Control cuantitativo y temporal del Microambiente oxígeno en el Islote de un solo nivel

Summary

El control microfluídico del oxígeno confiere algo más que comodidad y velocidad sobre las cámaras hipóxicas para experimentos biológicos. Especialmente cuando se implementa a través de la difusión a través de una membrana, el oxígeno microfluídico puede proporcionar modulaciones simultáneas de fase líquida y gaseosa a nivel de microescala. Esta técnica permite realizar experimentos dinámicos multiparamétricos críticos para el estudio de la fisiopatología de los islotes.

Abstract

Oxigenación simultánea y seguimiento de los factores de acoplamiento estímulo-secreción de glucosa en una sola técnica es crítico para el modelado de estados fisiopatológicos de la hipoxia de los islotes, especialmente en entornos de trasplante. Técnicas de cámara de hipoxia estándar no pueden modular ambas estimulaciones al mismo tiempo ni proporcionar supervisión en tiempo real de los factores de acoplamiento estímulo-secreción de glucosa. Para hacer frente a estas dificultades, hemos aplicado una técnica de microfluidos de capas múltiples para integrar tanto acuosas como modulaciones de fase de gas a través de una membrana de difusión. Esto crea un sándwich de estimulación alrededor de los islotes microscaled dentro de la polidimetilsiloxano transparente (PDMS) de dispositivo, que permita el control de los factores de acoplamiento antes mencionados a través de microscopía de fluorescencia. Además, la entrada de gas es controlado por un par de Microdosificador, proporcionando, modulaciones cuantitativos sub-minuto de oxígeno entre 0-21%. Esta hipoxia intermitente se aplica para investigar un nuevo fenómeno de la islat preacondicionamiento. Por otra parte, armado con microscopía multimodal, hemos sido capaces de mirar calcio detallada y dinámica del canal K _ATP durante estos eventos de hipoxia. Tenemos la visión de la hipoxia de microfluidos, especialmente esta técnica de fase dual simultáneo, como una herramienta valiosa en el estudio de los islotes, así como muchos tejidos in vivo ex.

Introduction

Hipoxia dinámica es importante en la biología, especialmente para los trasplantes de islotes

Hipoxia dinámica es una fisiológico importante, así como parámetro fisiopatológico en muchos tejidos biológicos. Cambio en oxígeno, por ejemplo, es una señal potente del desarrollo en la angiogénesis. Por otra parte, los patrones espaciales y temporales de la hipoxia modulan HIF1-alfa y juegan un papel en enfermedades como el cáncer de páncreas. La hipoxia es también un factor de confusión que afectan los resultados del trasplante de islotes. Recientemente, temporalmente, las oscilaciones de la hipoxia, o hipoxia intermitente (IH) han demostrado bene....

Protocol

1. Preparando los islotes del ratón

1. Diseccionar ratones C57BL/6 y aislar islotes mediante digestión de colagenasa y separación por gradiente de densidad de Ficoll. (Refiérase a los artículos de JOVE referenciados en^2,3).
2. Incubar los islotes en medio RPMI-1640 que contenga 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 20 mM de HEPES en placas de Petri (37 °C, 5% de CO₂). Después del aislamiento, islotes de cultivo durante 24 horas antes de su uso en experimentos. Utilice los islotes dentro de 1-2 días para garantizar resultados consistentes.

2. Creación de la plataforma microfluídica

....

Results

Un elemento central de esta técnica de hipoxia de islotes es la capacidad de modular la estimulación de fase acuosa y gaseosa en la misma cámara microfluídica con transitorios a escala de minutos. La Figura 1 es un resultado representativo de las a) estimulaciones duales y b) modulaciones rápidas medidas dentro de la cámara de los islotes. La modulación acuosa, demostrada por la introducción de fluoresceína en la cámara, logra el equilibrio en tres o cuatro minutos de mezcla. Además, el oxígeno se puede .......

Discussion

Las múltiples modalidades integradas en esta técnica de hipoxia de islotes presentan varios puntos señalados aquí para la resolución de problemas. Primero, los islotes aislados continúan degradándose y desintegrándose en cultivo debido a las enzimas digestivas de las células acinares. Por lo tanto, estandarizar los experimentos a 1-2 días después del aislamiento de los islotes es fundamental para obtener resultados consistentes. En segundo lugar, el flujo acuoso se detuvo durante la hipoxia y la hipoxia intermitente para.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reactivo/Material
Spinner	Laurell	WS-400
SU8	MicroChem	SU8-2150/SU8-2100
Placa calefactora digital	PMC Dataplate	722A
Lámpara de curado UV	OmniCure	S1000
PMDS	Dow Chemical	Sylgard 184
Varita de corona	ETP	BD-20AC
Cámara	de vacío Bel-Art	420220000
Microdispensadores	The Lee Company	IKTX0322000A
V y 20 V DC	Radio Shack
NI USB	National Instrument	NI USB-6501
Termómetro	Omega Engineering, Inc.
Bomba peristáltica	Gilson	Minipulse 2
Sensor de oxígeno Ocean Optics		NeoFox
Colector de fracciones	Gilson	203
Pippette	Fisher Scientific	Finnpipette II 100μ l
Microscopio de epifluorescencia invertido	Leica	DMI 4000B
50 ml Tubos cónicos	Fisher Scientific
Fura-2 Sondas moleculares de colorante de fluorescencia	, Life Technologies
Rhodamine 123 Fluorescence Dye	Molecular Probes, Life Technologies
Culture	Media Sigma-Aldrich	RPMI-1640
HEPES	Sigma-Aldrich
Glucosa	Sigma-Aldrich
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich
30 en tubos de silicona	Cole-Parmer		1/16 pulgadas x 1/8 pulgadas
1,5 ml Tubos Eppendorf	Fisher Scientific
Conectores en Y	Cole-Parmer		Conectores de jeringa de 1/16 pulgadas y 4 mm
	Cole-Parmer		hembra Enchufe Luer 1/16 pulg
Conectores rectos	Cole-Parmer		1/16
pulg Conector	acodado Cole-Parmer		1/16 pulg