Artículo de método

Microfabricación de los patrones de oro Nanoporous de Estudios de interacción célula-materiales

DOI:

10.3791/50678

⸱

15 de julio de 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis , 2Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of California, Davis , 3Department of Biomedical Engineering, University of California, Davis

En este artículo

Resumen

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Se presenta en las técnicas a micropatrón nanoporoso películas delgadas de oro a través de la impresión y la fotolitografía plantilla, así como los métodos a células de cultivo en los patrones de microfabricados. Además, se describen los métodos de análisis de imágenes para caracterizar la morfología de las células cultivadas utilizando electrónica de barrido y técnicas de microscopía de fluorescencia y de material.

Resumen

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Los materiales nanoestructurados con tamaños de la característica en decenas de nanómetros han mejorado el rendimiento de varias tecnologías, como las pilas de combustible, biosensores, recubrimientos de dispositivos biomédicos, y las herramientas de administración de fármacos. Oro nanoporosa (np-Au), producida por un proceso de auto-ensamblaje escala nano, es un material relativamente nuevo que presenta gran área efectiva de superficie, alta conductividad eléctrica y la actividad catalítica. Estas propiedades han hecho np-Au un material atractivo para la comunidad científica. La mayoría de los estudios sobre np-Au emplean muestras macro-escala, y se centran en la ciencia fundamental de sus aplicaciones catalíticas y el sensor de material y. Las muestras de macro escala limitan el potencial de np-Au en sistemas miniaturizados, como dispositivos biomédicos. Para hacer frente a estos problemas, que inicialmente describen dos métodos diferentes para micropatrón películas delgadas np-Au sobre sustratos rígidos. El primer método emplea máscaras plantilla manualmente producidos para la creación a escala milimétrica patrones np-Au, while el segundo método utiliza fotolitografía despegue de modelado modelo submilimétrica escala. Como las películas delgadas np-Au se obtienen por el proceso de deposición por pulverización catódica, que son compatibles con las técnicas de microfabricación convencionales, de este modo susceptibles de fácil integración en microsistemas. Estos sistemas incluyen eléctricamente-direccionables plataformas de biosensores que se benefician de área de alta superficie efectiva, conductividad eléctrica, y bioconjugación superficie-tiol-basado en el oro. Se describe el cultivo de células, inmunotinción, y las técnicas de procesamiento de imágenes para cuantificar la interacción de NP-Au con células de mamíferos, que es un parámetro de rendimiento importante para algunos biosensores. Esperamos que las técnicas ilustradas aquí ayudarán a la integración de np-Au en plataformas a diferentes escalas de longitud y en numerosas aplicaciones, como biosensores, sistemas de almacenamiento de energía, y los catalizadores.

Introducción

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Los materiales con características de nano-escala han mostrado prometedores en la mejora de varias aplicaciones, como las pilas de combustible 1, Sensores 2,3, Y dispositivos biomédicos 4,5. Un material relativamente nuevo es oro nanoporoso (NP-Au), que es producida por un proceso de auto-ensamblaje escala nano. El precursor de NP-Au es una aleación de oro que más comúnmente se compone de plata en 60% a 80% en porcentaje atómico. En pocas palabras, la nanoestructura de poro abierto característica es el resultado de la reordenación de los átomos de oro en racimos como la plata se disuelve por un ácido fuerte ( Por ejemplo, Ácido nítrico al 70%) o bajo un potencial electroquímico 6-8. Np-Au beneficios de varios atributos deseables, incluyendo el área de gran superficie efectiva, alta conductividad eléctrica, las técnicas bien establecidas funcionalización de la superficie, y la biocompatibilidad 9. A pesar de que se ha producido una rápida expansión de los estudios sobre np-Au, la mayoría de ellos se centran en las propiedades mecánicas de np-Au 10,11, La actividad catalítica 12, Y el rendimiento de detección biomolecular 13-15. Mientras que los atributos deseables son altamente útiles para varias herramientas biomédicas 16,17, Las aplicaciones en esta área han sido limitados. Una posible razón para esto es que la mayoría de los estudios han utilizado predominantemente muestras macro escala ( Por ejemplo, Hojas, láminas, y lingotes) y las técnicas para la incorporación de NP-Au en los sistemas miniaturizados han permanecido inadecuada. De hecho, hay sólo un puñado de ejemplos de la utilización de técnicas de microfabricación convencionales que emplean películas np-Au 16-20. Con el advenimiento de la tecnología de la miniaturización y la necesidad de nuevas herramientas biomédicas, se ha convertido en esencial para ser capaz de integrar nuevos materiales en los dispositivos. Esto normalmente requiere que los materiales pueden ser depositados y se modela con las técnicas convencionales de microfabricación. Además, es comúnmente necesario para evaluar la biocompatibilidad de un nuevo material rápida cuantificación de las interacciones célula-materiales. El objetivo de este trabajo es demostrar las técnicas básicas para micropatrón np-Au películas y cuantificar tanto nanoestructura y las interacciones célula-material a través de procesamiento de imagen digital.

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Protocolo

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1. Nanoporosa Fabrication Oro

  1. Sustratos limpios en solución Piranha
    1. Añadir 25 ml de peróxido de hidrógeno (30%) a 100 ml de ácido sulfúrico (96%) en una cubeta de cristalización y se calienta la mezcla a 65 ° C sobre una placa calefactora. PRECAUCIÓN: Los líquidos son sumamente corrosivo y debe manejarse con cuidado. La solución gastada no se debe almacenar en un contenedor sellado, ya que puede explotar.
    2. Place de 1 pulgada por portaobjetos de 3 pulgadas en la mezcla utilizando pinzas resistentes a los ácidos y limpiarlos durante 10 min. Utilice un barco inmunotinción porcelana para lotes pequeños de limpieza cubreobjetos. Tratar pequeñas cubreobjetos con plasma de aire a 10 W durante 30 segundos antes de la inmersión en la solución.
    3. Enjuague las muestras limpias en platos de cristalización bajo el chorro de agua desionizada (DI) durante 3 min. Muestras Blow-seca con una pistola de nitrógeno más toallas sin pelusa.
  2. Preparar la máscara de la plantilla (Método 1: Utilice esto para crear patrones a escala milimétrica)
    1. Ponche de 250 micras de espesor, hojas de elastómero de silicona con biopsia golpes y / o incisión a regiones con un bisturí sobre una superficie de plástico semi-duro. Limpiar las hojas de elastómero procesados ​​en el 70% de isopropanol y secar con pistola de nitrógeno.
    2. Coloque la hoja troquelada en una toalla sin pelusa para salas blancas y alinear los cubreobjetos pirañas limpios sobre la plantilla con la superficie de la muestra frente a la plantilla.
  3. Patrón fotoprotector despegue (Método 2: Utilice esto para crear patrones submilimétrica escala)
    1. Coloque una piraña limpiado portaobjetos en el hilado mandril y soplar las partículas con pistola de nitrógeno. Dispensar 1,5 ml de promotor de la adhesión (hexametildisilazano) sobre el portaobjetos de vidrio usando una pipeta de plástico. Extender el promotor haciendo girar la diapositiva sucesivamente a 500 rpm durante 5 segundos y 1500 rpm durante 30 seg. Hornear la diapositiva sobre una placa caliente a 115 º C durante 7 minutos y dejar que se enfríe durante 5 min.
    2. Dispensar 4 ml de resina fotosensible sobre el portaobjetos de vidrio (3 pulgadas by 1 pulgada). Corre la resina fotosensible haciendo girar la corredera con el mismo protocolo que para el promotor de adhesión. Hornee el fotoprotector en una placa caliente a 115 ° C durante 1,5 minutos y dejar enfriar durante 10 minutos.
    3. Exponga la diapositiva fotosensible recubierto con luz UV (intensidad: 22 mW / cm 2) a través de una máscara de transparencia durante 15 s. Hornear la resina fotosensible en una placa caliente a 115 ° C durante 1,5 min y esperar durante 45 min. Disolver el fotoprotector expuesto en el revelador durante al menos 3,5 minutos. Enjuague bien con agua DI. Inspeccione los patrones desarrollados bajo un microscopio óptico.
  4. Depósito metales precursores para producir películas delgadas np-Au
    1. Cargar las muestras en una máquina de pulverización catódica que puede depositar de forma independiente de oro, plata y cromo. Pulverización catódica a limpiar las muestras de 90 segundos a 50 W menos de 25 mTorr atmósfera de argón procesamiento antes de iniciar la deposición de metal.
    2. Pulverización catódica cromo durante 10 minutos a 300 W menores de 10 mTorr argón. Pulverización catódica de oro por 90 segundos a 400 W sinder 10 mTorr de argón. Co-pulverización catódica de oro y plata durante 10 minutos con la plata en 200 W y Au potencia en 100 W. Apague oro pulverización fuente de aproximadamente 10 segundos antes de apagar la fuente de plata por pulverización catódica.
  5. Obtener micropatrones metálicos precursores
    1. Sonicar muestras fotoprotector recubiertos en aproximadamente 180 ml de separador fotoprotección durante 10 ciclos de 20 seg de sonicación y 2 min de pausa entre los ciclos. Lavar las muestras con agua desionizada y secar con una pistola de nitrógeno. Inspeccione los patrones de metal bajo un microscopio.
    2. Pelar la plantilla elastómero de muestras recubiertas no fotosensible con dos pinzas para revelar el metal depositado.
  6. Dealloy metálico precursor y nanoestructura modificar mediante tratamiento térmico
    1. Llenar un vaso de precipitados de vidrio de 200 ml con 170 ml de ácido nítrico (70%) y mantener la temperatura de la solución a 55 ° C sobre una placa calefactora. ATENCIÓN: El ácido nítrico es extremadamente corrosivo y debe manejarse con equipo de protección adecuado.
    2. Tratar pequeños cubreobjetos con plasma de aire a 10 W durante 30 segundos antes de la inmersión en ácido nítrico. Place de 1 pulgada por portaobjetos de 3 pulgadas en el vaso con unas pinzas antiácido y dealloy ellos durante 15 min. Utilice un barco inmunotinción porcelana para lotes pequeños dealloying cubreobjetos.
    3. Enjuague las muestras dealloyed sucesivamente por inmersión en dos vasos llenos de agua DI fresca tres veces. Almacene las muestras en agua DI y cambie el agua con agua DI fresca todos los días durante al menos una semana. Muestras Blow-seca con una pistola de nitrógeno sobre toallas sin pelusa antes de su uso.
    4. Cargar las muestras sobre una oblea de silicio limpia en un equipo de procesamiento térmico rápido. Ajustar la temperatura a entre 200 ° C y 450 ° C y la velocidad de rampa de 10 ° C / seg. Exponer las muestras a la temperatura prescrita durante 10 min en atmósfera de nitrógeno ambiente. Deje que la cámara de frío (<100 ° C) y retire las muestras. Por otra parte, poco a poco poner las muestras en la placa calefactora para Tratamiento térmicoent.

2. Cultivo Celular

  1. Prepare np-Au muestras para cultivo celular
    1. Coloque np-Au muestras en platos de poliestireno y tratamiento con plasma de aire de 10 W durante 30 segundos y transferir las muestras a placas de cultivo tisular de 24 pocillos.
    2. Añadir 500 l medio de cultivo completo (medio Eagle modificado de Dulbecco con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina / estreptomicina) a cada pocillo. Almacenar en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta que la siembra de las células (<1 hora).
  2. Mantener, de paso, y la semilla de células
    1. Mantener las células de interés (en este caso los fibroblastos NIH 3T3-o astrocitos murinos) en matraces T75 con medios de cultivo y el paso cuando las células son un 70% confluentes.
    2. Para pases las células, eliminar los medios de comunicación desde el frasco, lavar dos veces con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), añadir 2 ml de 1x tripsina / EDTA y se incuba hasta que las celdas de desconexión (~ 5 minutos). Añadir 3 ml de medio fresco ycentrifugar a 1200 rpm durante 3 min. Aspirar el sobrenadante y se resuspende el precipitado en los medios de comunicación 2 ml.
    3. Retirar los medios gastados de los pocillos y las semillas de células en los cubreobjetos de vidrio a una densidad de 25.000 células / cm 2 con un volumen final de 1 ml. Agite la placa de cultivo de adelante-atrás y de derecha a izquierda para garantizar un recubrimiento uniforme de las células sobre las muestras. Se incuban las células hasta su análisis mientras que la inspección diaria.

3. Célula y análisis de materiales

  1. Mancha de las células para visualizar citoesqueleto y núcleos
    1. Retire los medios gastados de pocillos y lavar las células dos veces con PBS. Fijar las células en paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 min.
    2. Preparar la solución de tinción de 300 nM Alexa Fluor 488 faloidina en PBS con 1% de albúmina sérica bovina.
    3. Lavar las células dos veces con PBS, y permeabilizar en 500 l 0,1% de Triton X-100 en PBS durante 5 min.
    4. Lavar las células dos veces con PBS y transferirlos para limpiar pozos. Blot 50-200 solución de tinción l en las muestras y almacenar en oscuridad durante 20 min.
    5. Lavar las células con PBS y tinción de contraste con 3 nM de DAPI en PBS durante 5 min.
    6. Lavar las células con PBS y sumergir en agua desionizada antes de su montaje en portaobjetos de vidrio cubierta con los medios de fijación y sellado con esmalte transparente.
  2. Adquirir imágenes de np-Au muestras y cultivos celulares de np-Au superficies
    1. Superficies Image np-Au con microscopio electrónico de barrido (SEM) con 50,000 X ampliación a 10 kV de energía de electrones usando un detector de electrones secundarios.
    2. Captura de imágenes compuestas de células en diferentes puntos sobre las muestras usando un microscopio invertido de fluorescencia con un aumento de 10 veces con los cubos de filtros apropiados.
  3. Imágenes de proceso para determinar la morfología de los poros y células
    1. Abrir imágenes en ImageJ y dividido en canales individuales si es aplicable. Convertir las imágenes a 8 bits, restar el fondo, y suavizarlos por filteri medianang. Ajuste del umbral, ya sea manualmente o por una función de algoritmos de umbralización para resaltar los poros (huecos) y cuerpos celulares / núcleos.
    2. Utilice el comando cuenca para separar los poros o células fusionadas. Establezca los parámetros de análisis de partículas y ejecutar el comando para extraer el número de partículas, zona media y la cobertura ciento por partículas. Usar imágenes de células teñidas con DAPI para el recuento de células y las imágenes de células teñidas con faloidina para la cuantificación de cobertura de la célula por ciento.
    3. Modificar los archivos de macros incluidas para realizar el análisis de lotes de varias imágenes.

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Resultados

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La figura 1 resume las principales etapas del procedimiento, incluida la creación de los patrones np-Au, el cultivo de células, la cuantificación de la nanoestructura, y caracterización de morfologías celulares. La plantilla elastómero se muestra en la Figura 2a (parte superior) se utiliza para la creación de los patrones de NP-Au que se muestran en las imágenes debajo. Figura 2b es una fotografía de la embarcación porcelana para especímenes de procesamiento por lotes. ...

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Discusión

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Demostramos dos técnicas diferentes para micropatrón np-Au películas para expandir el uso de estas películas en microsistemas y los estudios biológicos. Oro-recubrimiento por pulverización catódica y la plata es un método versátil para crear patrones de NP-Au, como pulverización catódica es compatible con procesos convencionales de microfabricación y la composición de la aleación y el grosor se puede controlar fácilmente mediante la variación de las potencias pistola de pulverización individuales (para objetivos de oro ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen ningún interés financiero en conflicto.

Agradecimientos

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O. Kurtulus y D. Dimlioglu el apoyo de un laboratorio de investigación Comisiones Award Program de la Universidad de California 12-LR-237197. P. Daggumati con el apoyo de la Universidad de California Davis, las inversiones en investigación en el (RISE), Premio de Ciencias e Ingeniería. CA Chapman con el apoyo de un Departamento de Áreas de Asistencia Graduados de Educación de Beca Nacional de Necesidad. Este trabajo fue apoyado por el Programa UC Lab Comisiones de Investigación, Universidad de California en Davis RISE y UC Davis Facultad de Ingeniería de los fondos de puesta en marcha.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Blanco de oroLeskerEJTAUXX403A2 Precursor de la aleación para la producción de np-Au
Objetivo de cromoLeskerEJTCRXX353A2Capa adhesiva
Blanco de plataLeskerEJTAGXX403A2Precursor de la aleación para la producción de np-Au
Barco de porcelanaThomas Scientific8542E40Se utiliza para el procesamiento de muestras pequeñas
Ácido nítricoSigma-Aldrich43873Utilizado al 70% para la desaleación
Ácido sulfúricoJ.T Baker7664-93-9Utilizado al 96% para la limpieza de pirañas
Peróxido de hidrógenoJ.T Baker7722-84-1Utilizado al 30% para la limpieza de pirañas
Punzones de biopsiaTed Pella150xxDisponible en varios tamaños
Láminas de elastómero de siliconaRogers CorporationHT 6240Disponible en varios espesores
HexametildisilazanoSigma-Aldrich440191-100MLUtilizado como promotor de adhesión para resistencia positiva
Microposit MF CD26Shipley38490Revelador fotorresistente positivo
PRS 3000J.T BakerJT6403-5Decapante fotorresistente positivo
Cubreobjetos de vidrio circulares (12 mm)Ted Pella26023Se utiliza como sustrato para patrones metálicos y cultivos celulares
Portaobjetos de vidrio (1 x 3 pulgadas)Ted Pella26007Se utiliza como sustrato para patrones metálicos
Cinta de poliimida KaptonVWR82030-950Se utiliza para asegurar elastómeros
Máscaras de transparenciaCiudad de salida Utilizadoen fotolitografía http://www.outputcity.com/ Limpiador de
plasmaHarrick PlasmaPDC-32GSe utiliza para activar superficies de vidrio
Máquina de pulverización catódicaKurt J. LeskerLAB18Se utiliza para depositar metales

Referencias

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