Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

Resumen

En este artículo se presenta un chip de microfluidos para el análisis de células individuales. Permite la cuantificación de las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores, y segundos mensajeros por medio de ensayos fluorescentes o inmunoensayos.

Resumen

Se presenta un dispositivo de microfluidos que permite la determinación cuantitativa de biomoléculas intracelulares en múltiples células individuales en paralelo. Para este propósito, las células están atrapados pasivamente en el medio de una microcámara. Tras la activación de la capa de control, la célula se aísla del volumen que rodea en una pequeña cámara. El volumen que rodea a continuación, puede ser intercambiado sin afectar a la célula aislada. Sin embargo, al abrirse corta y cierre de la cámara, la solución en la cámara puede ser sustituido dentro de unos pocos cientos de milisegundos. Debido a la reversibilidad de las cámaras, las células pueden ser expuestos a diferentes soluciones secuencialmente de una manera altamente controlable, por ejemplo, para la incubación, el lavado, y finalmente, la lisis celular. Las microcámaras bien cerrados permiten la retención del lisado, minimizar y controlar la dilución después de la lisis celular. Desde la lisis y el análisis se producen en el mismo lugar, se retiene una alta sensibilidad porque no más lejos dilution o pérdida de los analitos se produce durante el transporte. Por tanto, el diseño microcámara permite el análisis fiable y reproducible de un número muy reducido de copias de moléculas intracelulares (attomoles, zeptomoles) liberadas por las células individuales. Además, muchos microcámaras pueden estar dispuestos en un formato de matriz, permitiendo el análisis de muchas células a la vez, dado que los instrumentos ópticos adecuados se utilizan para el seguimiento. Ya hemos utilizado la plataforma para los estudios de prueba de concepto para analizar las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores y segundos mensajeros en forma cuantificable, ya sea relativa o absoluta.

Introducción

Muchos estudios en el pasado han revelado diferencias entre células dentro de una población de células grandes ^1-3, en particular, la señalización de los procesos ^4, o las cantidades de biomoléculas intracelulares tales como proteínas, metabolitos, ^5,6 y ^7,8 cofactores. Estas heterogeneidades se considera que son de importancia fundamental para la adaptación celular y la evolución ^9, sino que también juegan un papel clave en la aparición y el tratamiento de enfermedades como el cáncer ^10-13. Por lo tanto, los estudios sobre el nivel de una sola célula son de gran interés en la investigación biológica y farmacológica, en particular si estos estudios revelan las diferentes respuestas de las células después del tratamiento con sustancias químicas bioactivas.

En los últimos años, muchas plataformas analíticas se han desarrollado que facilitan el análisis de células vivas individuales o la composición química del contenido de la celda. Mientras que células activadas por fluorescencia (FACS) es el oro StAndard para el análisis de muy alto rendimiento de células vivas individuales, el método no puede ser empleado para la cuantificación de compuestos intracelulares o secretadas. La aparición de plataformas de microfluidos ha prometido estrategias analíticas novedosas para el posicionamiento, el tratamiento y la observación de las células individuales. Un hito en la microfluídica se alcanzó con la integración de las válvulas de PDMS flexibles realizadas por Quake y compañeros de trabajo ^14,15. Estas válvulas son útiles ya que pueden aislar a las regiones en el chip, por ejemplo, separar dos culturas ^16. Además, son especialmente aplicable para el análisis de células individuales y, por tanto, ayudan a reducir los problemas de dilución del analito. La potencia de este enfoque para el análisis de una sola célula se ha demostrado recientemente por Hansen y compañeros de trabajo, que analizaron la expresión de genes de cientos de células individuales en paralelo ^17.

Cuando el objetivo proteínas y metabolitos, el análisis es muy difícil debido a la falta de un adecuadométodos mplification, el gran número de diferentes compuestos presentes, y sus variaciones en la naturaleza química. Además, se espera que la mayoría de biomoléculas intracelulares a estar presentes en bajo número de copias en el orden de unos pocos diez miles ^18, por lo tanto, el método analítico utilizado debe tener una alta sensibilidad. Ensayos más potentes, como los inmunoensayos y los inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA) son difíciles de integrar en los dispositivos de microfluidos, ya que requieren varios pasos de lavado y de incubación, así como la inmovilización de superficie.

Debido a estos desafíos, no es sorprendente que sólo unos pocos ejemplos han sido reportados donde las proteínas o metabolitos se cuantificaron en el nivel de una sola célula. Por ejemplo, los estudios sobre la secreción de compuestos fluorescentes han sido reportados ^19,20. Recientemente, la aplicación con ELISA se presentó para el análisis de secretadas (no fluorescentes) proteínas a partir de un cultivo de células (THP-1 células) ²¹ y solo (immune) células ^10. Orientación de las proteínas intracelulares, Shi et al. Desarrolló un dispositivo de microfluidos que facilitó la identificación de proteínas intracelulares para el análisis de las vías de señalización en las células tumorales por medio de un inmunoensayo ^11. Sin embargo, se determinaron sólo cantidades relativas de las proteínas y no hay amplificación enzimática se utilizan para aumentar la señal para las proteínas de baja abundancia.

Recientemente, hemos sido capaces de combinar un microdispositivo captura de una sola célula con ensayos de fluorescencia ⁸ e inmunoensayos ²² (Figura 1). Las células están atrapados pasivamente en las estructuras de vallas micronizada, que permiten el suministro y el intercambio (rápida) de medio y otros agentes químicos sin ningún movimiento de las células. Una válvula en forma de anillo alrededor de cada trampa permite el aislamiento de la célula en un volumen muy pequeño ("la microcámara"). Esta válvula se acciona inmediatamente después de la introducción de un tampón de lisis celular (hipoosmolar), sena vez que la prevención de moléculas intracelulares o moléculas secretadas a difundir lejos. Lo más importante, debido al pequeño tamaño del volumen (625 PL) se evita gran dilución de las moléculas. Además, puesto que la lisis y análisis se llevan a cabo en en la misma posición en el chip, no hay pérdida de analitos debido al transporte. El diseño de chips descrito aquí tiene 8 filas alternas de 7 ó 8 microcámaras, por un total de 60 microcámaras. Las cámaras son accionados en filas, de manera que se impide la contaminación cruzada a lo largo de una línea.

La plataforma se puede utilizar en combinación con ensayos de fluorescencia, así como ensayos inmunológicos (Figura 1D). Para este último, hemos establecido protocolos para la inmovilización de los anticuerpos, que son compatibles con la producción de chips y proceso de montaje. De ahí que la plataforma se abre el camino para ensayos sensibles, fiables y cuantificables a nivel de células individuales. Hasta ahora, se ha utilizado el dispositivo para el análisis de la ienzimas ntracellular y secretadas (cuantificación relativa mediante ensayos enzimáticos), cofactores intracelulares, proteínas y pequeñas moléculas (cuantificación absoluta por ensayos de punto final o ELISA). En lo que sigue, se describe el proceso de fabricación de chips por medio de litografía blanda de múltiples capas y los protocolos para los patrones de los anticuerpos por medio de la impresión por microcontacto y química de superficie. Además, se dan algunos ejemplos de uso de chips y las operaciones.

Protocolo

1. SU-8 de fabricación Maestro

Preparar dos moldes maestros para los canales (de fluidos y control, para esquemas y dimensiones ver Figura 2) con el siguiente protocolo pero con diferentes patrones de máscara. El proceso se muestra en la Figura 3a.

1. Comience por calentamiento de una oblea de silicio de 4 pulgadas por 10 min a 180 ° C. Cargue la oblea deshidratado en un spin-revestidor y utilizar el siguiente protocolo para spin-coating SU-8 2015:
   1. Haga girar la oblea a 100 rpm durante 20 segundos (tapa abierta de spin-revestidor, dispense SU-8 durante este paso, cierre la tapa después de la dispensación).
   2. Girar la oblea a 500 rpm durante 10 seg (extendería el resistir sobre toda la oblea).
   3. Girar la oblea a 1750 rpm durante 30 seg (define la altura de la resistirse a 20 micras).
2. Eliminar resistir desde el borde de la oblea con acetona (utilizar un hisopo), ya que esto lo contrario se adhieren a la zona de cocción en el siguiente paso. Transfiera la oblea para ahotplate a 95 ° C y el calor durante 4 min. Después de la softbake, exponer el resistirse a través de una fotomáscara pegado a sodalime vidrio en un alineador de la máscara con la luz UV (150 mJ / cm ^2, medida a 365 nm).
3. Después de la exposición, calentar la oblea de nuevo a 95 ° C durante 5 minutos sobre una placa caliente. Enfriar la oblea a RT y luego sumergirlo en un baño de SU-8 desarrollador durante 4 min. Agitar suavemente para quitar sin impresionar SU-8. Lave la oblea con isopropanol grado de sala limpia y secar con nitrógeno. Revise debajo de un microscopio si el desarrollo se ha realizado correctamente (especialmente las trampas de células). Si las trampas de células están completamente desarrollados, el reflejo de la oblea de silicio debe ser visible. Si es necesario, el desarrollo de la oblea de nuevo durante unos minutos.
4. Hornear la oblea en un horno durante 2 horas a 180 ° C para eliminar todo disolvente residual. Compruebe la altura de los canales con un perfilador paso. Si la altura es diferente de la altura deseada, repita este protocolo de comenzar en el paso 1.1 con una nueva oblea ycambiar la velocidad de centrifugado (paso 1.1.3). Finalizar la fabricación del molde maestro por silanizar la oblea con 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorodecilo-dimethylchloro-silano en un desecador durante toda la noche.

2. Fabricación Maestro para la impresión por microcontacto

1. Con el fin de preparar los moldes maestros para la impresión por microcontacto, deshidratar una oblea de silicio durante 10 minutos a 180 ° C. Spin-capa de 1 ml HDMS en esta oblea a 7500 rpm durante 30 segundos (el resistir adhiere mejor a una superficie silanizada). Spin-capa 2 ml de AZ1518 positivo resisten con este protocolo:
   1. Dispensación estático de la oponga resistencia a la oblea.
   2. Haga girar la oblea durante 5 segundos a 500 rpm.
   3. Haga girar la oblea durante 60 segundos a 4000 rpm.
2. Después de un segundo softbake 50 a 100 ° C sobre una placa caliente, exponer al resistir a la luz ultravioleta (21 mJ / cm ² a 365 nm) a través de una fotomáscara y en un alineador de la máscara. Desarrollar el resistir en un baño de AZ 726 de 75 seg. Enjuague la oblea desarrollado con DI-agua y golpe dry con nitrógeno. Eliminar el disolvente residual mediante el calentamiento de la oblea a 115 ° C durante 50 seg. Silaniza la oblea al vacío durante la noche.

3. La fabricación del chip de microfluidos

Un diseño de dispositivo de dos capas se utiliza para estos experimentos. Las dos capas se preparan por separado y se unen entre sí, antes de que el chip se une finalmente en un portaobjetos de vidrio (Figura 3b). Este paso se describe la producción de las capas de PDMS y el sello de PDMS para la impresión por microcontacto.

1. Preparar una mezcla 10:01 de PDMS y agente de curado. Prepare unos 80 g de PDMS en total (usando nuestros diseños, esto se traducirá en 10 fichas). Mezclar ambas partes vigorosamente y desgasificar la PDMS hasta que la mezcla esté libre de burbujas (~ 30 min).
2. Coloque las tabletas con la capa de control dentro de una caja de Petri con cinta adhesiva en la parte inferior. A continuación, vierta ~ 50 g de PDMS en la parte superior y colocar la oblea durante al menos 2 horas en un horno a 80 º C para asegurar la completacurado de los PDMS. Repita el mismo procedimiento para la oblea de la impresión por microcontacto, para esto se necesita ~ 20 g de PDMS.
3. Spin-capa de PDMS en la oblea con la capa de fluido a una velocidad de rotación de 2000 rpm para formar una capa de alta PDMS aproximadamente 40 micras. Curar el PDMS en un horno durante al menos 1 hora a 80 ° C.
4. Cuando ambas partes se curan, retire la capa de control de la oblea y cortar en pedazos con una cuchilla de afeitar. Hacer agujeros de conexión de presión mediante el uso de un golpeador biopsia 1 mm. Para el almacenamiento, es conveniente poner un pedazo de cinta adhesiva sobre los canales.
5. Para unir las dos capas, tome la oblea spin-revestido y la parte superior y colocarlos en un limpiador de plasma ^23. Después del tratamiento de plasma, alinear rápidamente dos partes con un microscopio con una gran distancia de trabajo. Agregue un poco de PDMS piezas de alrededor de las partes superiores colocados. Este paso no es obligatorio, sin embargo, facilita la eliminación de los PDMS de la oblea. Coloque la oblea en un horno a 80 ° C durante al menos 1 hr.
6. Utilice un bisturí para retirar con cuidado el PDMS de la oblea y reducir los microchips. Hacer agujeros de acceso para las conexiones de fluidos con un golpeador biopsia 1,5 mm.
7. El chip de PDMS está terminado y se puede almacenar durante meses. Opcional: Si el chip se utiliza con un depósito, cortar la parte superior de una punta de pipeta de 200 l y utilizar algunos de repuesto, PDMS semicurados para pegar en la parte superior. Ponga el chip en el horno de nuevo a 80 ° C durante al menos 1 h.

4. Vinculación a la diapositiva de cristal

Para utilizar el dispositivo para ensayos enzimáticos directos, el único paso necesario después de la unión es el bloqueo de las superficies. Para este protocolo, proceda a A. Sin embargo, para utilizar el chip de microfluidos para inmunoensayos o ELISA, por favor consulte el protocolo B para restringir los sitios de unión sólo en la placa de vidrio (es decir, para la microscopía TIRF o SPR). Si esta restricción no es importante, consulte a A, pero el uso de conjugados con biotina en el paso 4.3 y continúe con el paso 4.8en el protocolo B para crear una superficie completamente funcional.

Antes de realizar el protocolo A y B: Se recomienda para filtrar todas las soluciones de proteínas usadas antes de introducirlos en el chip. Escombros y de proteína agregados pueden de otro modo bloquear trampas de células, reduciendo así el número de cámaras que se pueden utilizar para el análisis. Para este fin, utilizar una unidad de filtro de adsorción no proteico para filtrar todas las soluciones antes de su introducción en los canales.

Protocolo A (ensayos enzimáticos)

1. Para finalizar el dispositivo de microfluidos, unir las partes de PDMS en un portaobjetos de vidrio. Para ello, primero limpiar un portaobjetos de vidrio con jabón, agua destilada y etanol. Secar el portaobjetos con una corriente de nitrógeno. Limpie la parte PDMS con cinta scotch.
2. Ponga la parte PDMS y el portaobjetos de vidrio limpio en el filtro de plasma de 45 segundos a 18 W. Para asegurar una unión fuerte, poner el chip en un plato caliente (100 ° C) durante 5 min.
3. Después de la unión, llene el chip con fLUID. Una manera fácil de conseguir esto es utilizar la fuerza centrífuga. Corte la parte inferior de la punta 200 l pipeta. Para los canales fluídicos, llenarlos con la solución de bloqueo (albúmina de suero bovino (4% w / v) o poli-L-lisina) glicol de polietileno injertado (0,05% w / v) y colocar las puntas en las entradas. Rellene las entradas de la capa de control, ya sea con agua o con una solución isosmótico, por ejemplo, PBS. Coloque el chip en la centrífuga (800 xg) durante 5 min. Los canales deben ser ahora llenos de líquido completamente. Si no, repita este paso.
4. Incubar la solución de bloqueo durante al menos 30 min a temperatura ambiente. Lavar la solución de la capa de fluido con PBS a un caudal de 10 l / min utilizando una bomba de jeringa. El dispositivo está ahora listo para experimentos de células.

Protocolo B (inmunoensayos)

Para obtener una visión completa de la modificación de la superficie del paso 4.7 en adelante, por favor consulte la Tabla 1.

5. EnPDMS Cubate sellos para impresión por microcontacto con una solución BBSA / BSA (por ejemplo, 1-100). Después de 30 min, limpiar los sellos a fondo con agua destilada y secar el sello bajo una corriente de nitrógeno. Colocar rápidamente los sellos en un portaobjetos de vidrio limpio (Figura 4).
6. Exponer el portaobjetos de vidrio con el sello junto con la parte superior del chip microfluídico a plasma de oxígeno durante 45 segundos a la máxima potencia (18 W) en un limpiador de plasma. Después del tratamiento de plasma, quitar el sello y alinear la superficie impresa debajo de las microcámaras del dispositivo. Coloque el chip durante 30 min sobre una placa caliente a 50 ° C.
7. Para bloquear la superficie restante, introducir solución esterilizada por filtración de BSA (4% (w / v) en PBS) en el chip con una centrífuga (véase el paso 4.2). Incubar durante 1 hora y lavar la solución de la capa de fluido con PBS (véase el paso 4.3). El chip se puede usar entonces directamente o almacenarse durante hasta 2 semanas a 4 ° C en una caja húmeda.
8. Para un surfac de unión completamente funcionalE, introducir avidina (0,025% (w / v) en PBS) en el depósito. Utilice una velocidad de flujo de 5 l / min durante 30 min para retirar la solución de avidina a través de los canales de fluido. Después, enjuague PBS durante 10 min. Enjuagar el depósito a fondo.
9. Después, añadir la proteína G (0,0025% (w / v) en PBS) y lavando durante otros 30 min. Lavar con PBS durante otros 10 min después. A continuación, añadir el anticuerpo de interés (0,0001% (w / v) en PBS) durante 10 min. Después de 10 min, detener el flujo durante 15 min para permitir la unión. A continuación, lavar con PBS durante 10 min.

5. Experimentos de células

El protocolo está escrito en términos generales debido a la variedad de posibles ensayos. A modo de ejemplo se indican los reactivos necesarios para el ensayo de toxicidad G6PDH. La eficiencia de las células atrapando inicial del dispositivo es de alrededor de 2,5%, es decir, 5 de cada 200 células quedarán atrapados. La ocupación final de las trampas de células depende fuertemente de la línea celular utilizada, el protocolo de suspenderla línea celular y el tiempo, las células se lavan a través del canal. Para células que crecen naturalmente en suspensión (tales como U937), células individuales se pueden encontrar en aproximadamente el 75% de las cámaras después de unos pocos minutos. Las otras cámaras, o bien no están llenos, o ocupadas por dos o más células. En general, la ocupación de una sola célula es más pequeño para líneas de células adherentes. Cuando se utiliza el protocolo de suspensión más bien leve que aquí se presenta, el porcentaje disminuye a aproximadamente 30% (HEK, células MLT). La ocupación de una sola célula puede ser mejorada por tratamiento con tripsina de las células, pero esto también puede alterar los resultados de los experimentos.

Dependiendo de la molécula diana, adsorción o absorción de PDMS pueden influir en los resultados. La adsorción se puede reducir mediante el bloqueo de las superficies con BSA o PLL-g-PEG. La absorción es poco probable para la mayoría de las biomoléculas hidrófilas, pero debe ser revisado para (pequeñas) componentes celulares lipofílicas.

1. Preparar las células de acuerdo con el protocolo específico (por ejemplo, drogadicción). Para las células en suspensión, añadir las células directamente en el chip. Para las líneas de células adhesivas, utilizar tampón de disociación libre de enzima para producir una suspensión celular. Filtrar las células antes de su introducción en el chip para reducir la cantidad de grupos de células.
2. Cargar las células en el chip utilizando una bomba de jeringa y el flujo hacia delante, en lugar de retirar la suspensión de células. Utilice una velocidad de flujo de 5 l / min para las líneas celulares en suspensión y mayores tasas de flujo de 10-20 l / min para células adhesivas ya para reducir de fijación no específica de las células sobre las paredes del canal.
3. Cuando se llenan las trampas, cerrar las cámaras. Si muchas células se adhieren de forma no específica a la superficie, tratar de lavarlos con tampón de disociación celular a una velocidad de flujo de 10-30 l / min.

Protocolo A (ensayos enzimáticos)

4. Retirar tampón de lisis a través del chip. Para este ejemplo, este tampón es un tampón de hipoosmolar con adición de Tween 20 (Tris-HCl 10, 10mM de KCl, 1,5 mM de MgCl _2, 1% (v / v) de Tween 20). Para la lisis, las cámaras de abrir y cerrar rápidamente (es decir, 500 ms para caudales de 10 a 50 l / min ^7,21). Para el ensayo de G6PDH, añadir 2 mM de glucosa-6-fosfato, NADP 0,5 mM, 0,5 U / ml de diaforasa y 0,3 mM de resazurina al tampón de lisis. Iniciar el seguimiento de la cinética de reacción inmediatamente después de la lisis.

Nota: Elija cualquier tampón que es adecuado para el ensayo, sin embargo, ten en mente que los detergentes fuertes (como Triton, SDS) las células lisan inmediatamente y dará lugar a una pérdida del analito durante la apertura de la cámara.

Protocolo B (inmunoensayos)

Para una breve descripción de los experimentos de ELISA de células (tasas de flujo, el estado de la cámara, etc), por favor consulte la Tabla 1.

5. Para ELISA, añadir el reactivo de detección requerido (por ejemplo, anticuerpo secundario, antígeno marcado) directamente al tampón de lisis. La invención añadidas Tween 20 reduce la adsorción no específica. Lisar las células según la etapa 5.4. Incubar la mezcla durante 10-15 minutos para permitir la unión (tiempo de incubación dependiendo del antígeno utilizado y el anticuerpo).
6. Conjugados de enzima-anticuerpo que adsorbidos no específicamente a las paredes de los canales pueden conducir a una conversión del reactivo de detección ya en el interior del depósito y los canales. Para reducir los problemas de esta adsorción, lave un inhibidor de la permanente de la enzima de detección utilizado a través del chip durante el tiempo de incubación (cámaras cerradas, antes de añadir el reactivo de detección). Para HRP, utilice HCl 20 mM en agua para inactivar permanentemente las enzimas no específicamente adsorbidos.
7. Después del tiempo de incubación, introducir el reactivo de detección (por ejemplo, Amplex Red y peróxido de hidrógeno para HRP) al chip. Abra las cámaras de nuevo en breve para lavar el anticuerpo secundario no unido de distancia y añadir el reactivo de detección. Iniciar el seguimiento de la cinética de reacción inmediatamente.
8. Calibración: Inmovilizarel anticuerpo contra la diana de interés. Cerrar cámaras. Preparar diferentes concentraciones de analito en tampón o en lisado de células fuera del chip. Aplicar una concentración en el chip y rápidamente cambiar el volumen interior de las cámaras (500 ms de tiempo de apertura). Este tiempo de apertura es suficientemente corto para garantizar que no se produce la acumulación adicional de lavado analito, y sólo un número específico de moléculas desde el volumen de la micro-cámara se detecta. A partir de la concentración conocida de antígeno dentro de la solución y el volumen de la cámara (625 PL), calcular la cantidad dentro de la cámara. Después, continúe con el paso 5.5 e introducir el resto de detección.

Resultados

Nuestra plataforma es capaz de analizar una variedad de intracelular, así como moléculas secretadas presentes en o producidos por células individuales. Aquí, nos gustaría presentar diferentes estudios ejemplo para subrayar la variedad de posibles ensayos. Daremos un ejemplo para una enzima secretada (Figura 5a), así como una enzima intracelular (Figura 5b) y proteína (Figuras 5C y D). Para más ejemplos, como cofactores o pequeñas moléculas, consulte Eye...

Discusión

Tecnología microfluídica ha abierto nuevas y fascinantes posibilidades para el análisis de una sola célula. En particular, la posibilidad de atrapar e inmovilizar las células individualmente por herramientas microfluídicos ha permitido estudios sistemáticos a corto y largo plazo sobre las propiedades de una sola célula y la respuesta. Además, la encapsulación de células en microgotas de alta frecuencia, generados en un microchip, ha permitido estudios de secreción de células individuales, que no se pueden realizar con l...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
REACTIVOS:
Nombre de la empresa de reactivos Número de		catálogo	Comentarios (opcional)
SU-8 2015	MicroChem Corp. (Netwon, MA)	n.a.1H,1H,2H,2H-Perfluorodecil-dimetilclorosilano
	ABCR (Karlsruhe, Alemania)	AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-hidrato de diacetilquitobiósido	Sigma Aldrich	M9763
Acetona	Merck VWR (Darmstadt, Alemania)	100014
Avidin	AppliChem (Axon Lab AG)	A-2568
AZ 1518	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Alemania)	n.a.AZ
726 developer	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Alemania)	n.a.
Albúmina sérica bovina	Sigma Aldrich	A-4503
Albúmina sérica bovina, biotina	Sigma Aldrich	A-8549
Tampón de disociación celular	Invitrogen	13151-014
Hexametildisilazano (HDMS)	Sigma Aldrich	40215
Ácido clorhídrico	Fluka	84422
Isopropanol	Merck VWR (Darmstadt, Alemania)	109634
Cloruro de magnesio hexahidratado	Fluka	63068
MR developer 600	Microresist technology GmbH (Berlín, Alemania)	n.a.PBS
	Invitrogen	10010-031
PLL-g-PEG injertado	SuSoS, (Dü bendorf, Suiza)	n.a.PLL-g-PEG
biotina injertada	SuSoS, (Dü bendorf, Suiza)	n.a.Cloruro
de potasio	Fluka	60132
Proteína G, biotina	Sigma Fine Chemicals	41624
Oblea de silicio	Si-Mat (Kaufering, Alemania)	n.a.Sylgard
184 Kit de elastómero de silicona (PDMS)	Dow Corning	39100000
Tris(hidroximetil)-aminometano	Biorad
Tween 20	Biorad	1706531
EQUIPMENT:
Nombre del material	Número de catálogo	la empresa	Comentarios (opcional)
0.22 µ m Filtro de jeringa PES	TRP	99722
1/1,5 mm perforadora de biopsia	Miltex, York PA	33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 µ m	Partec	04-004-2325
Centrífuga Sigma 3-18K	Kuehner	n.a.Placa
calefactora HP 160 III BM	Sawatec, Sax, Suiza	n.a.MA-6
alineador de máscaras	Karl Suess	n.a.Microscopio
Multizoom AZ100M	Nikon Corporation	n.a.Photomask
	Microlitho, Essex, Reino Unido	n.a
Limpiador de plasma PDC-32G	Harrick	n.a.Recubridor
centrifugado Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell	n.a.Módulos
de centrifugado SM 180 BM	Sawatec, Sax, Suiza	n.a.Perfilador
pasos Dektak XT Advanced	Bruker	n.a.Bomba
de jeringa neMESYS	Cetoni	n.a.