Imágenes Multicolor Simultáneas de Estructuras Biológicas con Microscopía de Localización de Fotoactivación de Fluorescencia

Summary

Demostramos el uso de la microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM) para obtener imágenes simultáneas de múltiples tipos de moléculas marcadas con fluorescencia dentro de las células. Las técnicas descritas producen la localización de miles a cientos de miles de proteínas individuales marcadas con fluorescentes, con una precisión de decenas de nanómetros dentro de células individuales.

Abstract

La microscopía de superresolución basada en localización se puede aplicar para obtener un mapa espacial (imagen) de la distribución de moléculas individuales marcadas con fluorescencia dentro de una muestra con una resolución espacial de decenas de nanómetros. Utilizando proteínas fluorescentes fotoactivables (PAFP) o fotoconmutables (PSFP) fusionadas con proteínas de interés, o colorantes orgánicos conjugados con anticuerpos u otras moléculas de interés, la microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM) puede obtener imágenes simultáneas de múltiples especies de moléculas dentro de células individuales. Mediante el uso del siguiente enfoque, se obtienen imágenes de poblaciones de grandes cantidades (de miles a cientos de miles) de moléculas individuales en células individuales y se localizan con una precisión de ~10-30 nm. Los datos obtenidos se pueden aplicar para comprender las distribuciones espaciales a nanoescala de múltiples tipos de proteínas dentro de una célula. Una de las principales ventajas de esta técnica es el aumento drástico de la resolución espacial: mientras que la difracción limita la resolución a ~200-250 nm en la microscopía óptica convencional, FPALM puede obtener imágenes en escalas de longitud más de un orden de magnitud más pequeñas. Dado que muchas hipótesis biológicas se refieren a las relaciones espaciales entre diferentes biomoléculas, la resolución mejorada de FPALM puede proporcionar información sobre cuestiones de organización celular que anteriormente habían sido inaccesibles para la microscopía de fluorescencia convencional. Además de detallar los métodos para la preparación de muestras y la adquisición de datos, aquí describimos la configuración óptica de FPALM. Una consideración adicional para los investigadores que desean hacer microscopía de superresolución es el costo: las configuraciones internas son significativamente más baratas que la mayoría de las máquinas de imágenes disponibles comercialmente. Las limitaciones de esta técnica incluyen la necesidad de optimizar el etiquetado de las moléculas de interés dentro de las muestras celulares y la necesidad de software de posprocesamiento para visualizar los resultados. Aquí describimos el uso de la expresión de PAFP y PSFP para obtener imágenes de dos especies de proteínas en células fijas. También se describe la extensión de la técnica a células vivas.

Introduction

Mientras que las estructuras celulares existen en una amplia gama de escalas espaciales, las imágenes de fluorescencia de la organización celular en escalas de longitud menores que ~250 nm están restringidas en la microscopía convencional debido a la restricción física del límite de difracción. Este límite se superó con el advenimiento de la microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM¹) y técnicas similares^2,3, que pueden localizar un gran número de moléculas individuales con una precisión de ~10 nm, para generar imágenes con una resolución de unas pocas decenas de nanómetros. FPALM se basa en el uso de control óptico para activar e inactivar subconjuntos de moléculas (para una descripción completa de FPALM, e instrucciones sobre cómo implementar este sistema de imágenes, ver Gould et al.⁴). Esta técnica permite mapear las distribuciones espaciales de poblaciones enteras de moléculas individuales, dilucidando así estructuras biológicas a través de escalas de longitud que abarcan desde decenas de nanómetros hasta decenas de micras. La microscopía de superresolución basada en la localización (en lo sucesivo denominada microscopía de localización) se ha adaptado para abordar una serie de cuestiones biológicas, con desarrollos tecnológicos que permiten, por ejemplo, la obtención de imágenes de orientaciones moleculares individuales con polarización FPALM, o P-FPALM⁵, la obtención de imágenes de fluorescencia de moléculas individuales en tres dimensiones con Biplane FPALM⁶ u otras técnicas^7-9y la obtención de imágenes de fluorescencia de superresolución de moléculas individuales en células vivas^10-12. La microscopía de localización también se ha aplicado a la obtención de imágenes de múltiples especies en células fijas^13-16. Recientemente, se han obtenido imágenes simultáneas de tres especies de proteínas con FPALM tanto en células fijas como vivas¹⁷. La microscopía de localización puede obtener imágenes de muestras marcadas de diversas maneras: por ejemplo, proteínas expresadas con etiquetas de fusión PAFP o PSFP, anticuerpos o moléculas marcadas con colorantes orgánicos enjaulados o colorantes orgánicos convencionales. Si bien el uso de colorantes fluorescentes convencionales permite el marcaje de proteínas en ausencia de una etiqueta de proteína de fusión, las condiciones generalmente requeridas para el uso de colorantes orgánicos no enjaulados en imágenes de superresolución requieren que las muestras se sumerjan en tampones reductores.^Además, la administración intracelular de conjugados anticuerpo-colorante generalmente requiere que las células se fijen y sus membranas se permeabilicen. o requiere que las células vivas se hagan permeables a través de la electroporación o algún otro medio. Los requisitos para reducir las condiciones de tampón y la permeabilización de la membrana limitan la idoneidad de los colorantes orgánicos para la obtención de imágenes de células vivas, aunque los desarrollos recientes han permitido el uso efectivo de HaloTags y FPALM para obtener imágenes de estructuras de membrana¹⁸.

FPALM fue la primera técnica de microscopía de localización que se aplicó a células vivas¹⁰. En células vivas, además de proporcionar un mapa espacial dependiente del tiempo de las ubicaciones de las moléculas marcadas, FPALM puede rastrear moléculas individuales en múltiples marcos, y trayectorias moleculares determinadas en escalas de tiempo de milisegundos¹⁹. Por lo tanto, FPALM proporciona acceso a escalas de tiempo bastante cortas y resolución a nanoescala.

Multicolor FPALM se puede utilizar para una variedad de sondas diferentes, incluyendo proteínas fotoactivables y colorantes orgánicos enjaulados o no enjaulados. Aquí proporcionamos detalles sobre el protocolo y la configuración para la obtención simultánea de imágenes de dos especies de proteínas fluorescentes, Dendra2 y PAmCherry. Informamos los resultados de las imágenes de PAmCherry conjugada con beta actina (PAmCherry-actina) y Dendra2 conjugada con hemaglutinina de influenza (Dendra2-HA) en fibroblastos NIH-3T3. Los componentes descritos en la configuración se pueden intercambiar por otro hardware más adecuado para la creación de imágenes de otras sondas. Cuando este es el caso, hemos tratado de ser explícitos en el texto.

Multicolor FPALM es ideal para informar sobre las distribuciones espaciales de múltiples especies de proteínas en células vivas o fijas. Esta técnica es especialmente adecuada para investigar relaciones espaciales y/o dinámicas en escalas espaciales de longitud nanométrica, aunque las imágenes informarán de la localización en una gama de escalas de longitud, desde decenas de nanómetros hasta decenas de micras. Una de las principales ventajas de FPALM multicolor es que la configuración es relativamente barata de construir y muy flexible para su uso con varias combinaciones de sondas. El proceso de construcción y calibración del sistema a partir de los componentes también proporciona una comprensión considerable de los factores que pueden comprometer la calidad y la interpretabilidad de los datos y, por lo tanto, el resultado de la investigación. Aquí detallamos los métodos para la configuración óptica, la preparación de muestras y la adquisición de datos de múltiples especies de proteínas, con construcciones de fusión PSFP y PAFP, utilizando FPALM. Si bien este protocolo describe el análisis de células fijas, estos procedimientos son fácilmente aplicables a la obtención de imágenes de células vivas.

La configuración óptica aquí descrita es ideal para la obtención simultánea de imágenes del PSFP Dendra2 y el PAFP PAmCherry. Muchas otras sondas se pueden utilizar para la obtención de imágenes multicolores; Sin embargo, los componentes precisos requeridos pueden variar, dependiendo de los espectros de excitación y emisión de las sondas elegidas. La elección de los espejos dicroicos, los filtros y las longitudes de onda del láser debe basarse en estas consideraciones.

Protocol

Tenga en cuenta: En la Figura 1 se puede encontrar una representación esquemática de los componentes ópticos a los que se hace referencia en este protocolo.

1. Preparación de la muestra de células

1. Placas de células a una densidad optimizada (para las células NIH-3T3, esto es aproximadamente 2-5 x 10⁴ células/cm²) en pocillos de una cámara de 8 pocillos. Las células deben sembrarse en medios completos apropiados para el tipo de célula, aunque los medios deben fabricarse sin antibióticos y sin rojo de fenol, que contribuye a la fluorescencia de fondo. Tenga en cuenta que las condiciones para la experimentación con células, como el rango óptimo de números de paso, pueden diferir para las líneas celulares individuales.
2. Incubar las células durante 24 horas a 37 °C y 5% de CO₂ (o en condiciones apropiadas para el tipo de célula) para permitir que las células se adhieran al cubreobjetos. Transfectar células con ADN libre de endotoxinas para cada una de las dos construcciones de especies de proteínas (en este caso, ADN para PAmCherry-actina y Dendra2-HA). Cubra la muestra con un material impermeable ligero, como papel de aluminio. La transfección debe incluir pocillos con ambas construcciones de ADN, y pocillos con solo una de cada una de estas construcciones.
3. Incubar durante 4-6 horas, 37 °C y 5% de CO₂ (o en condiciones apropiadas para el tipo de célula), antes de cambiar a un medio completo (con antibióticos, sin rojo de fenol) e incubar durante 16-48 horas para permitir que las células expresen las proteínas deseadas.
   1. Las células se pueden fijar lavando tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego incubar con paraformaldehído (PFA) al 4% (PRECAUCIÓN: Tóxico) en PBS durante 15 minutos en RT, y luego lavar otras 3 veces con PBS. Sin embargo, dependiendo de las proteínas de interés, esta fijación puede dar lugar a un grupo considerable de moléculas marcadas que aún son móviles. Para reducir aún más la movilidad, los métodos de fijación alternativos incluyen el uso de metanol 100% refrigerado, o 0,2% de gluteraldehído y 4% de PFA en PBS durante >30 min a 25 °C²⁰. En cualquiera de los métodos, las células deben lavarse con PBS como se indicó anteriormente. Tenga en cuenta que el uso de gluteraldehído puede aumentar la fluorescencia de fondo o la autofluorescencia en algunas condiciones de imagen, y puede requerir un tratamiento posterior a la fijación con borohidruro de sodio²¹.
4. La muestra puede mantenerse a 4 °C, sumergida en PBS, sellada en una película autosellante, hasta 7 días antes de la toma de imágenes.

2. Alineación del microscopio

1. Coloque una escala de calibración (retícula) en la platina del microscopio. Usando un objetivo 10X y la lámpara para la luz transmitida, centre la retícula en el centro del campo de visión (FOV).
2. Iluminación Köhler. Ajuste el microscopio para la iluminación Köhler^22.Para empezar, cierre la apertura del campo y, mirando a través de los oculares, concéntrese en la retícula. Si los bordes del diafragma de campo están desenfocados, ajuste la altura del condensador hasta que tanto el diafragma de campo como la retícula estén enfocados.
3. Ajuste la posición lateral de la apertura de campo hasta que esté centrada con respecto al campo de visión. Cierre la apertura de campo hasta que solo se ilumine la rejilla central de la retícula.
4. Para una alineación aproximada de la posición de la cámara (es decir, la primera vez que se alinea la configuración), utilice una lámpara de alta intensidad con el obturador de la cámara CERRADO y no coloque ningún componente en la caja B (Figura 1), en la trayectoria óptica hasta que se alcance el paso 2.5. No coloque L2 y L3 en la ruta de detección cuando alinee la cámara por primera vez. Centrar aproximadamente la imagen de la retícula en el obturador de la cámara ajustando la posición vertical y horizontal de la cámara (Figura 2B). Desactive la ganancia EM, apague las luces de la habitación y abra el obturador de la cámara.
5. Después de reducir la intensidad de la lámpara a un nivel que no dañe el sensor de la cámara, proyecte la luz de la imagen de la retícula directamente sobre el sensor de la cámara (Figura 2A). Enfoque la retícula ajustando la perilla de enfoque del microscopio mientras visualiza la imagen en modo de video en vivo dentro del software de adquisición. Centre la imagen de la retícula en el sensor de la cámara ajustando la posición vertical y horizontal de la cámara (Figura 2B).
6. Coloque L2 y L3 en la ruta de detección entre la apertura y la cámara (Figura 2C). Alinee L2 y L3, de modo que L2 esté a una distancia focal del punto focal del puerto de salida del microscopio y L3 esté a una distancia focal del sensor de la cámara. Lo ideal es que la distancia entre L2 y L3 sea igual a la suma de las distancias focales de L2 y L3, pero se puede ajustar un poco para adaptarse a las limitaciones de espacio. La cámara y los objetivos deben estar a la misma altura que el puerto de salida.
7. Tenga en cuenta que la luz emitida por el microscopio debe estar centrada en L2 y L3. Ajuste la distancia entre L2 y el microscopio para asegurarse de que la imagen de la retícula esté enfocada con nitidez tanto en la cámara como a través de los oculares.
8. Si es necesario, se pueden utilizar pequeñas traslaciones (por ejemplo, <1 mm) de L2 y L3 para centrar la imagen de la retícula en el sensor de la cámara.
9. Módulo de dos colores. Una vez optimizada la posición de la cámara, fije los componentes que se muestran en el cuadro B (Figura 1) en la ruta de detección. Estos componentes se pueden fijar a un soporte extraíble, de modo que todo el módulo se puede insertar para FPALM multicolor, o quitarse para otras aplicaciones FPALM que no lo requieran.
10. La primera vez que se ensamblan estos componentes, ajuste las longitudes de ruta de cada canal para que sean iguales. Proyecte la retícula en el chip de la cámara, ajuste M7 y M9 y/o cierre la apertura de detección (AP) para evitar la superposición espacial entre los dos canales. Enfoca la imagen de la retícula en el canal de luz reflejada.
11. Si la imagen en el canal de luz transmitida no está enfocada, mueva M9 (y gírela si es necesario) hasta que la imagen de la retícula esté enfocada simultáneamente en ambos canales. Tenga en cuenta que los dos canales deben desplazarse lateralmente entre sí (Figura 2D). Este desplazamiento, ya sea horizontal o vertical, puede afectar a la velocidad de adquisición. Para obtener más información, consulte el manual de usuario de la cámara.
12. Registre una instantánea de la escala de la retícula (para utilizarla posteriormente en el cálculo de la ampliación general). Con el software de la cámara, seleccione la región de interés deseada. Por lo general, será posible obtener velocidades de fotogramas más altas para una región de interés más pequeña.

3. Alineación láser

1. Encienda los láseres de lectura y activación. (PRECAUCIÓN: Los láseres solo deben usarse después de que los operadores hayan recibido capacitación en seguridad láser). Todas las puertas del laboratorio deben permanecer cerradas, y solo el personal esencial capacitado debe estar dentro del laboratorio mientras se alinean los láseres. Utilice los obturadores SH1 y SH2 para bloquear los haces de lectura y activación respectivamente cuando no estén en uso, y los filtros ND para atenuar la potencia del láser a niveles seguros (<1 mW). Es útil minimizar toda la iluminación de la habitación durante la alineación, excepto la iluminación necesaria por seguridad.
2. Bloquee los haces de activación y lectura. Retire L1 de la trayectoria del láser.
3. Coloque una tarjeta blanca al ras contra M4. La mayoría de los microscopios compuestos comerciales tienen un obturador incorporado para bloquear la iluminación entrante. Si está disponible, abra el obturador del microscopio y enfoque hasta que la imagen de la retícula se proyecte en M4. Si no dispone de un obturador de microscopio interno, utilice un obturador externo en una ubicación conveniente que bloquee la entrada de todos los rayos láser en el microscopio.
4. Láser de lectura de centrado en el campo de visión. Desbloquee la viga de lectura. Centre el haz de lectura en el punto de mira de la imagen de la retícula en M4 ajustando M1.
5. Proyecte la imagen de la retícula en M5 y ajuste el espejo M4 hasta que el haz se centre en el punto de mira de la imagen en M5, de modo que el haz de lectura se centre con el punto de mira de la retícula tanto en M4 como en M5. Bloquee la viga de lectura.
6. Láser de activación de centrado en el campo de visión. Proyecte la imagen de la retícula en M3 y retire el expansor de haz (BE) de la trayectoria del láser. Desbloquea el haz de activación.
7. Ajuste M2 para centrar el haz de activación en el punto de mira de la imagen de la retícula en M3. Una vez centrado, reemplace el BE entre M2 y M3, y ajuste la posición del BE hasta que el haz esté centrado en el punto de mira de la imagen de retícula en M3.
8. Con un objetivo 10X, proyecte la imagen de la retícula en M5, ajustando la perilla de enfoque del microscopio si es necesario para obtener el enfoque. Ajuste el ángulo de DM1 hasta que el haz de activación se centre en la imagen de la retícula allí. Bloquee ambas vigas.
9. Sin ningún objetivo en su lugar, y con el obturador del microscopio abierto, proyecte el láser de lectura a través de la apertura posterior del microscopio. (PRECAUCIÓN: Este paso crea un peligro para la seguridad del láser al dirigir un rayo láser paralelo en una trayectoria vertical no bloqueada). Ajuste M5 hasta que el haz emerja directamente del microscopio y aterrice en el techo directamente encima, o se centre en una tarjeta colocada en la montura del objetivo en la torreta.
10. OPCIONAL: La determinación de la alineación correcta puede facilitarse mediante el uso de una muestra de tinte en solución (en este caso, rodamina B a ~ 100 μM en agua o metanol con una profundidad de >0,5 cm para fines visuales), colocada en la etapa de muestra con la lente del objetivo 60X en su lugar. Si el haz está correctamente alineado, el objetivo proyectará un cono de fluorescencia alineado con el eje del objetivo y el microscopio. Pequeñas desviaciones en la colocación del rayo láser en la apertura trasera del objetivo harán que el cono se aleje de una alineación puramente vertical.
11. Bloquee ambas vigas. Monta L1 en la trayectoria del láser a la distancia adecuada (es decir, una distancia focal) de la apertura posterior de la lente del objetivo. Con el objetivo 60X en su lugar, permita que la viga de lectura se proyecte en el techo. Ajuste la posición horizontal y vertical de L1 (perpendicular a la dirección de propagación del láser) hasta que el haz se centre por encima del microscopio. Nota: en este paso, el haz formará un punto más grande que en el paso anterior.
12. La posición axial de L1 y su distancia focal afectarán el tamaño del área iluminada en la muestra. En sentido estricto, el cálculo del perfil de iluminación en la muestra debe tener en cuenta la difracción²³. Sin embargo, a grandes rasgos, la colocación de L1 a una distancia axial distinta de una distancia focal del plano focal posterior del objetivo provocará en muchos casos un perfil de iluminación láser más pequeño e intenso que cuando L1 se encuentra exactamente a una distancia focal del plano focal posterior. Se puede utilizar un área iluminada más pequeña para producir una mayor intensidad de láser para ciertas aplicaciones, como la imagen de alta velocidad, por ejemplo.
13. Medición del perfil del haz de lectura. Con L1 en su lugar, coloque una muestra de solución de tinte concentrada apropiada (en este caso, rodamina B a ~ 100 μM en agua) en el escenario.
14. Con el láser de activación bloqueado, proyecte el láser de lectura (ajuste ND1 para obtener una potencia <<1 mW para todos los haces expuestos) a través del objetivo 60X y en el tinte, y (con la ganancia EM desactivada) envíe esta imagen a la cámara.
15. Enfoca el objetivo en la muestra. Para este paso, se necesita una apertura lo suficientemente grande como para permitir la obtención de imágenes del perfil de haz completo.
16. Desplace el PA lateralmente de modo que el centro del perfil del haz y el PA sean concéntricos. Con el software de la cámara, elija la región de interés para permitir que la región de lectura de la cámara más pequeña encapsule ambos canales. Registre estas coordenadas. Grabe una sola instantánea (este es el perfil del haz de lectura).
17. Las imágenes que reflejan más correctamente el perfil del láser en el plano focal se obtendrán cuando la muestra de la solución de colorante sea lo más delgada posible. Se puede crear una muestra tan delgada colocando una gota de ~ 5 ul de solución de tinte entre un portaobjetos de microscopio y un cubreobjetos.
18. Medición del perfil del haz de activación. Bloquee el láser de lectura. Proyecte el láser de activación a la muestra; y proyectar esta imagen a través de la cámara.
19. Si es necesario, utilice una ganancia EM <100 y ajuste DM1 hasta que el haz esté centrado en cada campo de visión. Registre una instantánea del perfil del haz de activación.
20. Mide la potencia de cada haz. Retire la solución de tinte y coloque un sensor de medidor de potencia sobre el objetivo 60X (sin medios de inmersión). Mida la potencia de cada haz (activación y lectura) por separado. Tenga en cuenta que la posición del medidor de potencia debe ajustarse cuidadosamente para garantizar que toda la potencia del láser emitida llegue al sensor del medidor de potencia.
21. Para cada láser, utilice filtros de densidad neutra (ND1 y ND2) para ajustar la potencia y producir intensidades en la muestra apropiada para el experimento.
22. Intensidad del láser de lectura para la adquisición de imágenes. La intensidad del láser de lectura debe ser lo suficientemente alta como para excitar y fotoblanquear moléculas individuales en el lapso de tiempo de unos pocos fotogramas. Los valores típicos son 10,^3-10,⁴ W^/cm2 (véase también Gould et al.⁴). La intensidad en la muestra depende del tamaño del área de la imagen, por lo que la potencia requerida para lograr la intensidad deseada variará de un sistema a otro.
23. Intensidad de activación del láser. La intensidad de activación del láser debe elegirse de tal manera que el número de moléculas activas sea pequeño (por ejemplo, 1-100) en cualquier marco de adquisición dado. A grandes rasgos, la densidad deseada se alcanza cuando la distancia más cercana entre las moléculas activas es ligeramente mayor que la resolución limitada por difracción (véase también la Sección 6, Imágenes). A medida que disminuye la población de moléculas individuales inactivas, se requieren intensidades más altas del láser de activación. Las intensidades típicas son ^{10-1-10 2} W/^cm2.
24. Optimice la placa de cuarto de onda. La placa de cuarto de onda (QWP) es opcional, pero aumentar el grado de polarización circular de los láseres de lectura y activación con un QWP puede aumentar la densidad de moléculas en las imágenes finales. Para optimizar el QWP, coloque un polarizador entre el QWP y el M5. Bloquee el láser de activación. Proyecte el láser de lectura a través de un medidor de potencia sobre el objetivo seco de 60X.
25. Registre el ángulo del QWP. Ajuste el polarizador hasta que se alcancen las potencias máximas y luego mínimas. Registre cada uno de estos valores y calcule la relación entre mínimo y máximo. Ajuste el ángulo del QWP y repita estas mediciones. Si bien es deseable obtener valores tan cercanos a 1,0, una relación de >0,8 es suficiente para la obtención de imágenes.

4. Creación de una muestra duradera de cuentas para la alineación de canales

1. Diluir una muestra de perlas fluorescentes (de 40 a 100 nm de diámetro) 1:70 en agua de grado HPLC. Diluir aún más esta solución madre 1:15 en agua de HPLC, para obtener un volumen final de 200 μl de suspensión de perlas en agua.
2. Cubra un cubreobjetos con poli-L-lisina líquida. Incubar en RT durante 30 min. Aspire para eliminar la solución y lave el cubreobjetos tres veces con agua apta para HPLC. Aspirar todos los restos de agua del cubreobjetos y dejar secar en RT.
3. Pipetear 200 μl de la suspensión del cordón en el cubreobjetos. Deje este cubreobjetos durante 20 minutos en RT antes de lavarlo tres veces con agua HPLC. Alternativamente, deje el cubreobjetos O/N en RT para permitir que la suspensión se seque.
4. Usando ~ 20 μl de agua de HPLC o medio de montaje, monte el cubreobjetos en un portaobjetos de vidrio. Sella la periferia del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente. Una vez que el esmalte se haya secado, coloque el cubreobjetos (y el medio de inmersión del objetivo apropiado; ya sea agua o aceite) en el objetivo 60X.

5. Adquisición de imágenes: muestra de perlas de imagen para la alineación de canales de detección

1. Ilumine la muestra de perlas con el rayo láser de lectura a una intensidad aproximadamente 10 veces menor que la que se utilizará para la obtención de imágenes. Con la ganancia EM establecida en 100, proyecte la imagen en la cámara y ajuste el enfoque hasta que las cuentas sean visibles en ambos canales.
2. Si las cuentas son tenues, aumente la potencia del láser o la ganancia EM. La minimización del ruido en las imágenes de cuentas (mediante la detección de un gran número de fotones, es decir, al menos 5.000 en total de cada cuenta) es fundamental para un registro preciso del canal. Configure la cámara para grabar 100 fotogramas, con el mismo tiempo de exposición que se utilizará para las imágenes FPALM posteriores.
3. Busque regiones donde las cuentas se distribuyan tanto en el centro como en la periferia de los canales, y donde la densidad de las cuentas sea lo suficientemente baja como para que las cuentas individuales estén bien separadas y puedan identificarse individualmente.
4. Adquiera entre 10 y 20 conjuntos de imágenes de diferentes regiones a estas densidades de cuentas. Consulte la sección de resultados para obtener más información sobre el uso de las imágenes de cuentas para la calibración de canales.

6. Adquisición de imagen: FPALM multicolor

1. Es importante obtener imágenes de las células que han sido transfectadas con solo uno de cada uno de los constructos, así como registrar imágenes de las células con todos los constructos. Estos datos ayudarán a establecer los histogramas alfa de cada una de las sondas utilizadas, y son necesarios para la interpretación de datos multicolor.
2. Encuentre celdas que expresen sondas fotoconmutables, si están en uso. Elimine toda la iluminación de la habitación. Proyecte la lámpara de mercurio, a través de la montura abatible (FM), sobre la muestra (que contiene células transfectadas). Cambie el cubo de filtro de la torreta a uno que contenga la combinación adecuada de espejo/filtro dicroico para permitir la excitación del estado prefotoconmutado de la etiqueta. Por ejemplo, para la obtención de imágenes Dendra2 prefotoactivadas, o sondas con una emisión verde preconmutada, una opción para DM4 es un dicroico que refleja la luz azul (<488 nm) y para F5 es un filtro que pasa la luz de ~500-570 nm, mientras bloquea la luz fuera de este rango.
3. Usando el ocular, busque las células que están expresando la sonda prefotosa. Por ejemplo, las celdas que expresan Dendra2 aparecerán en verde. Tenga en cuenta que no todas las sondas son fotoconmutables y, dependiendo de sus espectros de emisión preconmutados, las que sí lo son pueden requerir combinaciones de DM4/F5 diferentes de las enumeradas aquí.
4. Una vez que se elige una celda, mueva el FM hacia abajo para permitir que los láseres pasen al microscopio (bloquee la luz de mercurio de la trayectoria). Cambie la torreta del filtro a la que contenga el dicroico apropiado para la obtención de imágenes (en este caso, DM2 debe reflejar tanto la lectura como el láser de activación, mientras transmite longitudes de onda más largas, y F1 debe transmitir longitudes de onda al rojo del láser e idealmente presentar una alta supresión en la longitud de onda del láser).
5. Si las células no expresan una sonda fotoconmutable, busque las células proyectando la imagen a la cámara y utilizando el láser de lectura para iluminar la muestra. Es probable que haya moléculas individuales visibles (ver Figura 3) en muchas de las células.
6. Para distinguir las células transfectadas de la fluorescencia de fondo (que aún puede aparecer como moléculas parpadeantes individualmente) y para confirmar que las moléculas son fotoactivables, ilumine brevemente la muestra con una potencia baja del láser de activación (generalmente del orden de microvatios). El número de moléculas fotoactivables visibles bajo el haz de lectura debería aumentar drásticamente y permanecer alto durante un corto período de tiempo, incluso después de que la iluminación de activación se haya bloqueado una vez más. Tenga en cuenta que las diferentes sondas pueden variar considerablemente en su brillo, eficiencia de fotoconversión y potencia láser requerida para la activación^24-27.
7. Prepare el software de la cámara para una adquisición de serie cinética ajustando la ganancia EM a 200 y eligiendo el número deseado de fotogramas (normalmente 5.000-10.000) y el tiempo de exposición (normalmente 10-30 mseg es el adecuado). Si bien la ganancia EM se puede establecer por encima de 200, más allá de cierto punto, aumentar la ganancia EM puede aumentar el ruido.
8. Bloquea el haz de activación. Desbloquee el haz de lectura y proyecte la imagen de la célula iluminada en la cámara.
9. Confirme que la célula está transfectada (paso 6.6). Mientras visualiza la célula, ajuste el enfoque hasta que el plano focal deseado esté a la vista y las moléculas estén enfocadas con nitidez.
10. Para elegir un plano focal que muestre imágenes cerca de la membrana celular inferior, cambie el enfoque hacia abajo hasta que las moléculas individuales ya no sean visibles. Luego, mueva gradualmente el enfoque hacia arriba hasta que las moléculas se hagan visibles por primera vez.
11. Para obtener imágenes cerca de la membrana celular superior, continúe cambiando el enfoque hacia arriba en la cantidad deseada, anotando la distancia usando la perilla de enfoque del microscopio o el enfoque automático. Si se elige una región de enfoque entre estos dos límites, se creará una región en el centro de la celda de la que se está tomando la imagen.
12. Desbloquee el haz de activación e ilumine la muestra con una intensidad baja (utilice los filtros ND2 para atenuar el haz a una intensidad muy baja, aproximadamente <1 W/^cm2 en la muestra).
13. Comience la adquisición de datos. Se desea una alta densidad de moléculas activas; Sin embargo, es fundamental para los pasos del análisis que estas moléculas no se superpongan espacialmente.
14. Intento de mantener una densidad de moléculas fotoactivables visibles de ~0,1-1 ^μm-2 ajustando el ND2. Por lo general, para una región de la imagen de ~ 10-20 μm de diámetro, habrá ~ 10-100 moléculas visibles a la vez (consulte las Figuras 3 y 4 como referencia). A medida que el número de moléculas inactivas restantes disminuye en el transcurso de la adquisición, es posible que la potencia del láser de activación deba aumentar gradualmente para mantener la densidad.
15. Si se desea obtener imágenes TIRF*, M5 y L1 deben montarse en una sola etapa de traducción (TS, Figura 1) para moverlas lateralmente (es decir, en una dirección perpendicular al láser justo detrás de la entrada al microscopio). A medida que M5 y L1 se traducen, los láseres que salen del objetivo hacia arriba a través de la muestra se inclinarán gradualmente hacia un lado (PRECAUCIÓN: peligro para la seguridad del láser).
16. A medida que el ángulo de los láseres alcanza los 90 ° desde la vertical, el láser emergente se desvanecerá, el láser de lectura entrante se reflejará hacia atrás, emergiendo como un haz que viaja fuera de la apertura trasera del objetivo, antiparalelo al haz entrante y desplazado hacia un lado.
17. Al mismo tiempo, la fluorescencia de fondo se atenuará casi por completo y el grosor de la región de la muestra que contiene moléculas individuales discernibles y enfocadas se reducirá considerablemente.
    *TIRF permitirá obtener imágenes de una sección delgada de la muestra que está a ~100-500 nm por encima del cubreobjetos. Los planos focales de imagen que están más adentro de la muestra se logran fácilmente utilizando iluminación de campo amplio (Sección 3), pero no son apropiados para TIRF.
    
18. Una vez finalizada la adquisición, cierre el obturador del microscopio inmediatamente y bloquee ambos haces. Desactive la ganancia EM, configure la cámara para grabar un fotograma y ajuste la región de lectura de la cámara a su tamaño máximo.
19. Bloquea un canal colocando una tarjeta sobre F3 o F4. Con un filtro de paso largo (>580 nm) montado en la lámpara del microscopio, ilumine la muestra y proyecte esta imagen en la cámara. Grabe una instantánea de la celda.
20. OPCIONAL: Con un canal aún bloqueado, abra la apertura para que un área grande de la muestra sea visible mediante la iluminación de luz transmitida. Grabe una instantánea. Estas imágenes de luz transmitida son muy útiles para ver el contexto de las imágenes FPALM correspondientes.
21. Obtención de imágenes de células vivas. Para obtener imágenes de células vivas, transfecte las células según los pasos 1.1-1.3, pero no fije estas muestras. En su lugar, alinee la configuración como se describe anteriormente en su totalidad, pero antes de obtener imágenes de las muestras, retírelas de 37 °C y 5% de CO₂, lave 3 veces en PBS y sumerja la muestra en un medio de imagen (por ejemplo, PBS con 20 mM de glucosa). La eliminación de los medios de cultivo y el lavado reducirán el fondo asociado con la mayoría de los medios celulares.
22. Las muestras se pueden obtener imágenes a RT si se desea, como se desea con células fijas, o a 37 °C y 5% de CO₂ con el uso de una etapa de incubación montada en la etapa del microscopio. Una sola muestra de células NIH 3T3 debe sumergirse en medios de diagnóstico por imágenes durante no más de aproximadamente 1 hora. Puede ser útil monitorear cómo responden las células a la inmersión en medios de imagen antes de prepararse para experimentos de este tipo, para optimizar el tiempo de inmersión y, potencialmente, la composición de los medios de imagen para reducir la perturbación de las células.

Results

La hemaglutinina (HA) de la influenza forma grupos del orden de decenas de nanómetros a micrómetros, y estos grupos se colocalizan de manera variable con la actina (Figura 5). Estas distribuciones espaciales corroboran la obtención de imágenes a escala más gruesa de estas dos proteínas²⁸ y la dependencia de las distribuciones espaciales de HA con la actina¹⁹. Las imágenes multicolor de FPALM se pueden utilizar para describir la densidad, el área y el perímetro de estos grupos, y el ...

Discussion

Las imágenes de superresolución basadas en la localización proporcionan muchas capacidades potentes para la obtención de imágenes biológicas. La ruta desde los componentes ópticos individuales colocados sobre la mesa hasta un microscopio funcional de superresolución capaz de obtener imágenes simultáneas de múltiples especies fluorescentes en una muestra biológica presenta una serie de desafíos. Algunos aspectos de la alineación son más críticos que otros; A continuación, nos esforzamos por brindar orientación a los posib...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cámaras LabTek II	Nunc
Perlas fluorescentes	Invitrogen	F-8801	Perlas para calibración
Perlas Tetraspeck	Invitrogen	T-7279	Perlas de cuatro colores para calibración
Aceite de inmersión objetivo	Zeiss	518F	Aceite de inmersión para objetivo de alta NA (dependiendo de la elección del objetivo)
Agua de HPLC	Fisher Scientific	W5-4
Media	ATCC	30-2003	O Cellgro 10-090
Antibióticos	GIBCO	15070-063
suero	Thermo Scientific	SH30087.03
Lipofectamine	Invitrogen	52887
Optimem I	GIBCO	11058-021
Tripsina	MPBiomedicals
paraformaldehído	Fisher Scientific	AA433689M	PRECAUCIÓN: Tóxico