El pez cebra, un pequeño pez tropical, se ha convertido en un modelo popular para el estudio de la función de genes durante el desarrollo de vertebrados y la enfermedad. La expresión temporal y espacial de los genes diana se puede determinar mediante In situ Hibridación. Nuestro protocolo mejorado permite la detección de bajos abundantes transcripciones con baja señal de fondo no específica.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Alta resolución todo el montaje de
En este artículo
Resumen
Resumen
Este artículo se centra en todo el montaje hibridación in situ (deseo) de embriones de pez cebra. La tecnología DESEO facilita la evaluación de la expresión génica tanto en términos de distribución en los tejidos y la etapa de desarrollo. Los protocolos se describen para el uso de la voluntad de embriones de pez cebra utilizando sondas de ARN antisentido marcadas con digoxigenina. Las sondas se generan mediante la incorporación de nucleótidos unidos a digoxigenina mediante transcripción in vitro de plantillas de genes que han sido clonados y linealizado. Los chorions de embriones cosechados en etapas de desarrollo definidas se eliminan antes de la incubación con sondas específicas. Siguiendo un procedimiento de lavado para eliminar el exceso de sonda, los embriones se incuban con anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina. Mediante el empleo de un sustrato cromogénico para la fosfatasa alcalina, la expresión de genes específicos puede ser evaluada. Dependiendo del nivel de la expresión génica todo el procedimiento puede ser completado dentro de 2-3 días.
Introducción
El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo animal de gran alcance para el estudio de desarrollo de los vertebrados, la enfermedad, el comportamiento, y en la detección de drogas 1-3. Embriones de pez cebra se pueden obtener en grandes cantidades a partir de un solo cruce. La fertilización y el desarrollo se produce fuera del útero y los embriones ópticamente transparentes se desarrollan rápidamente. Eventos de desarrollo críticos se producen durante las primeras 48 horas después de la fecundación (HPF). Esto incluye la aparición de primordios de órganos y la iniciación de citodiferenciación. Desmontables o sobre-expresión de....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Todo el montaje hibridación in situ de embriones de pez cebra
1.1 Preparación de embriones
- Recoger los embriones en las etapas de desarrollo requeridos. Por favor, vea. Kimmel et al 5 para la descripción fase embrionaria.
- Retire chorions manualmente utilizando fórceps (pinzas de relojero Dumont no. 5).
- Fijar embriones en una solución al 4% de paraformaldehído (PFA), preparada en PBS (tampón fosfato salino) durante la noche a 4 ° C.
- Lavar embriones con PBS, al menos 3 veces durante 5 min cada uno a temperatura ambiente.
- Embriones en t....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Utilizando el protocolo con 50 embriones por canasta (por gen / por condición experimental) el patrón de expresión de ese gen se puede lograr en un solo experimento. Casi todos los embriones muestran patrones similares de expresión para un gen particular. Los ejemplos representativos de la tinción en hibridación in situ se muestran en las Figuras 3-6.
Tanto el sentido y anti-sentido ribosondas se sintetizan a partir de los ADNc correspondientes a PC5.1 PC5........
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Hemos desarrollado métodos mejorados para visualizar ARN con alta resolución. La hibridación in situ en los procedimientos se llevan a cabo utilizando simples cestos hechos a medida con fondos porosos (Figura 1). Los embriones se procesaron utilizando soluciones libres de RNasa en placas de 6 pocillos a temperatura ambiente en condiciones estériles.
Para segregar embriones cestas están hechas de diferentes tubos Eppendorf de colores. Cestas con o sin un borde se uti.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA - Promotor Dual pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Kit de Purificación de Pásmidos | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 y HindIII Enzimas de restricción | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Tampón Fenol saturado, | Invitrogen | 15513039 | almacenar a 4 °C. Irritante de ojos, piel y vías respiratorias y presunto carcinógeno. Se debe tener cuidado al manipularlo. |
| Cloroformo | Fisher | C607-1 | Tóxico y sospechoso de ser cancerígeno. Trabaje debajo de la campana extractora. |
| ADNasa libre de RNasa I | Roche 4716728001 | Prepare pequeñas alícuotas y almacene a -20 ° C. | |
| Mezcla de marcaje DIG-RNA con ARN polimerasa Sp6, T7 y T3 | Roche | 11277073910 | |
| Inhibidor de la ARNasa | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Acetato de sodio (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100% etanol | Alcoholes comerciales Dietil | ||
| pirocarbonato (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | El DEPC es un irritante para los ojos, la piel y las vías respiratorias. Evite el contacto con la piel y los ojos. Use gafas de seguridad, guantes y mascarilla. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Sistemas de acuarios | instantáneos de sal oceánica | N/A | |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldehído (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare y almacene a -20 ° C. C como alícuotas de 40 ml para su uso posterior. El PFA es tóxico. Use gafas de seguridad, guantes y mascarilla contra el polvo. |
| Feniltiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC es altamente tóxico. Use gafas de seguridad, guantes y mascarilla contra el polvo. |
| Metanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (Relojero' s) Patrón de pinzas n.º 5 | Fine Science Tools | ||
| Cluster de cultivo celular de seis pocillos | Sarstedt | 83.1839 | |
| Las cestas están hechas de malla de nailon y tubos Eppendorf Preparación | Para hacer las cestas, corte tubos Eppendorf (1,5 ml) con o sin bordes para quitar el extremo cónico. Corte la malla de nailon en pedazos pequeños correspondientes al tamaño de los extremos cortados de los tubos Eppendorf. Coloque los tubos con la malla de nailon que cubre el extremo cortado en un ... placa caliente hasta que tanto el tubo como la malla de nylon se peguen (llevar en campana de gases). Corta el exceso de malla de las cestas y guárdalas en metanol 100% hasta que se utilicen. | ||
| Polioxietilenosmonolaurato orbital (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinasa K | Fermentas | EO0491 | |
| Anhídrido Acético | Sigma | 242845 | |
| Trietanolamina | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamida, grado de alta pureza | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Resina | Bio Rad | 142-6424 | |
| Ácido cítrico monohidrato | Sigma | C0706-500G | |
| Heparina Sal de Sodio | Sigma | H3393-25KU | |
| Tampón de citrato salino-sódico (SSC) | Sigma | S6639 | |
| ARNt de levadura de panadería tipo X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Clorhidrato de levamisol | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimetilformamida anhidro (DMF) | Sigma | 227056 | Irritante, tóxico, combustible y sospecha de teratógeno. Manéjelo con ropa de seguridad adecuada, incluidos guantes y gafas. |
| 5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) | Sigma | N6639 | Proteja esta solución de la luz. |
| Nitroblue tetrazolio (NBT) | Sigma | 840W | Protege esta solución de la luz. |
| Albúmina de suero bovino, fracción V purificada (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Ovejas Anti-digoxigenina-AP Fab Fragmentos Roche | 1093274910 | ||
| Glicerol | Sigma | G5516-500ML | |
| Placas de cultivo celular de 96 pocillos | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| Sistemas de | acuarios | /A |
Referencias
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
