Cuantificación concurrente de componentes celulares y extracelulares de biofilms

Summary

Se presenta un protocolo para la cuantificación y comparación concurrente de tres componentes celulares y extracelulares dentro de biofilms. La metodología implica el uso de microscopía de escaneo láser confocal, software de análisis y visualización estructural de biopelículas y software de análisis estadístico.

Abstract

La microscopía de barrido láser confocal (CLSM) es una poderosa herramienta para la investigación de biopelículas. Muy pocas investigaciones han cuantificado con éxito la distribución concurrente de más de dos componentes dentro de las biopelículas porque: 1) la selección de colorantes fluorescentes que tienen una superposición espectral mínima es complicada, y 2) la cuantificación de múltiples fluorocromos plantea un problema multifactorial. Objetivos: Informar sobre una metodología para cuantificar y comparar distribuciones tridimensionales concurrentes de tres componentes celulares/extracelulares de biopelículas cultivadas en sustratos relevantes. métodos: El método consta de pasos distintos e interconectados que involucran el crecimiento de la biopelícula, la tinción, las imágenes CLSM, el análisis y la visualización estructural de la biopelícula y el análisis estadístico de los parámetros estructurales. Las biopelículas de Streptococcus mutans (cepa UA159) se cultivaron durante 48 horas en muestras estériles de compuestos de resina Point 4 y TPH³. Posteriormente, las muestras se sumergieron durante 60 segundos en enjuagues bucales Biotène PBF (BIO) o Listerine Total Care (LTO), o en agua (grupo de control; n = 5/grupo). Las biopelículas se tiñeron con fluorocromos para sustancias poliméricas extracelulares, proteínas y ácidos nucleicos antes de obtener imágenes con CLSM. Los parámetros estructurales de la biopelícula calculados con el software de análisis de imágenes ISA3D fueron el biovolumen y el espesor medio de la biopelícula. Los análisis estadísticos de modelos mixtos compararon los parámetros estructurales entre los grupos de enjuague bucal y control (software SAS; α=0,05). El software Volocity permitió la visualización de distribuciones 3D de componentes de biopelícula superpuestos (fluorocromos). Resultados: El enjuague bucal BIO produjo estructuras de biofilm que difirieron significativamente del control (p<0.05) en ambos compuestos de resina, mientras que LTO no produjo diferencias (p>0.05) en ninguno de los productos. Conclusiones: Esta metodología cuantificó y comparó de manera eficiente y exitosa las distribuciones 3D concurrentes de tres componentes principales dentro de las biopelículas de S. mutans en sustratos relevantes, superando así dos desafíos para la evaluación simultánea de los componentes de la biopelícula. Este método también se puede utilizar para determinar la eficacia de los agentes antibacterianos/antiincrustantes contra múltiples componentes de la biopelícula, como se muestra mediante enjuagues bucales. Además, este método tiene una amplia aplicación porque facilita la comparación de las estructuras/arquitectura 3D de las biopelículas en una variedad de disciplinas.

Introduction

Las biopelículas son comunidades microbianas estructuradas que están encapsuladas en una matriz extracelular autoproducida y se adhieren a superficies biológicas o inertes¹. Las biopelículas representan un estilo de vida común para muchas bacterias, y se forman mediante la transición en etapas de células que flotan libremente (planctónicas) a comunidades complejas de múltiples especies. La resistencia inherente de los biofilms a los agentes antimicrobianos está en la raíz de muchas infecciones bacterianas persistentes y crónicas^1,2, como lo demuestran los biofilms orales (placa dental). Los microorganismos cariogénicos, como los estreptococos mutans, procesan la sacarosa y otros carbohidratos para producir una matriz extracelular y generar ácidos que pueden desmineralizar la estructura dental y causar caries dental. La mayoría de las matrices de biopelículas son biopolímeros que constan de componentes celulares y extracelulares como exopolisacáridos (EPS), proteínas y ácidos nucleicos^3,4.

La microscopía de barrido láser confocal (CLSM), la técnica más utilizada para la obtención de imágenes de fluorescencia, ha transformado radicalmente la imagen óptica en biología porque tiene la capacidad de recoger imágenes 3D de estructuras biológicas hidratadas sin fijación^5,6,7. Esta técnica no destructiva consiste en recolectar imágenes de secciones delgadas dentro de una región de interés en el espécimen de tal manera que se elimina la contribución de la luz desenfocada. La calidad y resolución de las imágenes capturadas por CLSM está más allá de lo que se puede lograr con microscopía de fluorescencia de campo amplio. Uno de los principales inconvenientes del CLSM es que el escaneo de imágenes se realiza a un ritmo más lento que con las técnicas de microscopía de campo amplio, en las que se recogen imágenes completas simultáneamente⁵. Sin embargo, con una selección cada vez más amplia de fluorocromos, láseres y filtros, el CLSM se ha convertido en una de las técnicas predominantes para la obtención de imágenes multiespectrales^5,7.

Estudios previos han demostrado que CLSM es una herramienta útil para examinar la estructura o arquitectura de las biopelículas mediante el uso de una o dos etiquetas o tinciones fluorescentes para proporcionar una mejor comprensión de la distribución de EPS y células dentro de las biopelículas, y especialmente dentro de la matriz extracelular^7,8. En teoría, la tinción/marcaje fluorescente de múltiples componentes es deseable para explorar la estructura detallada y la colocalización de componentes celulares y extracelulares dentro de las biopelículas. Sin embargo, el análisis simultáneo de varios componentes dentro de las biopelículas puede ser un desafío porque: 1) la selección de colorantes fluorescentes que tienen una superposición espectral mínima es complicada, y 2) la cuantificación de múltiples fluorocromos plantea un problema multifactorial. La colocalización con múltiples fluorocromos requiere el uso de tinciones altamente específicas con una interferencia espectral mínima para evitar cualquier efecto de sangrado, que ocurre cuando dos fluorocromos tienen una superposición significativa en su pico espectral, lo que hace que uno se excite más fuertemente que el otro⁹. Idealmente, los fluorocromos que tienen espectros de excitación que no se superponen proporcionarían los mejores resultados, sin embargo, es muy difícil encontrar tinciones que cumplan con este criterio. En su lugar, la selección de las tinciones se optimiza eligiendo fluorocromos cuyos espectros de emisión tienen una superposición mínima, lo que permite ver las tinciones una por una dentro de una banda de longitud de onda de observación limitada⁹.

La superposición de imágenes de fluorescencia es probablemente el método más utilizado para evaluar la distribución concurrente de fluorocromos. La colocalización de los diversos componentes aparece como una superposición de diferentes colores a través de múltiples canales creados por los fluorocromos que se están examinando¹⁰. Las herramientas para mostrar imágenes de fluorescencia multicanal como imágenes en color combinadas están disponibles en la mayoría de los programas CLSM y de análisis de imágenes biológicas. Aunque la superposición de imágenes es útil para la evaluación espacial de la colocalización, las imágenes solo pueden examinarse cualitativamente mediante análisis visual. Esto proporciona una cantidad limitada de información, ya que estas representaciones generalmente no son útiles para cuantificar la colocalización en diferentes condiciones experimentales ni determinan si la colocalización excede la coincidencia aleatoria¹¹. Hasta ahora, muy pocas investigaciones han utilizado métodos cuantitativos para analizar la estructura tridimensional de las biopelículas y sus componentes, y aún menos han cuantificado el efecto de los tratamientos antibacterianos o las medidas antiincrustantes en los componentes de las biopelículas.

El objetivo de este estudio fue reportar una metodología para la cuantificación y comparación de las distribuciones tridimensionales concurrentes de tres componentes celulares y extracelulares de biofilms. El método consta de pasos distintos pero interconectados que involucran el crecimiento de la biopelícula, la tinción, la obtención de imágenes CLSM de las biopelículas, el análisis y la visualización estructural de la biopelícula y el análisis estadístico de los parámetros estructurales. El ensayo de crecimiento de biopelícula permite el crecimiento de biopelícula en sustratos relevantes y produce estructuras de biopelícula que son reproducibles. La combinación de la novedosa tinción simultánea de componentes de EPS, proteínas y ácidos nucleicos con la medición de los parámetros estructurales de la biopelícula en 3D da como resultado distribuciones cuantificables de los componentes dentro de las biopelículas. El análisis estadístico de los parámetros estructurales de la biopelícula facilita la evaluación de las biopelículas en condiciones experimentales específicas (por ejemplo, después del tratamiento con enjuagues bucales), como se describirá en la siguiente sección.

Protocol

1. Preparación de medios y reactivos

1. Prepare 300 ml de medio de cultivo durante la noche (THY; 3% de caldo Todd Hewitt preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante complementado con 0,3% de extracto de levadura en agua ultrapura) y autoclave. Almacene a temperatura ambiente hasta por 2 meses.
2. Prepare 1 L de agar THY (3% de caldo Todd Hewitt, 0,3% de extracto de levadura y 1,5% de agar en agua ultrapura), en autoclave, y enfríe a 60 °C antes de verterlo en placas de Petri. Almacenar a 4 °C durante un máximo de 3 meses.
3. Prepare 150 ml de medio de crecimiento de biofilm (0,5X TY suplementado con 10 mM de sacarosa; 1,5% de triptona, 0,5% de extracto de levadura y 10 mM de sacarosa en agua ultrapura) y filtre la esterilización. Almacene a temperatura ambiente hasta por 1 mes.
4. Prepare 1 L de solución salina tamponada con fosfato (PBS; 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ y 0,24 g de KH₂PO₄ en agua ultrapura) y autoclave. Almacene a temperatura ambiente durante varios meses.
5. Fabricar 600 ml de tampón Tris HCl de 10 mM complementado con 10 mM de CaCl₂ en agua ultrapura (tampón TC; pH 7,2) y autoclave. Almacene a temperatura ambiente durante varios meses.
6. Autoclave 1 L de agua ultrapura. Almacene a temperatura ambiente durante varios meses.

2. Fabricación de muestras

1. Fabrica muestras en forma de disco de compuestos de resina dental Point 4 (PF) y TPH³ (TP) en un molde de acero inoxidable hecho a medida en dos incrementos. Cada incremento se fotopolimeriza durante 40 segundos mediante una unidad de fotopolimerización LED. Los dos productos tienen composiciones y niveles de relleno ligeramente diferentes y, por lo tanto, producen diferentes topografías superficiales sobre las que se cultivarán las biopelículas.
   1. Las muestras de sustratos relevantes podrían fabricarse utilizando protocolos establecidos de otras disciplinas en lugar del paso 2.1.
2. Acabar y pulir las muestras hasta obtener un acabado superficial final aceptable, por ejemplo, utilizando una amoladora-pulidora semiautomática. Enjuague las muestras pulidas con agua ultrapura y séquelas con aire comprimido.
3. Esterilice las muestras utilizando gas de óxido de etileno o un método de esterilización alternativo.

3. Crecimiento de biofilm

1. Inocular una sola colonia de S. mutans en 4 ml de medio de cultivo durante la noche (paso 1.1). Incubar durante la noche a 37 °C durante 16-18 h. La densidad óptica (OD₆₀₀) del cultivo debe ser de ≥0,9.
   1. Es mejor utilizar una colonia de cultivos en placa que hayan sido pasados 2 veces de un stock original, ya que esto da como resultado un crecimiento de biopelícula más consistente.
2. Cree una dilución 1:100 utilizando el cultivo nocturno (paso 1.1) en 10 ml de medio de crecimiento de biofilm (paso 1.3).
3. Transfiera muestras compuestas de resina estériles (p. ej., PF, TP) a placas estériles de 12 pocillos.
4. Añadir 2,5 ml de medio de cultivo diluido (paso 3.2) a los pocillos para el tratamiento (enjuague bucal) y a los grupos de control. Añada 2,5 ml de medio de crecimiento de biofilm estéril no inoculado a los pocillos de control de esterilidad.
5. Cultive las biopelículas en condiciones microaerófilas. Coloque las placas en un agitador a 100 rpm dentro de una incubadora a 37 °C durante 24 horas.
6. Después de 24 horas, aspirar asépticamente el medio de todos los pocillos y lavar dos veces con PBS estéril (paso 1,4; 2,5 ml/pocillo), aspirando el PBS después de cada lavado. Reponga 2,5 ml de medio de crecimiento de biofilm fresco en cada pocillo e incube durante 24 horas adicionales en condiciones idénticas a las del paso anterior, para un tiempo total de crecimiento del biofilm de 48 h.
7. En lugar de los pasos anteriores, se podrían cultivar biopelículas de otras especies en sustratos utilizando protocolos establecidos.

4. Tratamientos antibacterianos/enjuagues bucales

1. Aspire el medio después de que se complete el crecimiento de la biopelícula.
2. Añadir 2,5 ml de enjuague bucal Biotène PBF (BIO) o Listerine Total Care (LTO), u otra modalidad de tratamiento, en los pocillos para los grupos de tratamiento, y añadir 2,5 ml de agua ultrapura estéril al pocillo del grupo de control. Sumerja las muestras durante 60 segundos, según las instrucciones del fabricante, mientras agita las placas en un agitador orbital a 150 rpm. Aspire inmediatamente tanto el enjuague bucal como el agua ultrapura de los pozos.
3. Lave las muestras 5 veces durante 15 segundos por lavado con agua ultrapura estéril en el agitador orbital a 150 rpm, aspirando agua después de cada paso de lavado.
4. En lugar de los pasos anteriores, se podrían probar otros agentes antibacterianos utilizando protocolos establecidos.

5. Tinción

1. Prepare las diluciones de tinción para el análisis de biopelícula.
   1. Prepare una solución madre de 5 mg/ml de Concanavalina A, Alexa Fluor 647 conjugado (AF) en bicarbonato de sodio 0,1 M pH 8,3. Almacenar a -20 °C en alícuotas de un solo uso durante varios meses, ya que no se recomienda la congelación y descongelación. Con esta solución madre de AF, prepare una dilución de 250 μg/ml en tampón TC.
   2. Prepare una dilución de 10 μM utilizando la solución madre Syto 9 (SY) de 5 mM, proporcionada por el fabricante, en tampón TC. Almacene la solución madre SY restante a -20 °C durante varios meses.
   3. Prepare una dilución de 10x utilizando la solución madre Sypro Red (SR) 5.000x, proporcionada por el fabricante, en agua ultrapura estéril. Almacene la solución madre SR restante a -20 °C durante varios meses.
2. Lave todos los biofilms 2 veces con tampón TC (2,5 ml/pocillo) con un movimiento giratorio manual, permitiendo que el segundo lavado permanezca en la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Aspirar.
3. Coloque una gota de 50 μl de tinción de AF en cada muestra de biopelícula. Manchar durante 30 min a temperatura ambiente, protegido de la luz. Lavar 2 veces con tampón TC (2,5 ml/pocillo), aspirando después de cada lavado.
4. A continuación, aplique una gota de 50 μl de tinción SY en cada muestra de biopelícula. Manchar durante 30 min a temperatura ambiente, protegido de la luz. Lavar 2 veces con agua ultrapura estéril (2,5 ml/pocillo), aspirando después de cada lavado
5. Por último, coloque una gota de 50 μl de tinción SR en cada muestra de biopelícula. Manchar durante 30 min a temperatura ambiente, protegido de la luz. Lavar 3 veces con agua ultrapura estéril (2,5 ml/pocillo), aspirando después de cada lavado.
6. Transfiera las muestras a una placa de 6 pocillos, colocando una muestra por pocillo en 6 ml de agua ultrapura estéril para facilitar la microscopía confocal.

6. Obtención de imágenes mediante microscopía de barrido láser confocal

1. Adquiera imágenes de cada componente (tinción) dentro de las biopelículas de los grupos de tratamiento y control utilizando una configuración de microscopio de escaneo láser confocal que se muestra en la Tabla 1. En este estudio se utilizó una lente de inmersión de 63X con una apertura numérica de 0,9 que tiene una distancia de trabajo de 2,2 mm.
   
   Tabla 1. Configuración del microscopio de barrido láser confocal.

2. Establezca el tamaño de escaneo en 250 μm x 250 μm y una resolución mínima de píxeles de 512 x 512 para adquirir imágenes CLSM con una resolución adecuada para el análisis cuantitativo.
3. Utilice la tinción SY para establecer los puntos superior e inferior de la pila de imágenes de biopelícula y, a continuación, establezca el paso z para que sea adecuado para el análisis cuantitativo (0,6 μm para este estudio). Antes de recopilar un escaneo, optimice los parámetros de la imagen y la tinción (es decir, el voltaje PMT y el desplazamiento) utilizando la opción QLUT. Se utilizó una tabla de búsqueda de colores para asignar pseudocolores a cada tinción (verde para SY, rojo para SR y azul para AF) con el fin de hacer que cada componente de la biopelícula sea más distinguible en la reconstrucción 3D.
4. Recopile imágenes CLSM a 400 Hz mediante el escaneo secuencial en el modo "entre pilas" para optimizar la captura de imágenes de múltiples tinciones dentro de la misma biopelícula.

7. Análisis estructural de biopelículas

1. Analice las imágenes CLSM recogidas mediante software de análisis de imágenes para biofilms. Los siguientes pasos describen el uso del software ISA3D¹² para calcular los parámetros estructurales de las imágenes de biopelícula recopiladas.
   1. Copie los archivos de imagen CLSM para cada biopelícula en la carpeta Imágenes, como se especifica en el manual del software. Asegúrese de que se sigue la convención de nomenclatura para los archivos CLSM requerida por el software. El software permite el análisis de archivos dentro de subcarpetas en modo por lotes, lo que facilita el análisis de las biopelículas del grupo de tratamiento y control en la misma ejecución.
   2. Introduzca las dimensiones de los ejes x, y y z de las imágenes CLSM en los campos dxy y dz del cuadro de diálogo principal. Seleccione la configuración de mapeo de umbral y distancia, como se describe en el manual del software (se utilizaron Otsu y Quasi-Euclidean para este estudio, respectivamente). Introduzca un nombre adecuado para el archivo de resultados y, a continuación, ejecute el programa. Se generará un archivo de resultados en la carpeta ISA.
   3. Visualice el archivo de resultados para obtener valores de veinte parámetros estructurales 3D¹² como el biovolumen y el espesor medio de la biopelícula (medidos en este estudio) que cuantifican la distribución 3D de cada componente (tinción) dentro de la biopelícula.

8. Visualización de la estructura de la biopelícula

1. Cree una reconstrucción de los componentes superpuestos (manchas) dentro de cada biopelícula utilizando un software de análisis de imágenes. Los siguientes pasos describen el uso del software Volocity para crear reconstrucciones en 3D.
   1. Cree una biblioteca para cada biopelícula copiando los archivos de imagen CLSM en el software, como se describe en el manual.
   2. Utilice la opción de menú Renderizador 3D para producir una imagen 3D reconstruida a partir de las imágenes CLSM de cada biopelícula (para este estudio se utilizó el formato de opacidad HR).
   3. Gire la imagen 3D para orientar todas las biopelículas de manera similar con respecto a los ejes de coordenadas x, y y z. Capture una instantánea de la reconstrucción de la biopelícula correctamente orientada y, a continuación, exporte la instantánea en TIFF, JPEG u otro formato adecuado.
2. Realice un análisis visual de la distribución concurrente de EPS, proteínas y componentes de ácidos nucleicos dentro de las biopelículas en las imágenes reconstruidas.
3. Utilice el coeficiente de correlación de Pearson y el coeficiente de superposición de Manders para realizar un análisis de colocalización de múltiples componentes de la biopelícula (la colocalización no se midió en este estudio).

9. Análisis estadístico

1. Utilice análisis estadísticos de modelos mixtos separados para comparar los valores medios de los parámetros estructurales entre los grupos de enjuague bucal y control (α = 0,05). Para este estudio se utilizó el software SAS para realizar el análisis estadístico.

Results

Los resultados representativos para los tratamientos (enjuagues bucales) y el grupo control no tratado se muestran en la Tabla 2 y en las Figuras 1 y 2. En la Tabla 2 se muestran los valores medios y de desviación estándar de los parámetros estructurales del biofilm biovolumen (μm³) y espesor medio del biofilm (μm) que se calcularon utilizando el software ISA3D. Los parámetros estructurales de las biopelículas tratadas con enjuague bucal que diferían significativamente de los de las biopelículas en el grupo control (p<0.05) tienen valores medios y desviaciones estándar resaltados en rojo. Los resultados de los análisis estadísticos de modelos mixtos demostraron que el enjuague bucal BIO produjo estructuras de biopelícula que difirieron significativamente del control (p<0.05) en ambos compuestos de resina, mientras que el enjuague bucal LTO no produjo diferencias significativas (p>0.05) en ninguno de los compuestos de resina. Los resultados muestran claramente que los componentes de la biopelícula celular y extracelular que quedan después de los dos tratamientos de enjuague bucal difieren. También debe tenerse en cuenta que las biopelículas de S. mutans cultivadas en los dos sustratos (PF y TP) difirieron en la estructura 3D a pesar de que se cultivaron en condiciones similares y ambos sustratos se pulieron con abrasivos similares.

La distribución concurrente de EPS, proteínas y ácido nucleico dentro de las biopelículas se puede visualizar a través de las reconstrucciones 3D generadas con el software Volocity. Las figuras 1 y 2 muestran reconstrucciones representativas de biopelículas del grupo de control cultivadas en compuestos de resina PF y TP, respectivamente. La tinción azul representa el EPS dentro de las biopelículas de S. mutans, la tinción verde muestra ácidos nucleicos y la tinción roja muestra proteínas. El espacio intermedio puede estar ocupado por agua u otros componentes de biopelículas marcados con fluorescencia.

Figura 1. Una reconstrucción 3D representativa de la biopelícula de S. mutans cultivada en un compuesto de resina PF en el grupo de control (no tratada con enjuague bucal). La superposición simultánea de las tres tinciones dentro de una sola biopelícula permite la visualización simultánea de los componentes de EPS (tinción azul), ácido nucleico (tinción verde) y proteínas (tinción roja) dentro de las biopelículas de S. mutans. (1 unidad = 24 μm). Haga clic aquí para ver la figura más grande.

Figura 2. Una reconstrucción 3D representativa de la biopelícula de S. mutans cultivada en un compuesto de resina TP en el grupo de control (no tratada con enjuague bucal). La superposición simultánea de las tres tinciones dentro de una sola biopelícula permite la visualización simultánea de los componentes de EPS (tinción azul), ácido nucleico (tinción verde) y proteínas (tinción roja) dentro de las biopelículas de S. mutans. (1 unidad = 24 μm). Haga clic aquí para ver la figura más grande.

Compuesto de resina		Punto 4		TPH3
enjuague	componente	BV (μm3)	MT (μm)	BV (μm3)	MT (μm)
Biotène PBF	Ácidos nucleicos	279.517±53.291	9,32±2,80	195.033±42.014	7.45±3.70
	Eps	344.902±56.386	35.22±17.19	197.840±62.351	9,83±7,26
	proteínas	298.796±62.868	54.21±21.65	216.033±66.654	24.33±39.64
Listerine Cuidado Total	Ácidos nucleicos	355.707±110.444	26.45±14.21	273.296±47.323	13.43±2.89
	Eps	494.099±180.592	64,90± 26,68	329.150±47.145	34.35±30.32
	proteínas	348.416±161.316	58,68±47,28	303.150±54.705	34,18±41,46
Control (sin tratar)	Ácidos nucleicos	388.375±42.152	51,15±40,66	327.809±39.400	17.08±1.65
	Eps	660.448±173.197	91,37±74,84	363.850±67.612	28.33± 15.07
	proteínas	517.274±119.475	127,96±73,84	353.161±56.518	21.17±4.41

Tabla 2. Valores medios y desviación estándar del biovolumen (BV) y espesor medio de la biopelícula (MT) de las biopelículas tratadas con BIO o LTO, o dejadas sin tratar (grupo control). Los parámetros estructurales de las biopelículas tratadas con enjuagues bucales que diferían significativamente de los de las biopelículas en el grupo control (p<0,05) tienen valores medios y de desviación estándar resaltados en rojo.

Discussion

La adquisición de imágenes CLSM debe realizarse en la forma y el formato necesarios para la cuantificación de biopelículas y para el análisis de colocalización, de modo que la distribución de la intensidad de la señal en cada imagen sea una representación confiable de la distribución de cada fluorocromo en la pila de biopelículas. La intensidad de la señal debe distinguirse del ruido y el fondo^10,11, no verse afectada por la autofluorescencia del sustrato y tener un sangrado mínimo debido a la interferencia espectral entre los fluorocromos utilizados¹¹. El ruido es una limitación inevitable de la microscopía de fluorescencia¹¹, y la calidad de la imagen a veces puede verse limitada por razones técnicas o logísticas. La identificación de fluorocromos con una superposición espectral mínima es fundamental para el éxito de este método, pero puede ser complicada. Además, la cuantificación de múltiples fluorocromos plantea un problema multifactorial. Por lo tanto, no es sorprendente que muy pocas investigaciones hayan cuantificado con éxito la distribución concurrente de más de dos componentes dentro de las estructuras de las biopelículas.

El objetivo de este estudio fue reportar una metodología que consiste en pasos distintos pero interconectados para la cuantificación y comparación de las distribuciones tridimensionales concurrentes de tres componentes celulares y extracelulares dentro de las biopelículas. El ensayo de crecimiento de biopelícula descrito permite el crecimiento de biopelículas en sustratos relevantes y produce estructuras de biopelículas que son reproducibles, como lo demuestran los resultados informados en la Tabla 1. La combinación de una nueva tinción simultánea de componentes de EPS, proteínas y ácidos nucleicos con la medición de parámetros estructurales de biopelículas 3D da como resultado distribuciones cuantificables de componentes dentro de las biopelículas. El análisis visual cualitativo de la distribución simultánea de EPS, proteínas y ácido nucleico dentro de las biopelículas es posible mediante la reconstrucción de tinciones superpuestas dentro de cada biopelícula. El software ISA3D¹² contiene varios parámetros estructurales únicos, como la dimensión fractal, la homogeneidad y el coeficiente de rugosidad de la biopelícula, además de parámetros medidos tradicionalmente, como la porosidad y el espesor de la biopelícula, para mejorar la cuantificación de las estructuras 3D de las biopelículas. El análisis estadístico de los parámetros estructurales de la biopelícula facilita comparaciones relevantes de las biopelículas en condiciones experimentales específicas, como la eficacia antibacteriana/antiincrustante (por ejemplo, después del tratamiento con enjuagues bucales) o a lo largo del tiempo (efectos temporales).

Esta metodología cuantificó y comparó de manera eficiente y exitosa las distribuciones 3D concurrentes de tres componentes principales dentro de las biopelículas de S. mutans que se cultivaron en sustratos relevantes, superando así dos desafíos para la evaluación simultánea de los componentes de la biopelícula. Este método también se puede utilizar para determinar la eficacia de los tratamientos antibacterianos o las medidas antiincrustantes contra múltiples componentes de biopelícula, como se muestra con enjuagues bucales en este estudio. Además, la mayoría de los protocolos descritos anteriormente pueden sustituirse por protocolos para la fabricación de sustratos relevantes y ensayos de crecimiento de biopelículas de microorganismos relevantes. Por lo tanto, este método tiene una amplia aplicación porque facilita la comparación de estructuras/arquitecturas 3D de biopelículas in vitro e in vivo en una variedad de disciplinas, incluidas las ciencias médicas, dentales, geológicas y marinas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010
Bacto Todd Hewitt Caldo	Becton, Dickinson and Company	249240
Extracto de levadura, granulado	EMD Millipore	1.03753.0500
Bacto Tryptone	Becton, Dickinson and Company	211705
OmniPur Sacarosa	EMD Millipore	8510
Cloruro de potasio, reactivo ACS, 99.0-100.5%	Sigma-Aldrich	P3911-500G
Fosfato de potasio, monobásico, ≥ 99.0%, ACS reactivo	Sigma-Aldrich	P0662-500G
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S9888-500G
Fosfato de sodio, monobásico, monohidrato	EMD Millipore	SX0710-1
Tris(hidroximetil)aminometano, 99.8+%, reactivo ACS	Sigma-Aldrich	252859-500G
Concanavalin A, Alexa Fluor 647	Convitrogen	C21421
Syto 9	Invitrogen	S34854
Sypro Red	Invitrogen	S12012 o S6653
Biotè ne PBF Enjuague Bucal	GlaxoSmithKline	N/A
Listerine Total Care	McNeil-PPC, Inc.	N/A