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Alta resolución todo el montaje de

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DOI:

10.3791/50644

⸱

19 de octubre de 2013

 , 
1Endocrine Research Laboratory and Department of Medicine, Royal Victoria Hospital, 2McGill University Health Centre Research Institute

En este artículo

Resumen

El pez cebra, un pequeño pez tropical, se ha convertido en un modelo popular para el estudio de la función de genes durante el desarrollo de vertebrados y la enfermedad. La expresión temporal y espacial de los genes diana se puede determinar mediante In situ Hibridación. Nuestro protocolo mejorado permite la detección de bajos abundantes transcripciones con baja señal de fondo no específica.

Resumen

Este artículo se centra en todo el montaje hibridación in situ (deseo) de embriones de pez cebra. La tecnología DESEO facilita la evaluación de la expresión génica tanto en términos de distribución en los tejidos y la etapa de desarrollo. Los protocolos se describen para el uso de la voluntad de embriones de pez cebra utilizando sondas de ARN antisentido marcadas con digoxigenina. Las sondas se generan mediante la incorporación de nucleótidos unidos a digoxigenina mediante transcripción in vitro de plantillas de genes que han sido clonados y linealizado. Los chorions de embriones cosechados en etapas de desarrollo definidas se eliminan antes de la incubación con sondas específicas. Siguiendo un procedimiento de lavado para eliminar el exceso de sonda, los embriones se incuban con anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina. Mediante el empleo de un sustrato cromogénico para la fosfatasa alcalina, la expresión de genes específicos puede ser evaluada. Dependiendo del nivel de la expresión génica todo el procedimiento puede ser completado dentro de 2-3 días.

Introducción

El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo animal de gran alcance para el estudio de desarrollo de los vertebrados, la enfermedad, el comportamiento, y en la detección de drogas 1-3. Embriones de pez cebra se pueden obtener en grandes cantidades a partir de un solo cruce. La fertilización y el desarrollo se produce fuera del útero y los embriones ópticamente transparentes se desarrollan rápidamente. Eventos de desarrollo críticos se producen durante las primeras 48 horas después de la fecundación (HPF). Esto incluye la aparición de primordios de órganos y la iniciación de citodiferenciación. Desmontables o sobre-expresión de proteínas se puede lograr a través de la microinyección de embriones con antisentido morfolino (MO) oligonucleótidos o ARNm, respectivamente, a la una o dos etapas de células (0,75 HPF).

El deseo de los embriones de pez cebra facilita el estudio de la expresión espacio-temporal de los genes de interés. Aplicación de la técnica DESEO después de la microinyección de embriones con ARNm o MO a la sobre-exprESS o los niveles de proteína específicos desmontables revela regulación diferencial de otros genes.

Los cambios en los patrones de expresión de genes pueden ser correlacionados con los cambios fenotípicos y revelan la función de los genes diana durante la embriogénesis temprana. Dado que las sondas pueden prepararse y almacenarse de antemano, la técnica ISH se puede aplicar para revelar los patrones de expresión de genes por lo menos 20 genes a la vez el uso de placas de seis pocillos y las cestas hechas a medida.

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Protocolo

1. Todo el montaje hibridación in situ de embriones de pez cebra

1.1 Preparación de embriones

  1. Recoger los embriones en las etapas de desarrollo requeridos. Por favor, vea. Kimmel et al 5 para la descripción fase embrionaria.
  2. Retire chorions manualmente utilizando fórceps (pinzas de relojero Dumont no. 5).
  3. Fijar embriones en una solución al 4% de paraformaldehído (PFA), preparada en PBS (tampón fosfato salino) durante la noche a 4 ° C.
  4. Lavar embriones con PBS, al menos 3 veces durante 5 min cada uno a temperatura ambiente.
  5. Embriones en tienda a 100% de metanol (MeOH) a -20 º C hasta su uso para la futura aplicación de técnicas que incluyen todo el montaje hibridación in situ.
  6. Freeze en escena embriones en nitrógeno líquido para la extracción de RNA y se almacenan a -80 ° C.
  7. Extraer el ARN a partir de embriones por etapas y sintetizar cDNA de amplificación por PCR y posterior clonación.

1.2 Síntesis de sondas de ARN marcadas con digoxigenina

  1. Amplificación por PCR y la clonación de genes para la plantilla de la sonda. Configuración de reacción de PCR con un volumen total de 50 l tal como se muestra en la Tabla 1. Usar más ADN genómico o ADNc menos en la reacción de PCR como plantilla. Incluir 10 min de tiempo de extensión a 72 ° C después del último ciclo para asegurarse de que los productos de reacción de PCR son de longitud completa y 3 'adenylated con el fin de facilitar la clonación TOPO.
Reactivo Volumen
Plantilla de ADN 100 ng
Tampón de PCR (10x) 5 l
dNTPs (10 mM) 2 l
Los cebadores (10 mM) 1 M cada uno
Añadir agua hasta un volumen final de 49,7 l
Taq polimerasa (5 unidad / & #956; l) 0,3 l
Volumen de reacción 50 l

Tabla 1. Reacción de amplificación por PCR.

  1. Verificar el tamaño del producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. El tamaño estimado del producto de PCR para la síntesis de la sonda es cerca de 1 kb.
  2. Tenga especial cuidado para evitar la contaminación con nucleasa llevando a cabo el experimento en condiciones estériles y el uso de agua libre de nucleasa. En el caso de que se observan productos múltiples, gel de-purificar el producto de PCR de tamaño apropiado antes de proceder con la clonación usando el kit de clonación TOPO TA. Optimización de la reacción de PCR para eliminar la aparición de manchas y múltiples bandas.
  3. Realizar la reacción de clonación TOPO como se indica en la Tabla 2. Combinar TOPO vector y del producto de PCR y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min.
Reactivo Las células químicamente competentes Las células competentes Electro Producto de la reacción de PCR fresco 1-4 l 1-4 l Solución Salina 1 l Solución salina diluida 1 l Agua Hasta un total de volumen de 5 l Hasta un total de volumen de 5 l TOPO vector 1 l 1 l Volumen final 6 l 6 l

Reacción de clonación TOPO Tabla 2..

  1. Incorporar / introducir el producto de clonación TOPO en una células competentes tiro. Tsu proceso se denomina transformación.
  2. Se incuban las células transformadas a 37 ° C durante al menos 1 hora a 260 rpm para asegurar la expresión de los genes de resistencia a antibióticos. Placa de la mezcla de transformación (50-100 l) en precalentado Luria Bertani (LB) placas de agar que contienen 50 mg / ml de ampicilina y X-gal. Incubar a 37 ° C durante la noche.
  3. Determinar la presencia de la inserción sobre la base de la apariencia de las colonias azules claros o blancos. El vector TOPO contiene gen lacZ que codifica β-galactosidasa. En presencia de X-gal, la producción de β-galactosidasa forma de color azul. ADN se ligó en el plásmido interrumpe la formación de β-galactosidasa y blanco colonias funcionales se producen. Las colonias blancas o colonias de color azul claro confirman la presencia de la inserción.
  4. Elige las colonias de color blanco de la placa de agar utilizando puntas de pipeta estériles y colocarlos en el tubo estéril de 10 ml que contenía 4 ml de medio LB y de cultivo a 37 ° C en la incubadora agitandoTor durante la noche a 200 rpm.
  5. Purificar el ADN plasmídico usando el kit de ADN plásmido de acuerdo con la instrucciones del fabricante.
  6. Alineado de ADNc después de la purificación del plásmido por digestión de 5 g de ADNc para cada sonda con la enzima de restricción apropiada que tiene un sitio único situado 3 '(para las sondas de sentido) o 5' (para las sondas antisentido) para el inserto.
  7. Se purifica el ADN linealizado utilizando el método de extracción con fenol / cloroformo. Añadir un volumen igual de giro fenol / cloroformo, vértice vigorosamente durante 30 segundos, durante 3 minutos a 13.000 rpm a 4 ° C. Transferir la fase acuosa superior en el tubo limpio y añadir un volumen igual de cloroformo. Haga girar durante 3 minutos a 13.000 rpm a 4 ° C. Transferir la fase acuosa superior en el tubo limpio. Añadir acetato de sodio 10% (3 M) y el volumen de 2,5 veces de etanol al 100% para precipitar el ADN y se almacena a -20 ° C durante toda la noche. Haga girar durante 15 minutos a 13.000 rpm a 4 ° C. Eliminar el etanol y lavar el precipitado con etanol al 75%. El protocolo se puede detener y el ADN se puede STORED a -20 ° C y se reanuda al día siguiente. Haga girar durante 10 minutos a 10.000 rpm a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente y secar el precipitado durante 2 min a temperatura ambiente. Resuspender el precipitado en 10 l de agua tratada con DEPC y se incuba a 55 ° C durante 20 min. Cuantificar la concentración de ADN utilizando el espectrofotómetro de UV.
  8. Evaluación de la pureza por electroforesis en gel de agarosa usando 1 l de ADN en gel de agarosa al 1% y funcionando durante aproximadamente 30 min.
  9. Configurar reacción de marcaje de ARN. El uso de un vial de reacción libre de RNasa, añadir 1-5 g de ADN de plantilla purificada estéril a, libre de RNasa, agua destilada tratada con DEPC, doble a un volumen de 13 l. Enfríe el vial de reacción en hielo y añadir los siguientes reactivos (véase la Tabla 3):
Reactivo Volumen
NTP mezcla de marcaje (10x) 2 l
Buff Transcripcióner (10x) 2 l
Protector de inhibidor de RNasa 1 l
ARN polimerasa SP6 o
ARN polimerasa T7 2 l
Volumen final 20 l

Tabla 3. Reacción de marcaje de ARN.

  1. Mezclar suavemente el reactivo a continuación, recoger en la parte inferior mediante una breve centrifugación a 2000 rpm durante 30 segundos a temperatura ambiente y se incuba la mezcla de reacción durante 2 horas a 37 ° C.
  2. Retirar la plantilla de ADN mediante la adición de 2 l de RNasa libre de DNasa I. Se incuba durante 30 min a 37 ° C y detener la reacción mediante la adición de 2 l de EDTA 0,2 M (pH 8,0).
  3. Precipitar los productos de reacción mediante la adición de 2,5 l de LiCl 4 M y 75 l de etanol 100%. Mezclar la solución y mantener a -20 ° C durante 45 minutos or se almacenó a -20 ° C durante la noche y el protocolo reanudó al día siguiente.
  4. Se centrifuga la suspensión durante 30 minutos a 13.000 rpm a 4 ° C, a continuación, lavar el precipitado con 500 l de etanol al 70% se almacenó a -20 ° C, se centrifuga durante 10 min adicionales, seco durante 2 minutos, y volver a suspender en 50 l y se incuba a 30 min a 37 ° C.
  5. Verificar la calidad y la integridad de la sonda mediante la ejecución de 1-2 ml en gel de agarosa al 1% durante aproximadamente 30 min. Esto se confirma por la presencia de un solo producto se ejecuta en el tamaño esperado en el gel.
  6. Cuantificar la concentración de la sonda mediante la medición de la cantidad de ARN utilizando espectrofotómetro. El rendimiento de esta reacción es de aproximadamente 10 g de ARN (100-200 ng / l).

1.3 Todo el montaje hibridación in situ

  1. DÍA 1
    1. Rehidratación
      1. Preparar cestas utilizando tubos Eppendorf de malla de nylon (menos de 1 mm de tamaño de poro) y. Construir las cestas por cutting tubos Eppendorf (1,5 ml) para eliminar los extremos cónicos. Identificar canastas individuales utilizan diferentes tubos de colores y quitar la parte superior bordes de la mitad de ellos.
      2. Cortar pequeños trozos de malla de nylon para cubrir los extremos cortados de los tubos Eppendorf. Pegue los extremos cortados de los tubos a la malla de nylon por calentamiento en una placa caliente eléctrica (situada entre medio y alto) en una campana de humos. Una vez enfriado eliminar el exceso de malla de nylon de las cestas y almacenarlos en 100% de metanol a temperatura ambiente.
      3. Preparar diluciones sucesivas de metanol en PBS (75% [vol / vol [metanol, 50% [vol / vol] de metanol y 25% [vol / vol] de metanol) usando los tres primeros pocillos de las placas de seis pocillos seguido de 100% PBST (tampón fosfato salino que contenía 0,1% de Tween-20) en los próximos tres pozos.
      4. A reserva de embriones in situ el procedimiento de hibridación con las cestas a medida que se muestran en Figurea 1a y b. Utilice soluciones de RNasa libre hasta la hibridaciónpaso ción en placas de 6 pocillos (4 ml / pocillo). Para ello, colocar hasta 6 canastas en el primer pozo. Lugar cesta con reborde primero seguido de canastas sin bordes en diferentes colores dispuestos consecutivamente. Usando esta disposición hasta 6 patrones de expresión génica se puede determinar simultáneamente.
      5. Coloque embriones deshidratados de la misma etapa de desarrollo a la misma cesta (véase la Figura 1).
      6. Rehidrate embriones moviendo cestas de un pocillo en la placa de seis pocillos a la siguiente (5 minutos para cada paso). Usar seis pozos llenos de tampón apropiado. Los embriones se someten a cada dilución de una vez. De esta manera, los embriones se lavan 6 veces, 5 minutos / lavado. La rehidratación de los embriones deshidratados se logra mediante la sustitución de metanol con PBS y luego por lavado 3 veces con 100% PBST.
    2. Resumen permeabilización los embriones rehidratadas con proteinasa K (10 mg / ml) a temperatura ambiente para hacerlas permeables como se muestra en la Tabla 4 .
      Etapa embrionaria (horas después de la fertilización) Período de digestión (proteinasa K)
      Hasta 6 15 seg
      6-12 30 seg
      12-18 3 min
      24 12-15 min
      48 25-30 min
      72 40 min
      96-120 50 min

      Tabla 4. Reacción permeabilización.

    3. Postfixation PBST y lavados
      1. Fijar mediante la incubación de embriones en paraformaldehído al 4% (peso / volumen) en 1x PBS durante 20 min.
      2. Retire paraformaldehído residual lavando embriones 3x, 5 min / lavado, en PBST 1x.
    4. La acetilación Prepare la mezcla de acetilación (125 l de trietanolamina y 27 l de anhídrido acético en 10 ml de ddH 2 O) y los embriones se incuban dos veces durante 10 minutos cada uno. Para minimizar la actividad fosfatasa endógena, preparar la mezcla de acetilación fresco cuando sea necesario. Para eliminar el exceso de reactivos, lavar los embriones dos veces en PBST (10 min / lavado)
    5. La prehibridación Prehybridize embriones mediante la transferencia de embriones a partir de cestas a tubos Eppendorf estériles de 1,5 ml e incubando con 200 l de mezcla de hibridación 2-4 horas en un ° C baño de agua 70.
    6. Preadsorción del anticuerpo eliminar aproximadamente 50 embriones de las cestas y transferirlos a un tubos de 1,5 ml Eppendorf estériles. Se incuba con anti-DIG-AP (1:500) anticuerpo utilizando tampón de bloqueo (1x PBST, 2% de suero de ternera [vol / vol], 2 Suero Bovino mg / ml de albúmina [BSA]) a temperatura ambiente durante 2-4 horas, y almacenar a 4 ° C durante la noche. Sacar de la incubadora de la mañana und permiten embriones estén a temperatura ambiente.
    7. La hibridación Añadir 100-200 ng de sonda para los embriones prehibridados y se incuba durante la noche a 70 ° C en baño de agua.
  2. DÍA 2
    1. SSC (citrato salino-sódico) Lava
      1. Coloque los tubos de 50 ml de la mezcla de hibridación (HM), 2x SSC y 0,2 x SSC en un vaso de precipitados con agua en un ° C baño de agua 70 y precalentar ellos durante al menos 20 min. Retirar la mezcla de reacción de hibridación que contiene la sonda, añadir 1 ml de mezcla de hibridación precalentada a los tubos y se incuba durante 15 min a 70 ° C. Llenar placas de seis pocillos con diversas diluciones de HM precalentado en 2x SSC mediante la sustitución de 100% HM a través de 50% a 25% HM para eliminar el exceso de reactivos.
      2. Mientras espera, llene placas de seis pocillos con 2x SSC para el lavado y mantenerlos a 70 ° C.
      3. Después de 15 min lugar los embriones del tubo a las cestas mantienen en la placa de seis pocillos lleno de la dilucións de HM con 2x SSC y lavar los embriones híbridas moviendo la canasta de un pozo a otro (15 min cada uno en un baño de agua a 70 ° C). Lave embriones 2x, 15 min / lavado, en el 100% 2x SSC a 70 ° C.
      4. Establecer otro baño de agua a 65 ° C. Rellene seis platos así con 0,2 x SSC de alta rigurosidad se lava para evitar la hibridación no específica de la transcripción con la sonda.
      5. Después de que los embriones se lavan dos veces con 2 x SSC a 70 ° C, siga otros dos lavados de 30 min en 0,2 x SSC a 65 ° C.
    2. Los lavados con PBST Preparar placas de seis pocillos con diluciones sucesivas de 0,2 x SSC en PBST de la siguiente manera: 75% (vol / vol) de 0,2 x SSC, 50% (vol / vol) de 0,2 x SSC, 25% (vol / vol) 0,2 x SSC, y los restantes dos pozos con 100% PBST. Lavar los embriones hibridadas moviendo la cesta de un pozo a la siguiente (5 minutos para cada paso a temperatura ambiente usando un eje de balancín).
    3. Embriones preincubar preincubación durante 3-4 horas a temperatura ambiente en blocking tampón (1x PBST, 2% de suero de ternera [vol / vol], 2 mg / ml de BSA).
    4. La incubación con anti-DIG anticuerpos embriones Incubar con una solución de anticuerpo anti-DIG-AP (1:5.000) en tampón de bloqueo durante la noche a 4 ° C con agitación suave.
  3. DÍA 3
    1. Lava PBST Preparar las placas de seis pocillos con 4 ml / pocillo PBST. Lave embriones incubados moviendo las canastas en la placa de seis pocillos PBST que contiene 6x por períodos de 15 min. Los embriones se pueden almacenar a 4 ° C y el protocolo reanudaron el día siguiente.
    2. Pretinción Prestain los embriones por lavado 2x durante 15 minutos con pretinción tampón a temperatura ambiente con agitación suave antes de la incubación en presencia de BCIP (fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo) y NBT (nitroazul de tetrazolio). BCIP y NBT son los sustratos utilizados para el desarrollo de color de la actividad de la fosfatasa alcalina. Dado que las sondas están unidas con th fosfatasa alcalinael desarrollo de color de púrpura e indica la expresión del gen diana. Los embriones se pueden almacenar a 4 ° C y el protocolo reanudaron el día siguiente.
    3. Coloración
      1. Incubar los embriones a temperatura ambiente en la oscuridad con BCIP y NBT durante 30 min.
      2. Monitorear la reacción de tinción cada 30 min utilizando un estereomicroscopio. Los tiempos de reacción varían de 15 minutos-16 horas, dependiendo del nivel de la expresión génica. Los tiempos de reacción son más cortos para los genes altamente expresados ​​y más larga para los genes expresados ​​débilmente. Sondas de detección detectará las señales de si el gen de interés expresa antisentido complementario (AS) transcripciones.
    4. Se alcanza Detención de la Reacción Después de la intensidad de la tinción deseada, detener la reacción mediante la transferencia de cestas que contienen los embriones a los pocillos que contienen la solución de parada (1x PBS, pH 5,5, 1 mM de EDTA, 0,1% de Tween). Esto evitará un mayor desarrollo del color. Enjuague los embriones durante 10 minutos 2 veces en una mecedora con un suave aglitación a temperatura ambiente.
    5. Postfixation
      1. Incubar los embriones en paraformaldehído al 4% (p / v) en PBS durante 20 min.
      2. Lavar los embriones (5 min / lavado) tres veces con PBST con el fin de eliminar el paraformaldehído residual. Guarde los embriones fijos en la solución de parada en la oscuridad a 4 ° C.
    6. Montaje, Observación y adquisición de imágenes
      1. La transferencia de los embriones a una placa de seis pocillos que contiene 100% de glicerol con el posible volumen mínimo de PBS. Coloque la placa de seis pocillos en un agitador y agitar suavemente durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad.
      2. Coloque embriones en 100% de glicerol y luego observar la señal bajo un estereomicroscopio.
      3. Adquirir imágenes y guardarlo en formato Tiff o cualquier otro tipo que permite la producción de imágenes de alta calidad mediante el uso de software de imágenes como Photoshop (figuras 3-6).

2. Double I n hibridación in situ

  1. Para alcanzar el doble etiquetado el método descrito anteriormente a partir de 1,1 - 1.3.1.7 se utiliza, sino que incluye la incubación simultánea de ambos digoxigenina y fluoresceína sondas marcadas durante la hibridación.
  2. Siga el mismo procedimiento para el post hibridación se lava saber SSC y lavado PBST (pasos 1.3.2.1 y 1.3.2.2) e incubaciones de bloqueo (paso 1.3.2.3). Realizar reacciones de anticuerpos y la tinción de forma secuencial tal como se describe a continuación.
  3. Incubar los embriones con el anticuerpo acoplado a AP-anti-digoxigenina (1:5.000) a 4 ° C con agitación suave.
  4. Lavar e incubar con BCIP-NBT (pasos 1.3.3.1 - 1.3.3.6).
  5. Después de la detección, lavar los embriones dos veces con PBST a temperatura ambiente durante 20 min.
  6. Incubar los embriones a 65 º C en PBST con 1 mM de EDTA durante 30 minutos para inactivar el anticuerpo anti-digoxigenina.
  7. Incubar los embriones en 100% de metanol seguido de rehidratación en 75%, 50%, y 25% metanol ingenioh PBST y de nuevo a PBST durante 1 hora.
  8. Incubar los embriones durante la noche con la AP-acoplado a fluoresceína (1:2000) en tampón de bloqueo a 4 º C con agitación suave.
  9. Lavar embriones con PBST (etapa 1.3.3.1) y embriones de pre-tinción de 2 veces durante 15 minutos con tampón de pre-tinción (0,1 M Tris-HCl, pH 8,2) a temperatura ambiente con agitación suave antes de la incubación en presencia de rojo rápido . Protocolo puede ser detenido y los embriones se puede almacenar a 4 ° C con agitación suave y se reanuda el día siguiente.
  10. Se disuelve una tableta Fast Red en 2 ml de tampón de tinción inmediatamente antes de su uso.
  11. Iniciar la reacción de tinción mediante la colocación de los embriones en el tampón de tinción con reactivo Fast Red.
  12. Detener la reacción de tinción cuando se alcanza la intensidad de la tinción deseada. Se puede tomar desde unas pocas horas a temperatura ambiente para uno o dos días durante la noche cuando la tinción a 4 ° C. Detenga la reacción inmediatamente si la intensidad de la tinción no se desarrolla más o comienza a mostrar no específicadad en comparación con el control de los sentidos.
  13. Siga los procedimientos descritos anteriormente para el resto de los pasos a saber, la fijación de correos, de montaje, de observación y captación de imágenes (steps1.3.3.5 y 1.3.3.6).

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Resultados

Utilizando el protocolo con 50 embriones por canasta (por gen / por condición experimental) el patrón de expresión de ese gen se puede lograr en un solo experimento. Casi todos los embriones muestran patrones similares de expresión para un gen particular. Los ejemplos representativos de la tinción en hibridación in situ se muestran en las Figuras 3-6.

Tanto el sentido y anti-sentido ribosondas se sintetizan a partir de los ADNc correspondientes a PC5.1 PC5....

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Discusión

Hemos desarrollado métodos mejorados para visualizar ARN con alta resolución. La hibridación in situ en los procedimientos se llevan a cabo utilizando simples cestos hechos a medida con fondos porosos (Figura 1). Los embriones se procesaron utilizando soluciones libres de RNasa en placas de 6 pocillos a temperatura ambiente en condiciones estériles.

Para segregar embriones cestas están hechas de diferentes tubos Eppendorf de colores. Cestas con o sin un borde se uti...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Taq PolymeraseInvitrogen10342053
TopoTA - Promotor Dual pCRII-TOPOInvitrogenK4650-01
HQ Mini Kit de Purificación de PásmidosInvitrogenK2100-01
AgaroseRoche11 685 660 001
Not1 y HindIII Enzimas de restricciónInvitrogen15441-025, 15207-012
Tampón Fenol saturado,Invitrogen15513039almacenar a 4 °C. Irritante de ojos, piel y vías respiratorias y presunto carcinógeno. Se debe tener cuidado al manipularlo.
CloroformoFisherC607-1Tóxico y sospechoso de ser cancerígeno. Trabaje debajo de la campana extractora.
ADNasa libre de RNasa IRoche 4716728001Prepare pequeñas alícuotas y almacene a -20 ° C.
Mezcla de marcaje DIG-RNA con ARN polimerasa Sp6, T7 y T3Roche11277073910
Inhibidor de la ARNasaRoche10777-019
3.0 M Acetato de sodio (pH 5.5)Fisher50-751-7355
100% etanolAlcoholes comerciales Dietil
pirocarbonato (DEPC)Sigma40718-25MLEl DEPC es un irritante para los ojos, la piel y las vías respiratorias. Evite el contacto con la piel y los ojos. Use gafas de seguridad, guantes y mascarilla.
NaOHFisherSS255-1
EDTA 0.5 M (pH 8.0)Fisher50-751-7404
Sistemas de acuariosinstantáneos de sal oceánicaN/A
solución salina tamponada con fosfato (PBS)FisherFL-03-0900
Paraformaldehído (PFA)SigmaP6148-1KGPrepare y almacene a -20 ° C. C como alícuotas de 40 ml para su uso posterior. El PFA es tóxico. Use gafas de seguridad, guantes y mascarilla contra el polvo.
Feniltiocarbomide (PTC)SigmaP7629-25GPTC es altamente tóxico. Use gafas de seguridad, guantes y mascarilla contra el polvo.
MetanolFisherA947-4
Dumont (Relojero' s) Patrón de pinzas n.º 5Fine Science Tools
Cluster de cultivo celular de seis pocillosSarstedt83.1839
Las cestas están hechas de malla de nailon y tubos Eppendorf PreparaciónPara hacer las cestas, corte tubos Eppendorf (1,5 ml) con o sin bordes para quitar el extremo cónico. Corte la malla de nailon en pedazos pequeños correspondientes al tamaño de  los extremos cortados de los tubos Eppendorf. Coloque los tubos con la malla de nailon que cubre el extremo cortado en un ... placa caliente hasta que tanto el tubo como la malla de nylon se peguen (llevar en campana de gases). Corta el exceso de malla de las cestas y guárdalas en metanol 100% hasta que se utilicen.
Polioxietilenosmonolaurato orbital (Tween 20)SigmaP1379-500ML
Proteinasa KFermentasEO0491
Anhídrido AcéticoSigma242845
TrietanolaminaSigma90279-100ML
Formamida, grado de alta purezaSigmaF9037
AG501-X8 ResinaBio Rad142-6424
Ácido cítrico monohidratoSigmaC0706-500G
Heparina Sal de SodioSigmaH3393-25KU
Tampón de citrato salino-sódico (SSC)SigmaS6639
ARNt de levadura de panadería tipo XSigmaR5636-1ML
NaClFisherS640-500
Tris-HClFisherBP153-1
MgCl2FisherS25403
Clorhidrato de levamisolSigma31742
N,N-Dimetilformamida
anhidro (DMF)		Sigma227056Irritante, tóxico, combustible y sospecha de teratógeno. Manéjelo con ropa de seguridad adecuada, incluidos guantes y gafas.
5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP)SigmaN6639Proteja esta solución de la luz.
Nitroblue tetrazolio (NBT)Sigma840WProtege esta solución de la luz.
Albúmina de suero bovino, fracción V purificada (BSA)SigmaA8806
Ovejas Anti-digoxigenina-AP Fab Fragmentos Roche1093274910
GlicerolSigmaG5516-500ML
Placas de cultivo celular de 96 pocillosSarstedt83.1835
Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2ZIRCTg(mnx1:GFP)ml2
Sistemas deacuarios/A
Kit de clonación ultrapuro interna Instant Ocean N

Referencias

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