Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

Summary

En este artículo se presenta un chip de microfluidos para el análisis de células individuales. Permite la cuantificación de las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores, y segundos mensajeros por medio de ensayos fluorescentes o inmunoensayos.

Abstract

Se presenta un dispositivo de microfluidos que permite la determinación cuantitativa de biomoléculas intracelulares en múltiples células individuales en paralelo. Para este propósito, las células están atrapados pasivamente en el medio de una microcámara. Tras la activación de la capa de control, la célula se aísla del volumen que rodea en una pequeña cámara. El volumen que rodea a continuación, puede ser intercambiado sin afectar a la célula aislada. Sin embargo, al abrirse corta y cierre de la cámara, la solución en la cámara puede ser sustituido dentro de unos pocos cientos de milisegundos. Debido a la reversibilidad de las cámaras, las células pueden ser expuestos a diferentes soluciones secuencialmente de una manera altamente controlable, por ejemplo, para la incubación, el lavado, y finalmente, la lisis celular. Las microcámaras bien cerrados permiten la retención del lisado, minimizar y controlar la dilución después de la lisis celular. Desde la lisis y el análisis se producen en el mismo lugar, se retiene una alta sensibilidad porque no más lejos dilution o pérdida de los analitos se produce durante el transporte. Por tanto, el diseño microcámara permite el análisis fiable y reproducible de un número muy reducido de copias de moléculas intracelulares (attomoles, zeptomoles) liberadas por las células individuales. Además, muchos microcámaras pueden estar dispuestos en un formato de matriz, permitiendo el análisis de muchas células a la vez, dado que los instrumentos ópticos adecuados se utilizan para el seguimiento. Ya hemos utilizado la plataforma para los estudios de prueba de concepto para analizar las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores y segundos mensajeros en forma cuantificable, ya sea relativa o absoluta.

Introduction

Muchos estudios en el pasado han revelado diferencias entre células dentro de una población de células grandes ^1-3, en particular, la señalización de los procesos ^4, o las cantidades de biomoléculas intracelulares tales como proteínas, metabolitos, ^5,6 y ^7,8 cofactores. Estas heterogeneidades se considera que son de importancia fundamental para la adaptación celular y la evolución ^9, sino que también juegan un papel clave en la aparición y el tratamiento de enfermedades como el cáncer ^10-13. Por lo tanto, los estudios sobre el nivel de una sola célula son de gran interés en la investigación biológica y....

Protocol

1. SU-8 de fabricación Maestro

Preparar dos moldes maestros para los canales (de fluidos y control, para esquemas y dimensiones ver Figura 2) con el siguiente protocolo pero con diferentes patrones de máscara. El proceso se muestra en la Figura 3a.

1. Comience por calentamiento de una oblea de silicio de 4 pulgadas por 10 min a 180 ° C. Cargue la oblea deshidratado en un spin-revestidor y utilizar el siguiente protocolo para spin-coating SU-8 2015:
   1. Haga girar la oblea a 100 rpm durante 20 segundos (tapa abierta de spin-revestidor, dispense SU-8 durante este paso, cierre la tapa después de la....

Results

Nuestra plataforma es capaz de analizar una variedad de intracelular, así como moléculas secretadas presentes en o producidos por células individuales. Aquí, nos gustaría presentar diferentes estudios ejemplo para subrayar la variedad de posibles ensayos. Daremos un ejemplo para una enzima secretada (Figura 5a), así como una enzima intracelular (Figura 5b) y proteína (Figuras 5C y D). Para más ejemplos, como cofactores o pequeñas moléculas, consulte Eye.......

Discussion

Tecnología microfluídica ha abierto nuevas y fascinantes posibilidades para el análisis de una sola célula. En particular, la posibilidad de atrapar e inmovilizar las células individualmente por herramientas microfluídicos ha permitido estudios sistemáticos a corto y largo plazo sobre las propiedades de una sola célula y la respuesta. Además, la encapsulación de células en microgotas de alta frecuencia, generados en un microchip, ha permitido estudios de secreción de células individuales, que no se pueden realizar con l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REACTIVOS:
Nombre de la empresa de reactivos Número de		catálogo	Comentarios (opcional)
SU-8 2015	MicroChem Corp. (Netwon, MA)	n.a.1H,1H,2H,2H-Perfluorodecil-dimetilclorosilano
	ABCR (Karlsruhe, Alemania)	AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-hidrato de diacetilquitobiósido	Sigma Aldrich	M9763
Acetona	Merck VWR (Darmstadt, Alemania)	100014
Avidin	AppliChem (Axon Lab AG)	A-2568
AZ 1518	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Alemania)	n.a.AZ
726 developer	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Alemania)	n.a.
Albúmina sérica bovina	Sigma Aldrich	A-4503
Albúmina sérica bovina, biotina	Sigma Aldrich	A-8549
Tampón de disociación celular	Invitrogen	13151-014
Hexametildisilazano (HDMS)	Sigma Aldrich	40215
Ácido clorhídrico	Fluka	84422
Isopropanol	Merck VWR (Darmstadt, Alemania)	109634
Cloruro de magnesio hexahidratado	Fluka	63068
MR developer 600	Microresist technology GmbH (Berlín, Alemania)	n.a.PBS
	Invitrogen	10010-031
PLL-g-PEG injertado	SuSoS, (Dü bendorf, Suiza)	n.a.PLL-g-PEG
biotina injertada	SuSoS, (Dü bendorf, Suiza)	n.a.Cloruro
de potasio	Fluka	60132
Proteína G, biotina	Sigma Fine Chemicals	41624
Oblea de silicio	Si-Mat (Kaufering, Alemania)	n.a.Sylgard
184 Kit de elastómero de silicona (PDMS)	Dow Corning	39100000
Tris(hidroximetil)-aminometano	Biorad
Tween 20	Biorad	1706531
EQUIPMENT:
Nombre del material	Número de catálogo	la empresa	Comentarios (opcional)
0.22 µ m Filtro de jeringa PES	TRP	99722
1/1,5 mm perforadora de biopsia	Miltex, York PA	33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 µ m	Partec	04-004-2325
Centrífuga Sigma 3-18K	Kuehner	n.a.Placa
calefactora HP 160 III BM	Sawatec, Sax, Suiza	n.a.MA-6
alineador de máscaras	Karl Suess	n.a.Microscopio
Multizoom AZ100M	Nikon Corporation	n.a.Photomask
	Microlitho, Essex, Reino Unido	n.a
Limpiador de plasma PDC-32G	Harrick	n.a.Recubridor
centrifugado Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell	n.a.Módulos
de centrifugado SM 180 BM	Sawatec, Sax, Suiza	n.a.Perfilador
pasos Dektak XT Advanced	Bruker	n.a.Bomba
de jeringa neMESYS	Cetoni	n.a.