Codificados genéticamente-sondas moleculares para Estudiar G receptores acoplados a proteínas

Resumen

Nos genéticamente-codificar el aminoácido no natural, p-azido-L-fenilalanina en varias posiciones específicas en los GPCR y mostrar la versatilidad del grupo azido en diferentes aplicaciones. Estos incluyen una tecnología fotorreticulación dirigido a identificar los residuos en el bolsillo de unión a ligando de un GPCR, y la modificación bioorthogonal específica de sitio de los GPCR con una etiqueta de epítopo de péptido o de la sonda fluorescente.

Resumen

Para facilitar los estudios estructurales y dinámicas de proteína G-receptor acoplado (GPCR) de señalización complejos, se necesitan nuevos enfoques para introducir sondas o etiquetas informativas en receptores expresados ​​que no perturban la función del receptor. Se utilizó tecnología de supresión de ámbar codón para genéticamente a codificar el aminoácido no natural, p-azido-L-fenilalanina (azf) en varias posiciones específicas en los GPCRs heteróloga expresadas en células de mamífero. La versatilidad del grupo azido se ilustra aquí en diferentes aplicaciones para estudiar los GPCR en su ambiente celular nativo o bajo condiciones de detergente solubilizadas. En primer lugar, demostramos una tecnología fotorreticulación específica basada en células para identificar los residuos en el bolsillo de unión a ligando de GPCR en donde un ligando de molécula pequeña marcada con tritio se reticula a un aminoácido codificado genéticamente azido-. Se demuestra a continuación, la modificación específica de sitio de los GPCR por la bioorthogonal ligadura de reacción de Staudinger-Bertozzición que se dirige el grupo azido el uso de derivados de fosfina. Se discute una estrategia general para el objetivo marcado péptido epítopo de las proteínas de membrana expresadas en la cultura y su detección mediante un enfoque basado en ELISA de células enteras. Por último, se muestra que AZF-GPCR pueden ser etiquetados de forma selectiva con sondas fluorescentes. Las metodologías discutidos son generales, en que pueden, en principio, aplicarse a cualquier posición del aminoácido en cualquiera de GPCR expresado para interrogar a los complejos de señalización activo.

Introducción

Receptores acoplados a proteínas G (GPCRs heptahelical) comprenden una superfamilia de proteínas de la membrana altamente dinámicos que median señales extracelulares importantes y diversos. En el paradigma clásico, la activación del receptor se acopla con los cambios conformacionales inducidos por ligando. ^{1, 2} avances recientes en biología estructural de los GPCR han proporcionado información significativa sobre los mecanismos moleculares de la señalización transmembrana. ^3-5 Sin embargo, para entender con mayor precisión la química mecanismo funcional y dinámica estructural de señalización de GPCR, se requiere un conjunto de herramientas de en....

Protocolo

1. Sitio específico de incorporación genética de Unnatural Aminoácidos en GPCRs

1. Mantener las células HEK293T en medio DMEM (4,5 g / l de glucosa, glutamina 2 mM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) a 37 ° C en una atmósfera de _CO2 al 5%.
2. Transfectar las células cultivadas a 60-80% de confluencia en una placa de 10 cm usando reactivo Lipofectamine Plus.
   1. Para 750 l de DMEM, añadir 10 l de reactivo Plus, 3,5 g de ADNc de GPCR (pMT4. Rho o pcDNA 3.1. CCR5) que contiene el codón de parada ámbar en una posición deseada, 3,5 g de ADNc supresor de ARNt (pSVB.Yam) y 0,35 g de ADNc sintetasa mutante-amino acil ARNt para

Resultados

Se empleó la metodología de mutagénesis de aminoácidos no naturales a sitios específicos introducir sondas moleculares en un GPCR utilizando el codón ámbar tecnología de supresión. El esquema de la figura 1 resume los pasos más destacados de la metodología y de las diversas aplicaciones de la incorporación de la SAU versátil, p-azido-L-fenilalanina (AZF), en GPCRs. Expresión de AZF-GPCR en células de mamíferos permite dirigido fotorreticulación a ligandos, y dirigido etiquetado péptido epítopo .......

Discusión

Se describe aquí una metodología sólida para la incorporación específica de sitio de una sonda reactiva, AZF, en GPCRs y demostrar tres aplicaciones útiles de esta herramienta para el estudio de la estructura y dinámica de los GPCRs. Nuestro método para sitios específicos incorporar UAAs elude un problema fundamental con una estrategia alternativa basada en el etiquetado químicamente ^{32, 33} o adjuntar photocrosslinkers ³⁴ a un solo mutante cisteína accesible. Aunque, las químicas que se dirigen a g.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Plásmido pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
pcDNA.RS de plásmidos para azF			(Ye et al., 2009)
Plásmidos pMT4.Rho y pcDNA 3.1.CCR5			Opcionalmente contienen el codón de parada ámbar (TAG) en la posición deseada
Células			Células adherentes
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)	Gibco	10566
solución salina tamponada con fosfato	Gibco	14200
Suero fetal bovino	Gemini Bioproductos	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-fenilalanina	Chem-Impex International	6162
			Tabla 1. Incorporación genética específica de sitio de aminoácidos no naturales en materiales GPCRs
Lámpara UV-A Maxima ML-3500S	Spectronics Corporation		azF se activa con luz de 365 nm
Solución salina tamponada de Hank (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Albúmina sérica bovina	Roche	3117405001
		marcado con tritio	De un colaborador (Grunbeck et al., 2012)
1% (p/v) n-dodecil-β-D-maltósido	Anatrace	D310LA
		de 1D4-sefarosa	1D4 mAb inmovilizada en resina de sefarorosa 2B activada por CNBr
1% (p/v) dodecil sulfato de sodio (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 - 12% de los geles SDS	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE realizados en el aparato NuPAGE
Aparato Trans-Blot SD	Biorad		Aparato para transferencia semiseca
Membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de Immobilon	Millipore	IPVH00010
Leche descremada	Fisher Scientific	NC9934262
Preadolescente-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Fluido de centelleo
Viales de centelleo	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Contador de centelleo líquido	Perkin Elmer		Contador de centelleo
beta Anti-rodopsina 1D4 mAb	Centro Nacional de Cultivo Celular	personalizado
Peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado anti-ratón IgG	KPL, Inc.	474-1806
Sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR película	Denville	E3018
			Tabla 2. Materiales de fotoreticulación dirigidos
0,25% Tripsina	Invitrogen	15050065
FLAG-triarilfosfina	Sigma	GPHOS1
BANDERA M2 mAb	Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poly-D-lisina	Sigma	P6407
Placa de 96 pocillos	Costar	3601	Fondo transparente, alta unión EIA/RIA
Solución salina tamponada con fosfato (calcio, magnesio)	Gibco	14040
16% Paraformaldehído	EMS	28908
KPL, Inc.	conjugada con HRP	474-1516	y nbsp;
IgG anti-conejo KPL	, Inc.	474-1516	y nbsp;
Amplex Red	Invitrogen	A12222
Peróxido de hidrógeno	DE Productos para el cuidado de la salud	97-93399
Lector de placas multipocillo de fluorescencia CytoFluor II	Perseptive Biosystems
			Tabla 3. Marcado dirigido de péptidos-epítopos y materiales ELISA de superficie celular
Fluoresceína-fosfina			(Huber et al., presentado en 2012)
Nonapéptido (péptido C9)	AnaSpec	62190	Péptido que imita el epítopo 1D4 NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (p/v) n-dodecil-β-D-maltósido	Anatrace	D310LA
		1D4-sepharose	1D4 mAb inmovilizado en resina de sepharose 2B activada por CNBr
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS geles	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE realizado en aparatos NuPAGE
Escáner de fluorescencia Confocal Typhoon 9400	GE Healthcare	descatalogado	Escáner con láser de longitud de onda de 488
nm			Tabla 4. Materiales de etiquetado fluorescentes

HEK 293T ligando Resina .Resina