La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

La señalización a través de cascadas de transducción menudo culmina en la expresión de proteínas. La caracterización de este perfil de expresión es un elemento clave en la comprensión de la función de las vías biológicas. La identificación de espectro de hasta reguladas proteínas y la dinámica de su activación se puede lograr mediante diversas técnicas como la micro-arrays, transferencias Northern o transferencias Western ^1-3. Sin embargo, estas técnicas promedio de la respuesta de toda una población de células. Para entender la regulación fina de la expresión de proteínas, es deseable para reunir mediciones en el nivel de células individuales. Lo ideal sería que estas medidas también deben proporcionar datos cuantitativos susceptibles de desarrollar modelos matemáticos de la vía subyacente.

Microscopía y citometría de flujo son dos técnicas, que son ideales para ofrecer este tipo de mediciones cuantitativas de células individuales. El etiquetado endógena de proteínas con una proteína fluorescente puede be utilizado para cuantificar su nivel de expresión ^4. Sin embargo, ya que la adición de un resto fluorescente grande en la parte terminal de la proteína puede hacer que no sea funcional, a menudo es más deseable generar reporteros de expresión específicos basados ​​en un promotor que dirige la expresión de una construcción fluorescente. Esta proteína indicadora es exógeno al sistema celular y por lo tanto no influye en los eventos de señalización que están teniendo lugar en la célula.

Tanto la microscopía y citometría de flujo han sido ampliamente utilizados en el campo de la señalización de la levadura. Como ejemplos, los compañeros de trabajo-Colman Lerner y correlacionados, en celdas individuales, la expresión de apareamiento periodistas específicos y constitutivamente expresadas por microscopía de cuantificar el ruido en el apareamiento de levadura de transducción de señales en cascada ^5, Acar y sus colegas utilizaron citometría de flujo para el estudio de la red de regulación el control de la expresión de los genes GAL ^6. En un estudio anterior ^7, hemos utilizado un combinatien una de estas dos técnicas para estudiar la salida de la expresión de la alta osmolaridad de glicerol (HOG) y la vía de levadura en ciernes. Esta proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) es provocada por el estrés hiper-osmótica. Es el resultado de la activación de las MAPK Hog1, que se transloca al núcleo de la célula para inducir un programa transcripcional que resulta en la expresión de aproximadamente 300 genes. Para estudiar este proceso, habíamos diseñado un reportero de expresión basado en el promotor STL1 (un gen inducido específicamente en respuesta a la actividad Hog1 ⁸⁾ que dirige la expresión de una proteína fluorescente Venus cuádruple (p STL1-qV). La citometría de flujo mediciones revelaron la presencia de dos poblaciones de células en el nivel de la tensión intermedia (NaCl 0,1 M) con sólo una fracción de la población que expresa el indicador fluorescente. Se utilizó microscopía de investigar más a fondo este comportamiento y descubrimos que este ruido en la expresión de proteínas se rige por factores intrínsecos ^9. Nos COUld observan, además, que las células con un nivel similar de actividad Hog1 podrían mostrar resultados sorprendentemente diferentes de expresión. La combinación de estas dos técnicas nos ha permitido demostrar cómo la lenta remodelación de genes de respuesta al estrés influyó en el resultado de expresión a nivel de células individuales ^7.

En este trabajo, utilizamos la expresión de la p-STL1 qV reportero inducida por choque hiper-osmótica como un ejemplo de la cuantificación de la expresión de proteínas por microscopía y citometría de flujo. La misma cepa sometida a estrés 0,2 M de NaCl se estudió con ambas técnicas. Esto nos permitirá poner de relieve algunas diferencias clave en estas dos técnicas altamente complementarias.

1. Medidas de Microscopía

1. Inocular 5 ml de medio sintético con levadura.
2. Se cultivan las células a 30 º C durante la noche.
3. Mida la OD ₆₀₀ de la cultura de la noche a la mañana siguiente.
4. Diluir la cultura durante la noche en 5 ml de medio sintético a OD ₆₀₀ 0.05.
5. Mantener el cultivo diluido a 30 ° C durante al menos 4 horas.
6. Preparar 3 veces concentrado (0,6 M) una solución de NaCl en medio sintético.
7. Preparar una solución de 1 mg / ml de Concanavalina A (ConA) en PBS.
8. Filtrado ~ 200 l de solución de ConA en la diapositiva también.
9. Deje reposar durante 30 min.
10. Retire la solución ConA.
11. Añadir 150 l de H ₂ O al pozo.
12. Retire H ₂ O.
13. Mida OD ₆₀₀ de cultivo celular.
14. Preparar 300 l de cultivo celular a OD ₆₀₀ = 0,02 en un microtubo de 1.5 ml.
15. Sonicar las células en un baño de agua durante 45 segundos.
16. Vortex brevemente la microtube.
17. Sonicar las células en un baño de agua durante 45 segundos.
18. Vortex brevemente el microtubo.
19. Añadir 200 l de cultivo celular para el pozo.
20. Espere 30 minutos para dejar que las células se depositan en el fondo del pozo.
21. Situar el porta bien en el microscopio.
22. Seleccione los ajustes de iluminación para el canal de fluorescencia a grabar.
23. Seleccionar los ajustes de iluminación para dos imágenes de campo claro (uno ligeramente fuera de foco: 3 micras por debajo del plano focal para permitir una segmentación adecuada de las células).
24. Seleccione los intervalos de tiempo para la medición del tiempo-lapso
25. Seleccione los campos de visión de la imagen.
26. Iniciar la adquisición de una serie de imágenes.
27. Pausa la adquisición de añadir los 100 l de 0,6 M NaCl medio.
28. Reanudar la proyección de imagen.

2. Citometría de Flujo Medidas

1. Inocular 5 ml de medio sintético con levadura.
2. Haga crecer a 30 º C durante la noche.
3. Medidael OD ₆₀₀ de la cultura de la noche a la mañana siguiente.
4. Diluir la cultura durante la noche en 5 ml de medio sintético a OD ₆₀₀ 0.1.
5. Crece a 30 ° C durante al menos 4 horas para llegar a un OD ₆₀₀ de 0,2 a 0,4.
6. Preparar la solución de cicloheximida 1 mg / ml en H ₂ O.
7. Preparar 3 veces concentrado (0,6 M) una solución de NaCl en medio sintético.
8. Preparar un microtubo de 1,5 ml con 100 l de 0,6 M NaCl medio para cada punto de tiempo para ser medidos.
9. En el tiempo 0, añadir 200 l de cultivo celular a cada microtubo.
10. Incubar con agitación a 30 ° C.
11. En el momento T, añadir 30 l de cicloheximida a un microtubo.
12. Repita paso 2,11 para todos los puntos de tiempo deseados.
13. Incubar todos los microtubos durante al menos 45 min y hasta 3 horas a 30 º C con agitación.
14. Preparar tubos de FACS con 400 l de PBS.
15. Sonicar las células en baño de agua durante 1 min.
16. Vortex brevemente los microtubos.
17. Hijoicar las células en baño de agua durante 1 min.
18. Vortex brevemente los microtubos.
19. Añadir 100 l de cultivo celular de cada microtubo a su correspondiente tubo de FACS.
20. Seleccione el láser de excitación 488 nm y 530/30 nm de paso de banda de filtro para la detección.
21. Prueba de que no expresa y expresar plenamente la muestra para verificar si se caen en el rango de sensibilidad del detector.
22. Medir 10.000 células para cada muestra adquirida.

Microscopía

Las células de levadura que llevan el reportero de la expresión de P-STL1 qV (ySP9 7) se adjunta a la parte inferior del pozo-portaobjetos y se coloca bajo el microscopio. Las células se estimularon mediante la adición de medio de estrés directamente en el pozo durante el curso de la sesión de formación de imágenes. Esto nos permite adquirir unas pocas imágenes de las células antes de la inducción vía y seguir su destino después de la estimulación. En el presente caso, las células fueron seguidos durante ~ 2 horas con un intervalo de tiempo de 10 min. Figura 1A es una imagen de las células no fluorescentes antes de la inducción y la Figura 1B muestra las mismas células 2 horas después de la tensión cuando el reportero expresión tiene sido inducida y se ha convertido en fluorescente.

Para extraer la información cuantitativa presente en estas imágenes, un proceso de análisis de imagen compleja tiene que ser realizado. Se incluye la segmentación de las células para definir objetos en el imago, el seguimiento de estos objetos de una trama a la siguiente y las mediciones de las características de estos objetos (forma y la intensidad propiedades). Hemos desarrollado nuestra propia plataforma llamada YeastQuant para realizar este análisis 10. Algunos otros softwares no comerciales están disponibles para realizar estas tareas:. CellProfiler 11, 12 o cellid CellX 13 Figura 1C muestra los resultados de un análisis realizado con YeastQuant. Cada traza de color rojo representa la evolución temporal de la intensidad media de fluorescencia de una sola célula. La línea azul muestra la mediana de más de 500 células que fueron segmentados y un seguimiento a lo largo de los 20 cuadros de cinco películas a intervalos adquiridos de cinco campos diferentes de las vistas desde el mismo pozo. El área de color azul claro representa el percentil 25 y 75 años de todas las intensidades medidas en un momento dado.

Citometría de Flujo

Para la citometría de flujo measurempadres, el cultivo celular se derramó en microtubos que contienen el medio de la tensión. Para estudiar la evolución temporal de la p STL1-qV expresión, la traducción se inhibió en diferentes puntos de tiempo (de 5 a intervalos de 10 min) con cicloheximida (Figura 2). Este medicamento bloquea la síntesis de nuevas proteínas, pero la maduración de la proteína fluorescente expresada ya no está perturbado. Por lo tanto, después de 45 minutos a una hora de incubación, las células se pueden medir en el citómetro de flujo que permite la cuantificación de la cantidad de proteína producida en el momento de la adición de cicloheximida. Esta estrategia evita el problema de la maduración de la proteína fluorescente y con ello se cuantifica la verdadera dinámica de la síntesis de proteínas fluorescentes.

La comparación de las dos técnicas

La Figura 3A compara la dinámica de la expresión de reportero medidos por microscopía y citometría de flujo. Mientras que la señal fluorescente comienza a subir 30-40min después de la tensión con la microscopía, las mediciones de citometría de flujo demuestra claramente que las proteínas ya se producen entre 10 a 15 minutos después del estímulo. Esta demora de media hora se debe a la lenta maduración de las proteínas fluorescentes 14. Aunque ambos métodos de cuantificar la intensidad de fluorescencia de las células, uno tiene que tener en cuenta que en este estudio, que no miden el mismo proceso biológico. Mientras, la microscopía sigue la aparición de la señal fluorescente, la citometría de flujo realmente cuantifica la síntesis de la proteína. Es fundamental tener en cuenta esta etapa de maduración al realizar imágenes de células vivas. En una situación en la que una proteína endógena se etiqueta con una proteína fluorescente, la proteína endógena se expresa y se activa antes de la fluorescencia de la etiqueta puede ser detectada.

Como se indicó anteriormente, las dos técnicas ofrecen información complementaria. La citometría de flujo puede medir un gran número de células muy rápidamente (10.000 o más). Por lo tanto, puede ofrecer conjuntos de datos estadísticamente ricos donde dos poblaciones superpuestas se puedan identificar o una serie de eventos raros se pueden observar. Microscopía proporciona información sobre un número limitado de células (del orden de 100). Sin embargo, debido a este conjunto de datos contiene información temporal y espacial y permite la correlación de las mediciones múltiples en la misma célula, puede ofrecer información de gran valor en el proceso biológico investigado.

Figura 1. Medición de la expresión del indicador por microscopía. A y B. Imágenes de células que llevan el fluorescente reportero expresión p STL1-qV antes (A) y 2 h después de la estimulación con NaCl 0,2 M (B). C. Evolución temporal de la gripe aparición orescence. Las curvas rojas representan la intensidad media de fluorescencia celular de algunos rastros de células individuales representativos. La curva azul representa la fluorescencia media de 550 huellas de una sola célula. El área de color azul claro representa el percentil 25 y 75 de la expresión fluorescente de la población de células en cada momento. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 2. Medición de la expresión del indicador por citometría de flujo. Histogramas de la fluorescencia celular de células que llevan el fluorescente reportero expresión p STL1-qV tratada con NaCl 0,2 M y con cicloheximida inhibió en diferentes puntos de tiempo.www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3. Comparación de la dinámica de expresión medidos por microscopía y citometría de flujo. A. Media de la intensidad de fluorescencia medida por citometría de flujo (línea continua) y microscopía (línea discontinua) como función del tiempo para tres réplicas biológicas. Las barras de error representan el error estándar de la media. B y C. Los histogramas de la intensidad de fluorescencia normalizada a 120 min después de la tensión para microscopía (B) y 60 min después de la tensión de la citometría de flujo (C) para las tres repeticiones. Haga clic aquí paraver la imagen más grande.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.