Análisis confocal tridimensional de marcadores microglía / macrófagos de polarización en Experimental Brain Injury

Después de una lesión cerebral aguda, microglia se activan rápidamente y se someten morfológica dramática y fenotípica cambios ^1-3. Esta respuesta intrínseca está asociada a la contratación de los macrófagos de origen sanguíneo que migran en el ^4,5 parénquima cerebral lesionado. El papel de los macrófagos y microglia que antigénicamente no son distinguibles (en adelante el M / M) en el daño cerebral es todavía debatido. Un número creciente de estudios indican que, de manera similar a lo descrito para los macrófagos periféricos, la microglía y los macrófagos reclutados cerebro pueden asumir diferentes fenotipos cuyos extremos corresponden a classic pro-inflamatoria tóxica (M1) o de protección (M2) fenotipo antiinflamatorio. Los diferentes estados de activación, incluyendo la secreción de factores pro-o anti-inflamatorias, la liberación de moléculas neurotróficas y la actividad lisosomal se caracterizan por un patrón específico de marcadores fenotípicos, cuya expresión depende de lo temporalevolución del entorno circundante. La caracterización de estos fenotipos M / M en el cerebro lesionado es todavía escasa. Se utilizó un modelo murino bien establecida de pMCAo para analizar la expresión M / M y la evolución después del accidente cerebrovascular. Protocolos de inmunofluorescencia con base aquí presentados tienen como objetivo conseguir una idea de la apariencia de los marcadores específicos de M / M fenotipo, su localización y celular co-expresión en el área isquémica. Investigamos unas pocas moléculas asociadas a diferentes estado de activación o fenotipo, es decir, CD11b, un marcador de superficie expresada por los leucocitos y un marcador ampliamente utilizado de M / M de activación / contratación ^6-8, CD68 un marcador de lisosomas ^6,7 y YM1 un secretora proteína expresada por activados alternativamente (M2) y los macrófagos asociados a la recuperación y restauración de la función ^9-10.

Cuando dos marcadores son expresados ​​por la misma célula, pero en diferentes compartimentos subcelulares, colocalización por sí sola no puede ser mucho informative. En este caso, el análisis de coexpresión se puede realizar mediante el uso de una sola vista en planta y por las representaciones tridimensionales. Estamos aquí describir un protocolo para obtener un análisis tridimensional completo de coexpresión del marcador.

1. Inmunofluorescencia

El siguiente protocolo se realiza en secciones criogénicas cerebrales coronales obtenidas de ratones perfundidos transcardialmente (20 ml de PBS, 0,1 moles / litro, pH 7,4, seguido de 50 ml de paraformaldehído al 4% enfriado en PBS). Después de la perfusión, los cerebros se retiran y se transfieren a 30% de sacarosa en PBS a 4 ° C durante la noche para crioprotección cuidadosamente. Los cerebros se congelan rápidamente por inmersión en isopentano a - 45 ° C durante 3 min antes de ser sellado en viales y se almacenaron a -70 ° C hasta su uso. Criosecciones cerebrales coronales (20 m) se cortan en serie y se sometieron a protocolo de inmunofluorescencia ^{11, 6.}

Llevar todos reactivos y muestras a temperatura ambiente antes de su uso. Por favor, tenga en cuenta que los presentados diluciones de trabajo de anticuerpos en suero y el resultado de las pruebas realizadas con el fin de obtener el mejor rendimiento. Cuando se utilizan diferentes anticuerpos y el suero, el protocolo debe ser validado.

Un ejemplo de los resultados obtenidos cuando se llevan a cabo protocolos de etiquetado y adquisiciones confocales en la región isquémica se ilustra en las Figuras 1A y 1B. Una vista bidimensional de las imágenes adquiridas muestra que a las veinticuatro horas después de la isquemia (A), el marcador lisosomal CD68 (verde) se expresa en las células ameboides hipertróficas CD11b (rojo) presentes en el núcleo isquémico. En la zona fronteriza (B), las células CD11b positivas muestran cuerpos celulares redondos y procesos ramificados positivos a CD68. Las proyecciones del eje Z (parte derecha e inferior de A y B) permiten visualizar si la distribución de marcadores documentada en la vista de plano único también está presente a lo largo del eje Z. Cuando se produce la colocalización, se generan píxeles amarillos. CD11b es el receptor de los fragmentos C3 y presenta una distribución de membrana. CD68 marca los lisosomas y, por lo tanto, está presente principalmente en el citosol. Las células CD11b/CD68 doble positivas suelen tener un pequeño porcentaje de vóxeles colocalizados y, en la mayoría de los casos, CD11b rodea a CD68 (Figura 1A). Solo cuando los fagosomas se unen a la membrana celular durante el proceso fagocítico, se realiza la colocalización entre CD11b y CD68 (Figura 1B).

En la Figura 2, se informa sobre el procesamiento de imágenes que conduce a la definición de la coexpresión del marcador. En A, la vista tridimensional de las imágenes confocales adquiridas indica la presencia de células CD68 positivas (verde) e Ym1 (rojo) positivas, pero no se puede utilizar para la definición de colocalización. De hecho, los vóxeles fluorescentes que se colocan paralelos a la vista del observador pueden producir una señal colocalizada (amarillo), que puede no estar relacionada con la distancia real entre los marcadores (no son objetos sólidos y puede haber efectos de transparencia). Para definir la colocalización, se debe preferir una vista de un solo plano con proyecciones del eje z (B). Desplazándose por el eje Z buscando la colocalización (píxeles amarillos), se obtiene la proyección del eje Z (visible a la derecha y a la parte inferior de B). Los vóxeles fluorescentes se pueden convertir en objetos sólidos mediante representación tridimensional (Figura 2C). La rotación del volumen permite la mejor vista (de C' a C''''') para mirar los objetos y asignar correctamente la expresión del marcador a un cuerpo celular específico. El gran aumento y la vista sólida de las representaciones tridimensionales permiten definir la expresión de marcadores en grupos de células (D-D''). Después de un gran aumento y representación 3D, los dos marcadores (CD68 e Ym1) parecen pertenecer a células diferentes, aunque muy próximas.

En la Figura 3 se muestra un ejemplo de la evaluación de la coexpresión del marcador fenotípico M/M en el área isquémica. Se investiga la coexpresión de CD11b (rojo), un marcador de activación/reclutamiento M/M, CD68 (verde), un marcador asociado con los lisosomas, así como Ym1, expresado por M/M activado alternativo en el área isquémica. Para proporcionar detalles sobre el estado funcional de M/M, evaluamos su relación con las neuronas (NeuN, en azul). Las imágenes del área muestreada (Figuras 3A-3D) se evalúan como objetos tridimensionales (Figuras 3A'-3D'). Las células dobles positivas CD11b/CD68 se examinan mediante representación tridimensional (Figuras 3A' y 3B'). El análisis revela que las neuronas (azules) a menudo están envueltas por células CD11b positivas tanto en el núcleo isquémico como en la zona fronteriza a las 24 horas después de la isquemia. En la mayoría de los casos, las células CD11b que rodean a las neuronas son positivas para CD68 en ambas zonas, lo que sugiere que estas células están involucradas en una fagocitosis activa. Ninguna de las células dobles positivas CD11b/Ym1 (Figuras 3C y 3C') parece participar en una interacción fagocítica con las neuronas, siendo las células CD11b/Ym1 dobles positivas nunca están en contacto con las células NeuN positivas.

Tabla 1. Ajuste fino de la dilución de trabajo para el anticuerpo anti-CD11b de rata.

Figura 1. Coexpresión de CD11b (rojo) y CD68 (verde) 24 horas después de pMCAO. La microscopía confocal para CD11b y CD68 muestra que en el núcleo isquémico las células CD11b son prevalente globulares y algunas de ellas son positivas para CD68 (A). En la zona fronteriza (B), tanto las células CD11b redondeadas como las ramificadas son positivas para CD68. Los núcleos están en azul. Barras: 20 μm.

Figura 2. Coexpresión de CD68 (verde) e Ym1 (rojo) a las 24 h después de pMCAO. Vista tridimensional de una imagen confocal adquirida en el área isquémica, CD68 (verde), Ym1 (rojo) y núcleos (azul) (A). La vista de plano único con proyecciones del eje z excluye la presencia de vóxeles colocalizados (sin señal amarilla, B). La representación tridimensional convierte vóxeles fluorescentes en objetos sólidos (C). El volumen se gira para encontrar la mejor vista (C'-C''''). Mire más de cerca un grupo de celdas (D). La representación tridimensional ayuda a definir si los marcadores se expresan en la misma celda en el caso de un grupo de celdas (D'). CD68 e Ym1, aunque están en estrecho contacto, no son coexpresadas por las mismas células, estando claramente asociadas a diferentes núcleos (D''). Barras: 5 μm. Haga clic aquí para ver la figura más grande.

Figura 3. Coexpresión de CD11b (rojo) y NeuN (azul) con CD68 (verde) o con Ym1 a las 24 h después de pMCAO. La microscopía confocal en el núcleo isquémico (A; representación 3D en A') y en la zona fronteriza (B-B') revela que las células dobles positivas CD11b/CD68 envuelven a las células NeuN positivas, lo que posiblemente indica fagocitosis de las neuronas. Las células Ym1 positivas se localizan exclusivamente en el núcleo isquémico (C-D). El análisis confocal de las células dobles positivas CD11b/Ym1 muestra que no parecen implicadas en una interacción fagocítica con las neuronas (células NeuN positivas, C; representación 3D en C'). Las células positivas simples CD11b tanto en el núcleo isquémico (C-C') como en la zona fronteriza (D-D') rodean a las neuronas. Barra: 20 μm. Haga clic aquí para ver la figura más grande.

Los autores no tienen nada que revelar.