta, en parte debido a su corta vida media, las dificultades con la manipulación de estos las células y la falta de protocolos experimentales fiables para la obtención de un número suficiente de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo y los experimentos de transferencia adoptiva. Por lo tanto, los métodos simples, rápidos, económicos y fiables son muy deseables para la recolección de un número suficiente de los neutrófilos de ratón para evaluar funciones como la fagocitosis, la matanza, la producción de citoquinas, degranulación y la trata. Para ese fin,se presenta un protocolo basado en centrifugación de gradiente de densidad reproducible, que se puede adaptar en cualquier laboratorio para aislar un gran número de neutrófilos desde la médula ósea de ratones con alta pureza y viabilidad. Por otra parte, se presenta un protocolo simple que utiliza colorantes CellTracker para etiquetar los neutrófilos aislados, que pueden entonces ser transferidos de manera adoptiva en ratones receptores y rastreados en varios tejidos durante al menos 4 horas después de la transferencia usando citometría de flujo. El uso de este enfoque, el etiquetado diferencial de los neutrófilos de ratones de tipo salvaje y deficiente en el gen con diferentes colorantes CellTracker se puede emplear con éxito para llevar a cabo estudios de repoblación competitivos para evaluar el papel directo de los genes específicos en el tráfico de los neutrófilos de la sangre a los tejidos diana in vivo .

Introducción

Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en los seres humanos. Ellos son el principal componente celular del sistema inmune innato y actúan como una primera línea de defensa contra los microorganismos invasores. Los pacientes con neutropenia adquirida y las inmunodeficiencias primarias que afectan el número de neutrófilos y / o la función de desarrollar infecciones bacterianas y fúngicas invasoras que amenazan la vida, destacando la importancia de estas células en la defensa de acogida ^1. El reconocimiento inmune de patógenos invasores en el sitio de la infección por sus receptores de reconocimiento de patrones resultados análogos en la inducción ....

Protocolo

1. Aislamiento de células de médula ósea de ratón

1. La eutanasia a los ratones que usan el protocolo de cuidado de animales de la institución comité aprobado y rociar la superficie del animal con 70% de etanol.
2. Hacer una incisión de la piel en la mitad del abdomen y quitar la piel de la parte distal del ratón incluyendo la piel que cubre las extremidades inferiores.
3. Cortar los músculos de las extremidades inferiores con unas tijeras y dislocar cuidadosamente el acetábulo de la articulación de la cadera, evitando romper la cabeza del fémur.
4. Quitar los músculos restantes del fémur y de la tibia con un bisturí y tijeras y separar d....

Resultados

Este protocolo se ha optimizado para la cosecha de células de médula ósea de los ratones y la posterior separación de los neutrófilos de estas células por centrifugación en gradiente de densidad utilizando Histopaque medios de separación de células disponibles comercialmente. Los neutrófilos aislados utilizando este método se puede utilizar para una variedad de estudios de aguas abajo funcional ex vivo y para los experimentos de transferencia adoptiva en ratones receptores.

El rendi.......

Discusión

En este documento se presenta un protocolo fiable, sencillo, rápido y económico para el aislamiento de un gran número de neutrófilos desde la médula ósea de ratones con alta pureza y la viabilidad utilizando un enfoque de centrifugación en gradiente de densidad. Cuando este protocolo se lleva a cabo correctamente, ~ 6-12 × 10 ⁶ neutrófilos pueden ser recuperados de un ratón no infectado y un máximo de ~ 30-40 × 10 ⁶ neutrófilos pueden aislarse a partir de un ratón después de la infección ^6.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI 1640 1X con L-glutamina y 25 mM HEPES	Cellgro	10-041-CV
Suero fetal bovino (inactivado por calor)	GemCell	100500
Penicilina/Estreptomicina (10.000 unidades de penicilina / 10.000 mg/ml de estreptococo)	GIBCO	15140
0.5 M EDTA	Calidad Biológica Inc	351-027-101
Cloruro de sodio al 0,2% y al 1,6%	JT Baker	3624	Las soluciones de cloruro de sodio preparadas con agua destilada y estéril filtradas
Histopaque estéril 1077	Sigma	10771	Histopaque 1077 deben llevarse a 18-26 ° C antes de usar
Histopaque filtrado estéril 1119	Sigma	11191	Histopaque 1119 debe llevarse a 18-26 ° C antes de usar
solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin calcio y magnesio	Cellgro	210-40-CV
Alcohol etílico (200 grados)	The Warner Graham Company	64-17-5
CellTracker Green (CMFDA, diacetato de 5-clorometilfluoresceína)	Invitrogen	C-7025	Prepare soluciones madre de 10 mM en DMSO, alícuota y almacene a -80 ° C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(y 6)-4-Clorometil Benzoyl Amino Tetrametilrodamina)	Invitrogen	C-2927	Prepare soluciones madre de 10 mM en DMSO, alícuota y almacene a -80 ° C
Anti-ratón CD45 (Clon 30-F11)	eBioscience	170451-82
Anti-ratón Ly6G (Clon 1A8)	BD Pharmingen	551461
Anti-ratón Ly6G (Clon 1A8)	BD Pharmingen	560599
Anti-ratón CD11b (Clon M1/70)	eBioscience	47-0112-82
Anti-ratón CD16/CD32 (Ratón BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Uso con dilución 1:100
VIVO/MUERTO Kit de tinción de células muertas azules fijables	Sondas moleculares	L-23105	Uso con dilución 1:1000
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma	67-68-5
Solución de paraformaldehído, 4% en PBS	USB Corporation	19943
			Tabla 1. Reactivos para el aislamiento, marcaje y seguimiento de neutrófilos transferidos adoptivamente.
			Materials
C57BL/6 ratones	Taconic
Tubos de centrífuga de 15 ml	Corning	430053
Tubos de centrífuga de 50 ml	BD Falcon	352070
Pipetas serológicas de 25 ml	Celltreat	229225B
Pipetas serológicas de 10 ml	Celltreat	229210B
Pipetas serológicas de 5 ml	Celltreat	229205B
Pipetas Pasteur (3 ml)	BD Falcon	357575
Jeringas de 12 ml	Kendall monoject	512878
25 g x 5/8 pulg. Agujas (agujas de deslizamiento de precisión)	BD	305122
Filtros de celdas de 100 mm	BD Falcon	352360
Placas de Petri bactericidas	BD Falcon	351029
Combitips Plus Biopur	Eppendorf	2249608-5
Instrumentos de disección de ratones (tijeras, fórceps, bisturí)	Instrumentos de investigación biomédica	10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000	Instrumentos esterilizados antes de su uso
			Equipment
Tissue culture hood	The Baker Company	SG403
Centrífuga refrigerada	Thermo Fischer Scientific	75004521
37 y s° C baño de agua agitable	Thermo Fischer Scientific	3166721
			Tabla 2. Lista de Materiales y Equipos utilizados en este protocolo.