Una Metodología Descelularización para la Producción de una matriz Intestinal Natural acelular

Resumen

El artículo describe una metodología para la producción de una matriz acelular de intestino de rata. La derivación de los andamios intestinal es importante para futuras aplicaciones en la ingeniería de tejidos, biología de células madre y las pruebas de drogas.

Resumen

El éxito de la ingeniería de tejidos implica la combinación de los andamios con las células adecuadas in vitro o in vivo. Los andamios pueden ser sintéticos, de origen natural o derivados de tejidos / órganos. Este último se obtienen usando una técnica llamada descelularización. Descelularización puede implicar una combinación de física, química, y métodos enzimáticos. El objetivo de esta técnica es eliminar todos los restos celulares mientras se mantiene la arquitectura micro-macro y del tejido original.

Ingeniería de tejidos intestinales ha utilizado hasta ahora andamios relativamente simples que no replican la compleja arquitectura del órgano nativo. El objetivo de este trabajo es describir una técnica eficiente para descelularización rata intestino delgado. El aislamiento del intestino delgado a fin de garantizar el mantenimiento de una conexión vascular se describe. La combinación de soluciones químicas y enzimáticas para eliminar las células nocst preservar el eje cripta de vellosidades en la cara luminal del andamio se establece también. Finalmente, se discute la evaluación de los andamios fabricados para las características apropiadas.

Introducción

La ingeniería de tejidos (TE) es una alternativa terapéutica para el transplante de órganos, pasando por alto los problemas de inmunosupresión y la escasez de órganos. TE ha tenido recientemente aplicaciones exitosas en la clínica, con el reemplazo de órganos como la vejiga ^{1, 2} uretra y la tráquea, tanto en los adultos y los niños ^{3,4 5.}

La construcción de un órgano por ingeniería de tejidos requiere la combinación de un andamio con las células apropiadas. Un andamio se puede preparar usando de origen natural (por ejemplo, colágeno) y (por ejemplo, ácido poli-L-glicólico; PLGA) sintético materiales, o ser obtenida por el descelularización de órganos y tejidos nativos. Los andamios que se han utilizado hasta ahora para TE intestinal han sido principalmente ya sea descelularizado (submucosa del intestino delgado) o sintético (ácido poli-L-glicólico y ácido poli-láctico) ^6-13. Estos biomateriales son muy simples, tanto en la arquitectura micro-macro y, quepuede no ser ideal si el intestino por ingeniería de tejidos ha de traducirse clínicamente. Un biomaterial óptima para el intestino debe tener un árbol vascular innata que puede ser conectado al suministro de la sangre del huésped, una pared tubular niveles con diferentes propiedades para reflejar las capas de la pared intestinal y un eje-vellosidades cripta en el lado luminal para ayudar con repoblación por las células madre epiteliales.

Descelularización es una metodología novedosa que produce andamios mediante la eliminación de las células de órganos enteros, mientras que el mantenimiento de su arquitectura original ^14. Esto es preferible a las ya existentes andamios, ya que no sólo replicar la estructura del órgano, pero también contienen señales químicas integradas dentro de la matriz extracelular (ECM) que ayuda la proliferación y diferenciación celular. En 2008 una tráquea de cadáver fue descelularizados ^14, se siembra con las propias células del paciente, y se trasplanta a reemplazar el bronquio principal izquierdo en un joven ^{3. Desde entonces, un número de grupos han informado de la producción de andamios descelularizados para el corazón 15, el hígado 16,17, y de pulmón 18-20 en animales pequeños y grandes.}

También hemos adaptado la misma metodología para producir un pequeño andamio descelularizado intestinal ^21. El objetivo del método descrito en el presente documento es para producir matrices intestinales descelularizados que mantienen las características macroscópicas del tejido original tales como el suministro de sangre, así como la arquitectura microscópica del eje cripta-vellosidad en el lumen intestinal. Creemos que esta metodología en última instancia, podría ser adoptada para otros órganos para mejorar la eficiencia de descelularización.

Protocolo

1. Aislamiento de rata Intestino

1. Preparar una solución de 1 L de tampón fosfato salino (Sigma, Reino Unido) con 1% de antibiótico / antimicótico (Sigma, Reino Unido) (PBS / AA). Montar la bomba peristáltica (Masterflex L / S de velocidad variable) con dos tubos. Ejecutar etanol al 70% (EtOH) a través de los tubos de la bomba peristáltica durante 15 min a la velocidad máxima, seguido de PBS / AA durante otros 15 min.
2. La eutanasia a ratas adultas Sprague-Dawley con un peso de aproximadamente 250 a 350 g por inhalación de _CO2 y dislocación cervical de acuerdo con las directrices locales de animales y aprobaciones (en el Reino Unido, las directrices del Ministerio del Interior en virtud de los Animales (Procedimientos Científicos) de la Ley de 1986).
3. Autoclave los instrumentos quirúrgicos antes de su uso. Rocíe y limpie el abdomen del animal, utilizando 70% de EtOH.
4. Realice una incisión de laparotomía-xifo púbico en el abdomen para asegurar un campo quirúrgico claro.
5. Eviscerar el intestino delgado en el lado derecho del animal sobre una toalla de papel rociado con 70% de EtOH. Take cuidado para humedecer continuamente el intestino con PBS / AA con el fin de evitar la deshidratación del tejido y la desnaturalización de la matriz extracelular (ECM).
6. Localice la arteria mesentérica superior (AMS) que surjan en un ángulo de 90 ° desde la aorta hacia el intestino. Utilice un G cánula 27 para entrar en el SMA de la aorta y rápidamente retirar la aguja para evitar que se rompa la pared del vaso. Avanzar el tubo de plástico de la cánula en la SMA y asegurar el uso de suturas (Vicryl 5/0).
7. Confirmar la canulación mediante la inyección de 1 ml de PBS / AA. Utilice tijeras de primavera para incidir la aorta proximal y distal a la SMA a fin de liberar la cánula.
8. Para evitar la fuga de heces cuando la disección de la intestino grueso, colocar uno (seda 5/0) nudo de sutura en el extremo proximal de la unión ileocecal y uno en el extremo distal del colon sigmoide. A continuación, cortar el íleon terminal y del colon entre los dos nudos y quitar el intestino grueso.
9. Cortar el intestino en el yeyuno-duodenal cruce unnd liberar al intestino de cualquier conexión del tejido conectivo que puede tener con el abdomen.
10. Transferir el intestino delgado en una placa de Petri con PBS / AA. Canular la sección proximal del intestino con una pipeta Pasteur de plástico (LSL Artículos de laboratorio) y seguro en su lugar con puntos de sutura. Cortar la pipeta para que se ajuste el Luer-Lok de una jeringa de 60 ml (BD Plastipak). Enjuague el lumen intestinal 2x con 60 ml de PBS / AA para eliminar las heces y desechos.

2. Metodología Descelularización

1. Conectar la cánula vascular para una llave de paso de tres vías. Esto facilitará la manipulación, reducir al mínimo la tensión en el árbol vascular y permitir la eliminación de las burbujas de la tubería.
2. Empieza a correr el agua desionizada (resistividad 18,2 MΩ / cm) a través de la bomba de rodillos de velocidad variable Masterflex L / S a 0,6 ml / hr. Asegúrese de que no hay burbujas en la tubería antes de conectar con la llave de paso de la luz intestinal. Algunas burbujas pueden estar presentes dentro de la luz de la etapa1.9, lo que puede poner en peligro el proceso de descelularización. Variar la velocidad de la bomba y manejar el tejido con unas pinzas cuidadosamente para asegurar la salida de burbujas desde el extremo distal. No conecte la cánula vascular hasta que finalice este proceso ya que las altas velocidades pueden dañar el árbol vascular.
3. Transferencia aparato a la sala fría, puesto que el siguiente paso de descelularización se realiza a 4 ° C. La baja temperatura permite la eliminación de las células, reduciendo al mínimo la descomposición del tejido. Coloque la placa de Petri en un contenedor que recogerá la solución desborda. Perfundir tanto el lumen intestinal y el árbol vascular con agua desionizada (resistividad de 18,2 MΩ / cm) durante 24 horas a 0,6 ml / h. Durante la primera hora compruebe el aparato con regularidad para asegurarse de que todas las conexiones son seguras, la fuga es mínimo y no hay burbujas están presentes en el intestino.
4. Después de 24 horas de tratamiento con agua desionizada, mueva el aparato descelularización fuera de la sala fría como el resto de los pasos sonllevado a cabo de la temperatura ambiente (TA).
5. Pesar desoxicolato de sodio (Sigma, Reino Unido) para preparar 300 ml de una solución al 4% en agua desionizada. Pesar desoxicolato de sodio bajo una campana de aspiración, ya que es un irritante oral y ocular. Mezclar utilizando un vórtice hasta que la solución es clara. La solución puede mantenerse a 4 ° C durante hasta 1 mes.
6. Cambie la solución desionizada para desoxicolato de sodio, compruebe las conexiones, eliminar las burbujas y perfundir a 0,6 ml / hora durante 4 horas.
7. Después de la etapa de lavado desoxicolato de sodio con PBS / AA para 30 min para evitar la interacción entre el desoxicolato de sodio y DNasa-I.
8. Pesar desoxirribonucleasa I (ADNasa-I, Sigma) y preparar 250 ml de una solución 2,000 kU en cloruro de sodio 1 M, pH 7,4. Mezclar utilizando un vórtice hasta que la solución es clara. Esta solución debe prepararse inmediatamente antes de su uso y no se puede almacenar.
9. Perfundir con DNasa-I durante 3 horas a temperatura ambiente a una velocidad de 0,6 ml / h.
10. Después de la etapa de DNasa-I, transferir elandamio en una campana de cultivo de tejido y cambiar placas e instrumentos. Se sugiere utilizar una técnica aséptica.
11. Lavar con PBS / AA durante 30 minutos para asegurarse de que se eliminan todos los restos de las soluciones Descelularización. Coloque el andamio en una nueva placa de Petri y la transferencia a un agente de reticulación UV (Spectroline, EE.UU.). Ejecutar dos ciclos de esterilización. Almacenar en 5% PBS / AA y cambiar la solución cada 3 días.

Resultados

Al descelularización éxito (Figura 1), el andamio debe tener una apariencia macroscópica similar a la del intestino nativa, pero con paredes translúcidas (Figura 2A). La preservación de la macro-arquitectura también debe ser evidente por la permeabilidad del árbol vascular. Cuando se inyecta un colorante a través de la cánula de SMA, se debe distribuir uniformemente a lo largo del andamio y alcanzar el árbol capilar (Figura 2B). El andamio debe estar libre de material nuclear y citoplasmática, algo que puede ser evaluada usando un kit de cuantificación de ADN y el análisis histológico simple. Tinción con hematoxilina y eosina (H & E) deben demostrar la ausencia de materiales nucleares y citoplasmáticas, preservando las pequeñas capas intestinales (Figura 3A). En particular, el mantenimiento de las vellosidades y criptas en el lado luminal debe ser evidente después de microscopía electrónica de barrido (Figura 4). LaTambién se debe esperar la conservación de componentes de la matriz extracelular tales como colágeno, elastina y glicosaminoglicanos. Por ejemplo, las pantallas de tinción tricrómica de Masson intacta tejido conectivo en el andamio (Figura 3B).

Figura 1. . Plan experimental Cronología de procedimiento descelularización; PBS / AA: PBS con NaDeoxy antibiótico-antimicótico,: desoxicolato de sodio, RT: temperatura ambiente, DNasa-I: deoxyribonuclease-I. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 2. Macroscópicamente Andamiosc características. Aspecto macroscópico del intestino delgado de rata tras descelularización éxito (A). La inyección de Rosso Ponceau tinte a través del SMA demuestra una red vascular intacta (B); SMA: arteria mesentérica superior Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 3. . Histología H & E (A) y MT (B) tinción indican una ausencia de material celular con la preservación de la arquitectura del tejido conectivo, H & E: hematoxilina y eosina, MT: tricrómico de Masson. Barra de escala:. 100 m Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 4. . Microscopía electrónica de Microscopía Electrónica de barrido indica la arquitectura de vellosidad-cripta se conserva en el lumen del andamio; Barra de escala:. 100 m Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Discusión

Los pasos más difíciles en la creación de este experimento implican la canulación de la SMA y el establecimiento y mantenimiento de la esterilidad. Canulación de la SMA en roedores sin romper la pared puede ser bastante difícil debido al tamaño y posición de la embarcación. Alternativamente, una sutura puede ser colocado alrededor de la aorta proximal antes de la SMA origen, seguido de la canulación de la aorta sí mismo distalmente, la dirección de la cánula de plástico en el SMA. Durante descelularización una combinación de una mala colocación de la cánula y las altas tasas de flujo puede resultar en la pérdida del acceso vascular. La esterilidad es un problema importante debido a la cantidad de la flora bacteriana presente en el intestino delgado. Lavado con PBS / AA después de la cosecha es muy importante, y cualquier signo de la materia fecal o desechos debe ser retirado desde el lumen. La colocación de una porción del andamio en un tubo Falcon con DMEM en la incubadora después de la esterilización UV debe ser un indicador de si la esterilidad se ha logrado. En el casode la colonización bacteriana, los medios de comunicación va a cambiar el pH, con su color cambiante de rojo a amarillo. Para hacer frente a esto, más ciclos de UV se aconseja, así como el lavado con PBS que contiene una alta concentración de antibiótico / antimicótico.

Una posible modificación para obtener un andamio con acceso tanto vascular y venosa sería para canular la vena cava inferior (IVC), así como la SMA. Descelularización de los lados venosos y vasculares debe intentarse intermitentemente para todas las tres soluciones. Descelularización continua puede explotar en los capilares por tener presión positiva en ambos lados.

A través de los años ha habido un número de esfuerzos en intestinal TE utilizando diferentes combinaciones de células-andamiaje in vitro e in vivo ^6,9,12. La mayor parte del trabajo se ha realizado utilizando tubulares no tejido 95% PGA-5% de PLGA andamios recubiertos con colágeno de tipo I ^6,7,13,22. Después de la siembra con intestinalunidades epiteliales organoides (OU) y un período de implantación en el omento de ratones, que forman quistes con el músculo en el exterior y el epitelio en el interior que luego pueden ser tubulariza. Sin embargo, la porosidad y la simplicidad en el diseño de estos andamios no permite para la generación de grandes trozos de intestino artificial en un entorno in vitro, tales como la de un biorreactor. Además, la falta de una red vascular innata que se puede conectar al destinatario limita aún más el uso de este andamio para la traducción clínica. Además de los experimentos con los andamios de PGA-PLGA, otros grupos han utilizado colágeno o SIS andamios, ambos de los cuales no se replican la complejidad del tracto intestinal. SIS, en particular, es la única metodología anteriormente publicada de la ingeniería de tejidos intestinal y se ha usado en más de 150 entornos médicos, que demuestra la capacidad de los andamios descelularizados para proporcionar estabilidad mecánica y promover el crecimiento celular, mientras que el plomoING ninguna respuesta inmunogénica. Sin embargo, la falta de micro-arquitectura de macro-y apropiado, ha dado lugar a malos resultados en su "uso con fines TE intestinales ^9-11,23.

Los beneficios de la metodología descelularización hemos descritos incluyen la preservación de las características microscópicas, tales como la arquitectura de las criptas-vellosidades luminal que representan un ambiente apropiado para la repoblación por el nicho de células madre intestinales. En el aspecto macroscópico, la presencia de una red vascular jerárquico será permitir la fijación al receptor, lo que permite el suministro de nutrientes y oxígeno a todas las capas de la TE-delgado ^21. Lo que es más, el mantenimiento de componentes de ECM, tales como el colágeno, la elastina y glyocosaminoglycans tiene un papel importante no sólo para las características mecánicas, sino también dirigir la proliferación y diferenciación celular. Lo más importante, la capacidad de la metodología de descelularización a ser ampliado en grantejidos r mientras que el mantenimiento de las mismas características es una característica importante para la traducción clínica de la TE.

El desarrollo de una matriz intestinal natural con una red vascular permite la creación de segmentos más grandes de intestino artificial que puede ser conectado al host.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de etanol, 70% en H20	Sigma	02877
Comprimidos de solución salina tamponada con fosfato	Sigma	79382
Solución antibiótica antimicótica (100x)	Sigma	A5955
Desoxicolato de sodio	Sigma	D6750	Irritante oral y ocular; uso de protección
Cloruro de
Desoxirribonucleasa I de páncreas bovino	Sigma	D5025