A multi-electrodo Sistema Patch-clamp asistida por ordenador

Resumen

De múltiples electrodos patch-clamp grabaciones constituyen una tarea compleja. Aquí se muestra cómo, mediante la automatización de muchas de las medidas experimentales, es posible acelerar el proceso que conduce a una mejora cualitativa en el rendimiento y el número de grabaciones.

Resumen

La técnica de patch-clamp es hoy en día el método más bien establecido para el registro de la actividad eléctrica de las neuronas individuales o sus compartimentos subcelulares. Sin embargo, el logro de grabaciones estables, incluso a partir de células individuales, sigue siendo un procedimiento que consume tiempo de considerable complejidad. Automatización de los muchos pasos en conjunto con la pantalla de información eficiente puede ayudar enormemente experimentadores en la realización de un mayor número de grabaciones con una mayor fiabilidad y en menos tiempo. Con el fin de lograr grabaciones a gran escala concluimos el enfoque más eficiente no es para automatizar completamente el proceso, pero para simplificar los pasos experimentales y reducir las posibilidades de error humano al tiempo que incorpora de manera eficiente la experiencia del experimentador y la retroalimentación visual. Con estos objetivos en mente, hemos desarrollado un sistema de ayuda de computadora que centraliza todos los controles necesarios para una multi-electrodo experimento de patch-clamp en una sola interfaz, un comercgamepad inalámbrico ially disponibles, al tiempo que muestra de experimentos relacionados con las señales de información y orientación en la pantalla de ordenador. Aquí se describen los diferentes componentes del sistema que nos permitió reducir el tiempo requerido para alcanzar la configuración de grabación y aumentar considerablemente las posibilidades de grabar con éxito un gran número de neuronas al mismo tiempo.

Introducción

La capacidad para grabar y estimular múltiples sitios con precisión micrómetro es extremadamente útil para lograr experimentalmente una mejor comprensión de los sistemas neuronales. Muchas técnicas se han desarrollado para este fin pero ninguno permitir la resolución submillivolt logra mediante la técnica de patch-clamp, esencial para el estudio de la actividad subumbral y potenciales postsinápticos individuales. Aquí se describe el desarrollo de un sistema de patch-clamp asistida por ordenador de doce electrodo destinado a registrar y la estimulación de un gran número de células individuales con la suficiente precisión para el estudio de la conectividad neuronal simultáneamente. Mientras que muchas otras aplicaciones pueden ser concebidos para un sistema de este tipo, se presta particularmente bien para el estudio de la conectividad sináptica dado que el número de conexiones posibles dentro de un grupo de neuronas crece proporcionalmente al cuadrado del número de neuronas en cuestión. Por lo tanto, mientras que un sistema con tres electrodos permite probar laocurrencia de hasta seis conexiones y más a menudo grabación de una sola, la grabación de doce neuronas permite probar la ocurrencia de hasta 132 conexiones y observando con frecuencia más de una docena (Figura 1). La observación de decenas de conexiones simultáneamente hace posible el análisis de la organización de las redes de pequeñas y deducir propiedades estadísticas de la estructura de red que no se puede probar lo contrario ^1. Por otra parte, la estimulación precisa de numerosas células también permite la cuantificación del reclutamiento de las células postsinápticas ^2.

Protocolo

1. Equipo de preparación

1. Manipuladores de control desde un ordenador
   1. Conecte cada caja del controlador micromanipulador a una computadora a través de puertos serie (RS-232).
   2. Implementar los comandos para el posicionamiento, consultar y ajustar la configuración para ser enviados a través del puerto serie. Problemas de velocidad y compatibilidad de hardware Dadas C / C + + se recomienda como el lenguaje de programación.
   3. Estandarizar el sistema de referencia de los manipuladores de modo que el cero es la posición más próxima posible con respecto a los motores y movimiento positivo se dirige lejos de los motores.
   4. Coloque el microscopio a su posición central 2 mm por encima de la muestra de plano focal (coordenadas [0, 0, 2000]).
   5. Almacenar, para cada manipulador, las coordenadas locales que permiten que la punta de una pipeta que se observó en el centro del campo de visión del microscopio. Este es el punto de referencia inicial para cada electrodo.
2. Visuaposiciones de los electrodos Lize. Es muy útil ser capaz de seguir la posición de cada electrodo durante un experimento. Una representación gráfica es la forma más intuitiva de lograr esto. Para ello los sistemas de referencia de cada electrodo y la del microscopio deben coincidir. Una manera sencilla de lograr esto es:
   1. Llevar la punta de un electrodo al centro del campo de vista.
   2. Almacenar la posición en cada eje del manipulador y cada eje del microscopio.
   3. Ejecutar con el eje x del manipulador de un movimiento relativamente grande (1 mm).
   4. Ubique la punta una vez más se mueve sólo el microscopio.
   5. Calcular la diferencia en la posición de microscopio, ya que se midió última. Estas son las proyecciones del movimiento del eje del electrodo en los ejes de microscopio.
   6. Repita los pasos 2.3 a 2.5 para el Y y Z ejes del manipulador electrodo. Esto permite una matriz de proyecciones en el microscopio ejes por determinar ( Figura 2) también llamado matriz coseno:
      
   7. Invertir esta matriz para que sea posible calcular los movimientos en tres dimensiones, requeridos por el manipulador de electrodos para llegar a una posición determinada en el microscopio sistema de coordenadas:
      
   8. Usando el punto de referencia inicial y la matriz de coseno determinar la posición de cada electrodo en el microscopio de coordenadas.
   9. Mostrar gráficamente, basado en el microscopio de coordenadas, la posición de cada electrodo a intervalos regulares. Hemos elegido utilizar / C + + bibliotecas dibujo C (GDI +) para dibujar posiciones de los electrodos cada 40 ms.
   10. Repetir los pasos 1.2.1 - 1.2.7 cada vez que se cambian los ángulos de manipulador o si se necesitan cambios de posición de varios milímetros, por ejemplo, cuando el tipo de electrodo se cambia.
3. Habilitar el almacenamiento de la positions de características relevantes en el tejido, tales como células o puntos de referencia anatómicos, en microscopio coordenadas.
4. Adquirir vídeo y superponer información pertinente.
   1. Mecánicamente alinear el eje x de movimiento del microscopio con el eje horizontal de la cámara del microscopio.
   2. Instalar en el equipo un framegrabber con vídeo en directo y la capacidad de recubrimiento y un kit de desarrollo de software (SDK).
   3. Implementar la operación de visualización de vídeo en directo con el SDK.
   4. Convertir el microscopio sistema de coordenadas en el sistema de referencia de la cámara por la traducción de escala apropiado.
   5. Dibuje las características relevantes en coordenadas de cámara y superposición sobre el vídeo en directo la imagen resultante a intervalos regulares de unos 40 ms (Figura 3).
5. Amplificadores de control.
   1. Utilice el software de amplificador de controlar los ajustes del amplificador de la interfaz.
6. Control osciloscopios.
   1. Conecte los osciloscopios para PC mediante puertos serie.
   2. Determinar la escala osciloscopio, acoplamiento y resolución temporal para los diferentes pasos del procedimiento de patch-clamp en de fijación de voltaje (por ejemplo, electrodo en el baño, la formación del sello, configuración de célula completa) y la corriente-abrazadera.
   3. Envíe los comandos de ajuste de osciloscopio apropiadas cuando los comandos de amplificación se emiten desde la interfaz.
7. Presión pipeta de control.
   1. Montar un sistema de control de presión de acuerdo con la Figura 4.
      1. Utilice una fuente de alimentación de 12 V / 5 V para suministrar cada componente electrónico adecuada.
      2. Conectar la salida de una bomba de membrana en el búfer de presión positiva (un recipiente de 100 ml).
      3. Conectar la entrada de una bomba de membrana en el búfer de presión negativa (un recipiente de 100 ml).
      4. Conecte el tubo de soporte de pipeta a un sensor de presión en el pressure sistema de control y una válvula neumática que se conecta al compartimento principal de presión.
      5. Conectar cada uno de los tampones de presión a una válvula conectada al compartimento principal de presión.
      6. Conecte una válvula entre el compartimiento de presión principal y la atmósfera.
      7. Conecte un sensor de presión en el compartimento principal de presión.
      8. Conecte un sensor de presión para cada búfer.
      9. Conecte el sistema de control de presión para una tarjeta de adquisición de datos.
      10. Conecte cada sensor de presión a una entrada analógica.
      11. Conectar cada válvula a una salida digital.
   2. Retire desplazamiento de todos los sensores mediante la apertura de todas las válvulas excepto las que conectan a las bombas de membrana y restando la presión medida de la presión atmosférica.
   3. Implementar el control de presión
      1. Definir en la interfaz de un control para activar o desactivar el control de presión positiva para cada pipeta.
      2. Definir una presión positiva mínima para la pipetas de aproximadamente 70 mbar.
      3. Periódicamente (cada 0,5 segundos) detectar cuando la presión en pipetas bajo control de presión activa desciende por debajo del umbral establecido.
      4. Al cruce del umbral de abrir el amortiguador de presión positiva al compartimento de presión principal y este compartimiento hacia la pipeta en cuestión durante breves períodos de tiempo (20 ms) hasta que la presión en las pipetas es superior al umbral. Cierre todas las válvulas.
      5. De-activar aún más el control de presión como se inicia la aproximación final hacia una célula de interés.
   4. Aplique presión negativa para la formación del sello
      1. Cierre todas las válvulas y abra la válvula de amortiguador de presión negativa hacia el compartimiento de presión principal y este compartimiento hacia la pipeta en cuestión durante el tiempo que el experimentador requiere manteniendo un botón pulsado.
8. Centralizar los comandos en un dispositivo de interfaz humana.
   1. Conecte un wirele comercialmente disponibless gamepad para PC.
   2. Implementar la lectura del estado de joystick. Por ejemplo, usar las bibliotecas de DirectX para C / C + + para realizar lecturas cada 5 ms.
   3. Comparar la situación actual con el estado anterior de detectar que se han pulsado, soltado o se mantiene pulsado los botones ya que paso la última vez.
   4. Asignar funciones a cada botón en el mando de juegos. Un ejemplo de este mapeo se muestra en la Figura 5.

2. Procedimiento Patch-clamp

1. Preparar las rodajas de cerebro de la región de interés.
2. Coloque un trozo de cerebro de interés, con la región de interés en el centro del rango de desplazamiento del microscopio.
3. La selección de la célula
   1. Identificar las células de interés por la navegación con el microscopio. Guarde la posición de las células sobre la base del microscopio sistema de coordenadas con un derecho del ratón haga clic en la pantalla de vídeo en directo en la parte superior de la célula de interés.
   La interfaz gráfica mostrará las celdas seleccionadas, así como las micropipetas para una visión general y global de software añadirá un marcador en la posición de la celda que se superponen sobre las imágenes. Además de una imagen de la célula es capturada para futuras referencias en el archivo 'Celda #. Jpg'.

Atribución de las células para pipetas

1. Después de seleccionar las células de interés, asignar qué pipeta registrará cada celda. La interfaz gráfica proporciona controles de asignación que se debe establecer. Visualice una vista previa de la configuración final seleccionando la casilla 'Mostrar Posiciones Finales'.
2. Seleccione cada pipeta para el que se desea la vista previa de la posición final o marque la casilla 'Seleccionar todo'. Desactivar la visualización de la posición actual para una mejor visualización, si es necesario.

Preparar las pipetas

1. Llene las pipetas (6-8 MΩ suelen ser mejores si se usan muchas pipetas) with solución intracelular y cargarlos en sus titulares. Coloca los Headstages en sus fijaciones, pero no se deslicen hacia adelante para evitar tocar el baño con la punta de la pipeta.
2. Habilitar el control de la presión positiva y seleccionar todas las pipetas para asegurar que las puntas se mantendrán limpios. Deslice suavemente cada headstage en su lugar.

Localización de las puntas de pipeta

1. Coloque el microscopio a una posición central con el foco 3 mm por encima de la rebanada pulsando el botón R2 mientras sostiene el botón 'A'. Use la posición correspondiente para cada manipulador como se almacena en el experimento anterior pulsando el botón L2 mientras mantiene pulsado el botón A.
   Nota: En este punto no debe haber ya sea una sombra distintiva de una pipeta a la vista o un pequeño movimiento a lo largo del eje de la pipeta debe ser suficiente para observar que en la mayoría de los casos. La compensación por las ligeras diferencias en la forma de la pipeta tiene que ser realizada manualmente.
2. Llevar la punta de la pipeta en el foco. Coloque la punta en el punto central de color rojo de la pantalla de vídeo sin mover el microscopio (debe estar aún en la posición [0, 0, 2000]).
3. Informar al software que la pipeta está en el centro de la pantalla pulsando el botón Z mientras mantiene el botón C. Después de cada punta de la pipeta se encuentra, enviar ese pipeta hacia atrás de modo que la siguiente se puede localizar pulsando el botón L1 mientras mantiene pulsado el botón A.

Acercarse a las células

1. Una vez que todas las puntas de las pipetas se han localizado con precisión y cada pipeta se atribuye a una celda, coloque automáticamente las pipetas cercanas a sus respectivas celdas. Simplemente haga clic derecho en el centro del grupo de celdas y seleccionar la opción 'Cluster' en el menú emergente. En la ventana de opciones de clúster que aparecerá, seleccione todas las pipetas que desea posicionarse en este momento y haga clic en 'Ir con todas las pipetas controladas ». Repita esta operación para cada grupo de células de interés.
2. Performa la aproximación final manualmente. La posición de las pipetas en relación con las células se puede especificar de manera diferente, pero por lo general es simplemente 200 m de distancia de la celda en el eje de la pipeta y 200 micras por encima de ella en la dirección vertical, que es suficiente para mantener la punta de la pipeta fuera del tejido . Espere a que termine la colocación de las pipetas y mover el microscopio hacia una pipeta presionando el botón R1 mientras mantiene el botón C.
3. Vuelva a calibrar cada posición de la pipeta, centrándose el microscopio en la punta en cualquier lugar de la pantalla de vídeo y pulsando el botón B mientras mantiene el botón C. Una cuadrícula debería aparecer brevemente indicando la posición identificada de la pipeta. Si la posición no es correcta, coloque la punta en el punto central de la pantalla de vídeo y pulse el botón Z mientras mantiene el botón C.

Establecer la configuración de la celda-adjunto

1. Confirme que la célula de interés para la pipeta actual es correctamarcada. De lo contrario, mover el microscopio para que coincida con la célula de interés con el punto rojo central. Marque la celda presionando el botón Y mientras mantiene el botón pulsador C. Pulse L2 mientras mantiene el botón C para colocar la pipeta de 200 m de distancia de su celda asignada, el microscopio se moverá automáticamente a la posición correspondiente.
2. Ajuste la posición de la pipeta para que coincida con el punto rojo. Ajustar el offset pulsando el botón R1 mientras mantiene el botón X. pipeta
3. Active el impulso de prueba pulsando el botón L1 mientras mantiene el botón X. Poco a poco acercarse a la pipeta para su célula atribuido.
4. Al observar la formación de un hoyuelo en la superficie de la membrana de la célula de aplicar un breve pulso de la presión negativa pulsando el botón Y mientras mantiene el botón Z para permitir que la presión aplicada para llegar a la célula. Un potencial de mantenimiento de alrededor de-65mV debería establecido en este punto, pulse el botón L2 mientras mantiene el botón X.

Configuración de célula completa

1. Una vez que un sello Giga-se forma para cada celda, iniciar la ruptura de las membranas mediante la aplicación de presión negativa.

Realizar grabaciones

1. Utilice el sistema de estimulación / adquisición para realizar sus grabaciones. Aplicar impulsos o trenes de impulsos en una célula individual a la vez y observar las respuestas en las células restantes a mapa de conectividad entre las células registradas.

Retroceder pipetas

1. Una vez que las grabaciones se terminaron, retroceder pipetas lentamente del tejido con un clic derecho sobre el botón de radio tabla. Seleccione 'retroceden-> Pipetas 500 m' de tener las pipetas se alejan a una corta distancia a lo largo de sus ejes. Observar la deriva en el potencial de las células (la limpieza de las puntas aplicando un poco de presión positiva puede ayudar).
2. Para retroceder pipetas totalmente hacia atrás, ajuste la velocidad de posicionamiento en 'Fast' y repetir la misma operación pero seleccione la opción "Todos". Retire el utilizadopipetas deslizando suavemente los Headstages y desenroscar las pipetas de los poseedores. Es útil para evitar las torsiones de los titulares en sus cuencas ya que esto podría interferir en gran medida con la posición de la punta de la pipeta.

Resultados

Siguiendo los métodos descritos anteriormente hemos tenido éxito en la realización de la grabación de células enteras de hasta doce neuronas simultáneamente, casi duplicando el mayor número de neuronas simultáneamente parche-sujetada hasta ahora. Ejemplos de redes de conexiones sinápticas directas entre neuronas piramidales registrada en la capa V de la corteza somatosensorial de las ratas se muestran en la Figura 6.

La determinación de los perfiles de probabilidad de conexi...

Discusión

Una pregunta inmediata suele surgir en relación con la tasa de éxito del procedimiento que hemos descrito. Para altas tasas de éxito la preparación es esencial. Las pipetas deben tener aberturas de punta que sean adecuados a los seres células grabadas. Filtrado de la solución intracelular para evitar pipetas obstruidos también es importante. Pipetas extremadamente limpias, de barril son otro requisito. Una distribución binomial es el modelo más simple que se puede utilizar para entender cómo estos problemas afectan el r...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio	Olympus	BX51WI	40X Manipuladores de objetivos de inmersión
	Luigs Neumann	SM-5	Protocolo serie utilizado
Amplificadores	Axon Instruments	MultiClamp 700B	SDK utilizado
Cámara	Till Photonics	VS 55	BNC salida analógica
Framegrabber	Traducción de datos	DT3120	SDK utilizado
Osciloscopios	Tektronix	TDS 2014	Comunicación en serie Adquisición
datos	InstruTECH	ITC 1600
Adquisición de datos	National Instruments	PCI-6221	Biblioteca utilizada (.dll)
Válvula de presión	SMC	SMC070C-6BG-32
Sensor de presión	Honeywell	24PCDFA6G
Membrana bomba	Schego	Optimal