Control cuantitativo y temporal del Microambiente oxígeno en el Islote de un solo nivel

Summary

El control microfluídico del oxígeno confiere algo más que comodidad y velocidad sobre las cámaras hipóxicas para experimentos biológicos. Especialmente cuando se implementa a través de la difusión a través de una membrana, el oxígeno microfluídico puede proporcionar modulaciones simultáneas de fase líquida y gaseosa a nivel de microescala. Esta técnica permite realizar experimentos dinámicos multiparamétricos críticos para el estudio de la fisiopatología de los islotes.

Abstract

Oxigenación simultánea y seguimiento de los factores de acoplamiento estímulo-secreción de glucosa en una sola técnica es crítico para el modelado de estados fisiopatológicos de la hipoxia de los islotes, especialmente en entornos de trasplante. Técnicas de cámara de hipoxia estándar no pueden modular ambas estimulaciones al mismo tiempo ni proporcionar supervisión en tiempo real de los factores de acoplamiento estímulo-secreción de glucosa. Para hacer frente a estas dificultades, hemos aplicado una técnica de microfluidos de capas múltiples para integrar tanto acuosas como modulaciones de fase de gas a través de una membrana de difusión. Esto crea un sándwich de estimulación alrededor de los islotes microscaled dentro de la polidimetilsiloxano transparente (PDMS) de dispositivo, que permita el control de los factores de acoplamiento antes mencionados a través de microscopía de fluorescencia. Además, la entrada de gas es controlado por un par de Microdosificador, proporcionando, modulaciones cuantitativos sub-minuto de oxígeno entre 0-21%. Esta hipoxia intermitente se aplica para investigar un nuevo fenómeno de la islat preacondicionamiento. Por otra parte, armado con microscopía multimodal, hemos sido capaces de mirar calcio detallada y dinámica del canal K _ATP durante estos eventos de hipoxia. Tenemos la visión de la hipoxia de microfluidos, especialmente esta técnica de fase dual simultáneo, como una herramienta valiosa en el estudio de los islotes, así como muchos tejidos in vivo ex.

Introduction

Hipoxia dinámica es importante en la biología, especialmente para los trasplantes de islotes

Hipoxia dinámica es una fisiológico importante, así como parámetro fisiopatológico en muchos tejidos biológicos. Cambio en oxígeno, por ejemplo, es una señal potente del desarrollo en la angiogénesis. Por otra parte, los patrones espaciales y temporales de la hipoxia modulan HIF1-alfa y juegan un papel en enfermedades como el cáncer de páncreas. La hipoxia es también un factor de confusión que afectan los resultados del trasplante de islotes. Recientemente, temporalmente, las oscilaciones de la hipoxia, o hipoxia intermitente (IH) han demostrado beneficios en los islotes "de preacondicionamiento" ^1. Sin embargo, los efectos de la hipoxia estáticos y transitorios sobre la fisiología del islote aún no han sido bien entendidas o estudiadas, sobre todo debido a la falta de herramientas adecuadas para controlar el microambiente de los islotes.

Los islotes están bien vascularizados in vivo

Islotes pancreáticos son 50-400 Agregados esferoidales m de células endocrinas, incluyendo las células beta y alfa-células que son responsables de la homeostasis de la glucosa; 56. Cuando los islotes se exponen a la glucosa estimulador en la sangre, la absorción y la glucólisis plomo para la producción de ATP, que se abre de potasio sensibles a ATP _(KATP) canales y los resultados en el influjo de calcio que desencadena la exocitosis de los gránulos de insulina. El oxígeno es importante para conducir este proceso en gran medida metabólica y la secreción de insulina está influenciada significativamente por la dinámica del flujo de sangre y el suministro de oxígeno además de los gradientes de glucosa. Islotes realizar fácilmente esta respuesta de la glucosa de la insulina in vivo, ya que son altamente perfundidos en el páncreas, cada uno dentro de una longitud de la célula de un vaso capilar. Sin embargo, la densa red de capilares intraislet se elimina por la colagenasa durante islote aislamiento ^2,3. En consecuencia, los suministros de oxígeno y de nutrientes se ven limitados a un perímetro de 100 m debido a las limitaciones de difusión.

paso éxito "> Las técnicas actuales han limitado en la recreación microambiente islote

Dinámica de oxígeno y de glucosa nativos Recreating de los islotes, clave para el modelado de condiciones fisiológicas y fisiopatológicas, es difícil de lograr con cámaras hipóxicas estándar que requieren flujo elaborada y carecen de un seguimiento continuo de las funciones de los islotes. Por otra parte, las terapias de trasplante para la diabetes Tipo I exponen islotes aislados a la hipoxia en el sistema portal hepático ⁴ que tiene pO mucho más bajo ₂ (<2%, 5-15 mm de Hg) en comparación con el páncreas fisiológica (5,6%, 40 mmHg). Post-trasplante, los injertos de islotes tomar dos semanas o más para ser revascularizado. Se ha demostrado que la exposición hipóxica deteriora la glucosa-insulina mecanismo de acoplamiento de los islotes. Entre los factores de acoplamiento estímulo-secreción, señalización de calcio, potenciales mitocondriales, y la cinética de la insulina puede ser fácilmente monitoreada usando microfluidos. Nuestra técnica de microfluidos anterior demostró esta reseguimiento de al-tiempo con una modulación precisa del microambiente acuosa alrededor solo islote ^5,6. Sin embargo, la cuantificación de deterioro hipóxico del islote está obstaculizado por la falta de técnicas de estimulación y la monitorización simultánea. Por lo tanto, la combinación de control de microfluidos de oxígeno y monitoreo de los islotes puede mejorar estudios de hipoxia de los islotes.

Microfluídica pueden recrear y modular el microambiente acuosa y oxígeno

La técnica estándar para estudios de tejidos y la cultura de hipoxia se ha basado en cámaras de hipoxia. En general, las cámaras de hipoxia proporcionan concentraciones individuales de oxígeno con tiempos de equilibrio en ~ 10-30 min, incompatibles con la hipoxia dinámico minutos en escala. Dos estudios recientes utilizan pequeñas cámaras personalizadas para exposición a la hipoxia intermitente en ratones enteros, con resultados contradictorios sobre la respuesta a la insulina inducida por glucosa ^7,8. Tenga en cuenta que en todo el nivel animal, el oxígeno respirado no es directamente tranprogramado para islotes capilar pO _2, debido a los controles en el sistema respiratorio. Además, estos estudios no tienen los niveles de oxígeno estandarizados, ni prevén medidas en tiempo real a nivel de tejido de los islotes.

Por otro lado, la microfluídica de oxígeno pueden superar estas limitaciones mediante el control de oxígeno a través de redes de canales de gas. Por otra parte, la microfluídica es compatible con imágenes en vivo durante la modulación de oxígeno, una hazaña en la actualidad no es posible con cámaras hipóxicas estándar. Un número de estos nuevos enfoques de microfluidos utilizar la permeabilidad a los gases de polidimetilsiloxano para disolver las concentraciones de oxígeno en microcanales que fluyen los medios de comunicación sobre las células diana ^9-14. Estos dispositivos también se han integrado varias concentraciones discretas de oxígeno, sensores de oxígeno basados ​​en fluorescencia, e incluso la generación química de oxígeno en el chip.

Microfluidos basada en solvatación líquidos tienen dificultades para mantener, gradientes continuos estables como iT depende de mezcla convectiva que es sensible a las condiciones de flujo. En comparación, la técnica que usamos aquí se centra en la disminución de la trayectoria de difusión de la entrega de oxígeno. La solvatación de gas y el flujo de cizallamiento se eliminan mediante la difusión de oxígeno directamente a través de una membrana sembrada con células o tejidos de los islotes. Esto elimina los microfluidos adicionales necesarios para el control de solvatación y evita el estrés de cizalla innecesarios a los islotes, que a su vez puede desencadenar la liberación de insulina. Esta plataforma se ha utilizado para demostrar las especies reactivas del oxígeno (ROS) sobre regulación en los extremos tanto hiperóxicas e hipóxicas (2-97% O ₂₎ en el cultivo de células ^1,15. Debido a la prestación directa de oxígeno y la eliminación del flujo de tensiones, nuestra plataforma basada en la difusión proporciona la solución óptima de microfluidos para el estudio de la hipoxia de los islotes.

Estimulación y monitoreo multimodal

Microfluidos basada en la difusión también aporta beneficios adicionales cuando se adapta para el estudio de millas del islotecrophysiology. Mediante el uso de una membrana como barrera de difusión, el líquido puede ser aislado de las modulaciones de oxígeno, lo que permite controles de estimulaciones acuosas de glucosa independientemente de estímulos hipóxicos. Esto crea una estimulación simultánea de sándwich que espacialmente pin-puntos de entrega a los islotes. Además, como el gas es modulada temporalmente a través de microinyectores computarizados, que pueden modular la concentración de oxígeno 21 a 0% digitalmente con el tiempo transitorio menos de 60 seg. Los controles dinámicos de oxígeno y el microambiente de la glucosa en el microscopio permiten un protocolo multimodal en tiempo real que no sería posible o extraordinariamente engorroso el uso de cámaras de hipoxia estándar. El uso de este dispositivo, la señalización de calcio (Fura-AM), los potenciales mitocondriales (rodamina 123), y la cinética de insulina (ELISA) fueron monitorizados para proporcionar una imagen completa de la respuesta dinámica de la glucosa de la insulina en condiciones de hipoxia.

Protocol

1. Preparando los islotes del ratón

1. Diseccionar ratones C57BL/6 y aislar islotes mediante digestión de colagenasa y separación por gradiente de densidad de Ficoll. (Refiérase a los artículos de JOVE referenciados en^2,3).
2. Incubar los islotes en medio RPMI-1640 que contenga 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 20 mM de HEPES en placas de Petri (37 °C, 5% de CO₂). Después del aislamiento, islotes de cultivo durante 24 horas antes de su uso en experimentos. Utilice los islotes dentro de 1-2 días para garantizar resultados consistentes.

2. Creación de la plataforma microfluídica

1. Generar las geometrías de la microestructura en fotomáscaras de transparencia para cada capa del dispositivo: 1) entrada y salida, 2) capa microfluídica de glucosa con cámara de perifusión (8 mm de diámetro x 3 mm, 150 μl), 3) membrana de 200 μm con micropocillos (500 μm de diámetro, 100 μm de profundidad), y 4) capas microfluídicas de gas.
2. Para fabricar la capa de entrada y salida, vierta PDMS premezclado y desgasificado a una altura de 1,5 mm en una placa de Petri en blanco y cure a 80 °C durante 2 horas. Perfore puertos de entrada/salida de 2 mm de diámetro.
3. Para fabricar la capa microfluídica de glucosa, haga girar dos capas de 350 μm de SU8-2150 para formar una sola capa de 700 μm en una oblea de silicio de 4 pulgadas.
   1. Exponga la luz ultravioleta a través de la fotomáscara adecuada para transferir el patrón de microcanales al SU8 después del revelado, produciendo un maestro de 700 μm de altura.
   2. Vierta PDMS premezclado y desgasificado en este maestro a una altura de 3 mm y cure a 80 °C durante 2 horas. Corte este PDMS para darle forma con una cuchilla de afeitar.
   3. Perfore los puertos de entrada/salida de 2 mm de diámetro, así como la cámara de 8 mm de diámetro.
4. Para fabricar la membrana de 200 μm con micropocillos, centrifuga SU8-2100 a 100 μm. Aplique la misma litografía UV para transferir patrones de micropocillos a este maestro de 100 μm de altura.
   1. Haga girar PDMS premezclado y desgasificado en este maestro a 900 rpm durante 30 segundos y cure a 80 °C durante 10 min. Gire una segunda capa encima de la primera utilizando las mismas condiciones, lo que da como resultado una membrana de PDMS de 200 μm que contiene patrones de micropocillos.
   2. Perfore puertos de entrada/salida de 2 mm de diámetro a través de esta membrana
5. Para fabricar la capa microfluídica de gas, centrifuga SU8-2100 a 100 μm. Aplique la misma litografía UV para transferir patrones microfluídicos de gas a este maestro de 100 μm de altura.
   1. Vierta el PDMS premezclado y desgasificado sobre este maestro a una altura de 1,5 mm y cure a 80 °C durante 2 horas. Corte el PDMS para darle forma con una cuchilla de afeitar.
   2. Perfore puertos de entrada/salida de 2 mm de diámetro a través de esta capa
6. Para unir las múltiples capas, prepárelas limpiándolas con cinta adhesiva, exponiéndolas al arco de corona y luego alineándolas a mano en el siguiente orden.
   1. Adhiera la membrana a la capa de gas inferior con los micropocillos hacia arriba.
   2. Unir la glucosa microfluídica en la parte superior de la membrana del micropocillo.
   3. Pega la capa de entrada y salida en la parte superior, encapsulando todo el conjunto.
   4. Refuerce la unión agregando 1 kg de peso encima y hornee a 100 °C durante 3 horas.
7. Pruebe las fugas del dispositivo completo cargando agua en la capa acuosa y luego sumergiendo todo el dispositivo bajo el agua. Luego, haga fluir el aire a través de la capa de gas con una jeringa vacía.
8. Esterilice los dispositivos sin fugas con etanol al 70% a través de la capa acuosa y luego enjuague con tampón PBS, en el que el dispositivo se almacena a 4 °C hasta su uso.

3. Configuración del microdispensador

1. Obtenga 2 microdispensadores, fuentes de alimentación de 5 V y 20 V CC y una placa de E/S digital para construir la configuración de mezcla y suministro de oxígeno.
   1. Conecte los cables de control de los microdispensadores a las unidades de controlador incluidas.
   2. Conecte los controladores a la placa de E/S digital en los puertos correspondientes a los controles de Labview.
   3. Conecte las fuentes de alimentación de 5 V y 20 V a los contactos correspondientes de las unidades de accionamiento.
   4. Conecte la E/S digital a una computadora portátil para ejecutar códigos Labview para el control de gas (Apéndice).
2. Conecte un microdosificador al nitrógeno y otro al aire comprimido, ambos con 5% de CO₂. Ajuste ambos gases a 2 psi. Conecte las salidas de los dispensadores en una unión en T antes de ingresar al dispositivo microfluídico.
3. Utilizando un dispositivo a prueba de fugas, caracterice la respuesta transitoria de la modulación de oxígeno mediante el ciclo de los microdispensadores entre 5-21% de oxígeno, mientras mide el oxígeno disuelto en el agua con un sensor de oxígeno de fibra óptica (consulte la lista de equipos y los resultados representativos).

4. Configuración en la microscopía

1. Monte el dispositivo en la platina calentada del microscopio invertido.
2. Conecte los gases 0% y 21%_O2 al dispositivo y calibre con el sensor de oxígeno.
3. Conecte el puerto de salida de la microfluídica de glucosa a un colector de fracciones.
4. Prepare el tampón de bicarbonato Krebs Ringer (KRB): 129 mM de NaCl, 5 mM de NaHCO₃, 4,7 mM de KCl, 1,2 mM de KH₂PO₄, 1 mM de CaCl_{2,2H 2}O, 1,2 mM de MgSO,_{4,7H 2}O, 10 mM de HEPES pH 7,35-7,40, 2 mM de glucosa basal y 5% de FBS.
5. Preparar dos soluciones tampón que contengan 2 mM y 14 mM de glucosa respectivamente en tubos cónicos de 50 ml bañados en baño de agua a 37 °C.
6. Conecte una bomba peristáltica para extraer el tampón a 250 μl/min en el tubo. Haga fluir el tubo sobre una placa calefactora a 37 °C antes de entrar en el dispositivo microfluídico.
7. Para teñir los islotes, agregue Fura-2 AM en DMSO y Rh123 en etanol al 100% a 2 ml de KRB para alcanzar concentraciones finales de colorante de 5 μM y 2,5 μM, respectivamente.
8. Recoja los islotes con una pipeta de 10 μl e incube en colorantes durante 30 min a 37 °C.
9. Cargue aproximadamente 20 islotes en el dispositivo a través de la entrada de microcanal de glucosa. Dirija los islotes a la cámara cebando el tampón desde la salida hasta la entrada.
10. Perfunda los islotes en tampón durante 10 minutos para lavar el exceso de tintes.

5. Ejecución de la estimulación simultánea de oxígeno y glucosa

1. Administre un pulso de estimulación de glucosa con 5 min de línea de base establecido por KRB2, seguido de 15 min de estimulación de 14 mM, luego lave durante 15 min en KRB2.
2. Récord de longitud de onda de excitación de 340/380 nm para Fura-2 y emisión de 534 para Rh123.
3. Realice mediciones de un pulso normal (14 mM normóxico) antes de cada experimento.
4. Para la modulación del oxígeno (hipoxia/hipoxia intermitente), solo aplique flujo tampón durante los pasos de estimulación y lavado y ningún flujo en otros pasos, para minimizar las perturbaciones convectivas.
5. Recoja los efluentes de la salida de glucosa a intervalos de 1 minuto para el ensayo de insulina ELISA.

Results

Un elemento central de esta técnica de hipoxia de islotes es la capacidad de modular la estimulación de fase acuosa y gaseosa en la misma cámara microfluídica con transitorios a escala de minutos. La Figura 1 es un resultado representativo de las a) estimulaciones duales y b) modulaciones rápidas medidas dentro de la cámara de los islotes. La modulación acuosa, demostrada por la introducción de fluoresceína en la cámara, logra el equilibrio en tres o cuatro minutos de mezcla. Además, el oxígeno se puede ...

Discussion

Las múltiples modalidades integradas en esta técnica de hipoxia de islotes presentan varios puntos señalados aquí para la resolución de problemas. Primero, los islotes aislados continúan degradándose y desintegrándose en cultivo debido a las enzimas digestivas de las células acinares. Por lo tanto, estandarizar los experimentos a 1-2 días después del aislamiento de los islotes es fundamental para obtener resultados consistentes. En segundo lugar, el flujo acuoso se detuvo durante la hipoxia y la hipoxia intermitente para...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reactivo/Material
Spinner	Laurell	WS-400
SU8	MicroChem	SU8-2150/SU8-2100
Placa calefactora digital	PMC Dataplate	722A
Lámpara de curado UV	OmniCure	S1000
PMDS	Dow Chemical	Sylgard 184
Varita de corona	ETP	BD-20AC
Cámara	de vacío Bel-Art	420220000
Microdispensadores	The Lee Company	IKTX0322000A
V y 20 V DC	Radio Shack
NI USB	National Instrument	NI USB-6501
Termómetro	Omega Engineering, Inc.
Bomba peristáltica	Gilson	Minipulse 2
Sensor de oxígeno Ocean Optics		NeoFox
Colector de fracciones	Gilson	203
Pippette	Fisher Scientific	Finnpipette II 100μ l
Microscopio de epifluorescencia invertido	Leica	DMI 4000B
50 ml Tubos cónicos	Fisher Scientific
Fura-2 Sondas moleculares de colorante de fluorescencia	, Life Technologies
Rhodamine 123 Fluorescence Dye	Molecular Probes, Life Technologies
Culture	Media Sigma-Aldrich	RPMI-1640
HEPES	Sigma-Aldrich
Glucosa	Sigma-Aldrich
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich
30 en tubos de silicona	Cole-Parmer		1/16 pulgadas x 1/8 pulgadas
1,5 ml Tubos Eppendorf	Fisher Scientific
Conectores en Y	Cole-Parmer		Conectores de jeringa de 1/16 pulgadas y 4 mm
	Cole-Parmer		hembra Enchufe Luer 1/16 pulg
Conectores rectos	Cole-Parmer		1/16
pulg Conector	acodado Cole-Parmer		1/16 pulg