La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

Summary

Dos métodos complementarios basados ​​en citometría de flujo y microscopía se presentan que permiten la cuantificación, a nivel de una sola célula, de la dinámica de la expresión génica inducidos por la activación de una vía MAPK en la levadura.

Abstract

La cuantificación de la expresión génica a nivel de células individuales descubre nuevos mecanismos de regulación oscurecidas en las mediciones realizadas a nivel de población. Se presentan dos métodos basados ​​en la microscopía y citometría de flujo para demostrar cómo se pueden adquirir esos datos. La expresión de un indicador fluorescente inducida tras la activación de la alta osmolaridad MAPK vía de glicerol en la levadura se utiliza como un ejemplo. Se destacan las ventajas específicas de cada método. La citometría de flujo mide un gran número de células (10.000) y proporciona una medida directa de la dinámica de la expresión de la proteína independiente de la cinética lenta maduración de la proteína fluorescente. Obtención de imágenes de células vivas mediante microscopía es por el contrario limitado a la medición de la forma madurado del reportero en un menor número de células. Sin embargo, los conjuntos de datos generados por esta técnica pueden ser extremadamente rico gracias a la combinación de varios periodistas ya la información espacial y temporalobtenido a partir de células individuales. La combinación de estos dos métodos de medición puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la regulación de la expresión de proteínas por las vías de señalización.

Introduction

La señalización a través de cascadas de transducción menudo culmina en la expresión de proteínas. La caracterización de este perfil de expresión es un elemento clave en la comprensión de la función de las vías biológicas. La identificación de espectro de hasta reguladas proteínas y la dinámica de su activación se puede lograr mediante diversas técnicas como la micro-arrays, transferencias Northern o transferencias Western ^1-3. Sin embargo, estas técnicas promedio de la respuesta de toda una población de células. Para entender la regulación fina de la expresión de proteínas, es deseable para reunir mediciones en el nivel de células individuales. Lo ideal se....

Protocol

1. Medidas de Microscopía

1. Inocular 5 ml de medio sintético con levadura.
2. Se cultivan las células a 30 º C durante la noche.
3. Mida la OD ₆₀₀ de la cultura de la noche a la mañana siguiente.
4. Diluir la cultura durante la noche en 5 ml de medio sintético a OD ₆₀₀ 0.05.
5. Mantener el cultivo diluido a 30 ° C durante al menos 4 horas.
6. Preparar 3 veces concentrado (0,6 M) una solución de NaCl en medio sintético.
7. Preparar una solución de 1 mg / ml de Concanavalina A (ConA) en PBS.
8. Filtrado ~ 200 l de solución de ConA en la diapositiva también.
9. Deje reposar durante 30....

Results

Microscopía

Las células de levadura que llevan el reportero de la expresión de P-STL1 qV (ySP9 ⁷⁾ se adjunta a la parte inferior del pozo-portaobjetos y se coloca bajo el microscopio. Las células se estimularon mediante la adición de medio de estrés directamente en el pozo durante el curso de la sesión de formación de imágenes. Esto nos permite adquirir unas pocas imágenes de las células antes de la inducción vía y seguir su destino después de la estimulación. En el presente.......

Discussion

Microscopía

El tratamiento del pozo con ConA es un paso esencial para asegurar una imagen adecuada de las células. Debido a ConA tiene baja solubilidad en PBS (5 mg / ml), el proceso de filtración permite la eliminación de grandes agregados que están presentes en la solución sin filtrar y interfieren con la formación de imágenes. Las células se adhieren relativamente fuerte a la superficie tratada y la adición de la solución de la inducción no deben perturbar la localización de las células, lo .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reactivo
levadura>fuerte Base de nitrógeno	paraMedio	CYN6202
Mezcla de aminoácidos CSM	ParaMedio	DCS0011
Concanavalina A	GE Healthcare	17-0450-01
Cicloheximida	Fluka Aldrich Sigma	C7698	Tóxico
ySP9			W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-cuádrupleV enus
pSP34			pRS305 pSTL1 (-800 -0) - cuádruple V enus
Material
Microscopio	Nikon	Ti-Eclipse
Software de control de microscopio	Micro-manager	Ver 1.4.11
Cámara de incubación	LIS	The Box
Luz de fluorescencia fuente	Lumencor	SpectraX
Cámara	Hamamatsu	Flash 4.0
Citómetro de flujo	BD	FACS calibur
Baño de sonicador	Telesonic	TUC-150
corredera de 8 pocillos	Thermo Lab-tek	155409
placa de 96 pocillos	Matrical bioscience	MGB096-1-2-LG
FACS tubo	BD Falcon	352054