Artículo de método

El uso de un sistema de seguimiento 3D Automatizado de Registro Individual y bajíos de adultos de pez cebra

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DOI:

10.3791/50681

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5 de diciembre de 2013

 ,  , 
1R&D, xyZfish

En este artículo

Resumen

Se describe el uso de un sistema de video automático 3D que puede rastrear individuos y grupos de peces cebra. Como ejemplo de aplicación, exploramos los efectos del antagonista del receptor NMDA MK-801 en cardúmenes de pez cebra.

Resumen

Al igual que muchos animales acuáticos, pez cebra (Danio rerio) se mueve en un espacio 3D. Por tanto, es preferible utilizar un sistema de grabación 3D para estudiar su comportamiento. El sistema de seguimiento automático de vídeo presentado logra esto mediante el uso de un sistema de espejo y un procedimiento de calibración que corrige el error considerable introducida por la transición de la luz del agua al aire. Con este sistema es posible grabar tanto individual y grupos de adultos de pez cebra. Antes de usar, el sistema tiene que ser calibrado. El sistema consta de tres módulos: grabación, Reconstrucción Ruta y Procesamiento de Datos. Se presentan los protocolos de paso a paso para la calibración y el uso de los tres módulos. Dependiendo de la configuración experimental, el sistema puede ser utilizado para la neofobia de prueba, la aversión al blanco, la cohesión social, el compromiso motor, exploración novela objeto, etc. Es especialmente prometedora como una herramienta de primera etapa para estudiar los efectos de los fármacos o mutaciones en modelos de comportamiento básicos. Lasistema proporciona información sobre la distribución vertical y horizontal del pez cebra, sobre los xyz-componentes de parámetros cinemáticos (tales como la locomoción, la velocidad, la aceleración, y el ángulo de giro) y proporciona los datos necesarios para el cálculo de los parámetros de cohesiones sociales al probar los bajíos.

Introducción

El pez cebra se ha convertido en un modelo importante para la investigación biológica y farmacológica1-3. El seguimiento del movimiento y los patrones de distribución espacial de los peces cebra individuales y de los bancos de peces cebra es invaluable. Los estudios más antiguos aplican la cuantificación manual basada en imágenes grabadas4. Ahora, los sistemas automáticos de seguimiento de video 2D se usan comúnmente5. Sin embargo, dado que el pez cebra y muchos otros animales acuáticos y no acuáticos se mueven en un espacio tridimensional, el interés en los sistemas 3Destá creciendo. El sistema 3D descrito se publicó por primera vez en 20077. Para obtener detalles técnicos y comparaciones con otros sistemas, véase8. La ventaja básica de este sistema, en comparación con otros sistemas, es que adquiere dos (opcionalmente tres) vistas sincrónicas e independientes utilizando un sistema de duplicación y que utiliza un protocolo de calibración de dos pasos. En el primer paso, se calibra la geometría 3D del sistema estéreo (formado por la cámara y los espejos). En el segundo paso, se corrigen los errores no lineales introducidos por la refracción de la luz. Cuando se estudian animales acuáticos, el impacto de la refracción de la luz puede ser considerable cuando no se corrige. Otros sistemas publicados hasta ahora (incluso los desarrollos más recientes9) omiten el procedimiento de calibración en dos pasos. Para detalles técnicos sobre identificación de objetos, oclusión con seguimiento multiobjeto, ruido de jigging, etc. Se remite al lector a las publicaciones originales8,9. El sistema ha sido validado para el estudio de las respuestas conductuales similares a la ansiedad10,11, el cardumen8,11,12 y, en un estudio preliminar, para el comportamiento antagónico en el pez cebra13. También se ha probado para otras especies de peces (pez dorado8, cola de espada, barbo tigre) y para ratones9.

A continuación, se describen los protocolos para la calibración y el uso del sistema, y se presentan los resultados de un experimento que prueba los efectos del antagonista no competitivo del receptor NMDA MK-801 en el pez cebra en cardúmenes para demostrar el tipo de datos que se pueden obtener con el sistema.

Tanto en el entorno natural como en los acuarios, el pez cebra suele nadar en cardúmenes14. Las preferencias de búsqueda de cardúmenes parecen depender de varios factores, como la crianza, el sexo y la disponibilidad de alimentos14,15. Curiosamente, la distancia entre los peces cebra individuales en un banco se hace más pequeña cuando hay señales de peligro potencial, como las feromonas de alarma16 o la novedad11. Por lo tanto, el paradigma del cardumen también se está utilizando para probar fármacos ansiolíticos17. Las jerarquías de dominancia18 y el aprendizaje social19 son aspectos fascinantes del comportamiento del pez cebra. Debido a su carácter conductual social altamente desarrollado, el pez cebra también se ha vuelto de interés para la investigación del autismo20,21.

Se ha reportado que MK-801 altera el comportamiento social en el pez cebra5,22,23, lo que recuerda sus efectos en los mamíferos24. Sin embargo, MK-801 también tiene muchos otros efectos sobre otros comportamientos (como el comportamiento de natación, la evitación inhibitoria y la preferenciade lugar 25-27). Por lo tanto, es crucial, en los experimentos iniciales, obtener la mayor cantidad de información posible a partir de observaciones básicas. Esto proporcionará la base para el diseño de experimentos más específicos.

Inspección del aparato de grabación y del software

En su configuración actual, el contenedor de observación (25 cm x 25 cm x 18 cm, largo x ancho x alto), que contiene el pez cebra, se coloca en la cámara de observación (91 cm x 46 cm x 56 cm, largo x ancho x alto). La cámara también contiene una cámara, un espejo que está suspendido en un ángulo de aproximadamente >45° sobre el contenedor y barras de luz LED. En la figura 1 se muestra un diagrama simplificado. La cámara graba tanto la vista frontal como la vista superior (espejo) para construir las trayectorias 3D del pez cebra determinando sus coordenadas x, y y z. A efectos de orientación, los vectores de coordenadas se presentan en la esquina frontal izquierda del contenedor de observación (posición relativa a la cámara), lo que corresponde a los vectores presentados en las vistas 3D (por ejemplo, Figura 15) generadas por el Módulo de Reconstrucción de Rutas (ver más abajo). La frecuencia de muestreo depende de la cámara y del ordenador. En nuestros experimentos es de aproximadamente 40 fotogramas/seg (fps). La resolución espacial de los fotogramas grabados es de 640 x 480 píxeles (esta configuración se eligió como equilibrio óptimo entre resolución espacial y temporal). Se requiere Windows XP o superior.

Antes de la primera grabación, el sistema debe calibrarse para determinar la ubicación de las paredes del contenedor y la superficie del agua, para determinar el factor de escala de los fotogramas registrados y para ajustar el considerable error generado por la refracción de la luz al pasar del agua al aire. En principio, la calibración solo debe realizarse durante la instalación inicial y después de que se muevan o reemplacen partes de la configuración, como la cámara o el espejo. Sin embargo, es una buena práctica comprobar de vez en cuando si la calibración sigue siendo correcta y recalibrar, si es necesario.

El software consta de tres módulos. El módulo de grabaciones registra los fotogramas (en la Figura 2 se muestran dos fotogramas de ejemplo). El módulo de trayectoria reconstruye las rutas de cada pez cebra. El módulo de procesamiento de datos calcula una serie de parámetros cinemáticos y espaciales estándar. Con el fin de un análisis posterior, los datos se pueden importar a una hoja de cálculo o a un software estadístico.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Calibración

  1. Coloque un recipiente de observación vacío en la cámara de modo que los pies del contenedor se inserten en los orificios provistos para una alineación correcta. Oriente el contenedor de manera que las paredes semitransparentes (el propósito de su estructura es reducir los reflejos) miren hacia el lado más alejado y a la derecha de la cámara.
  2. Abra el módulo de grabación, seleccione 'Control de cámara' y ajuste 'ganancia' y 'obturador' (después de deseleccionarlos, cuadros a la derecha) para que la imagen sea clara. Coloque el espejo lateral en un ángulo de aproximadamente 45° en el lado izquierdo del contenedor de observación para que la vista lateral del contenedor en el monitor de la computadora sea completamente visible. Además, el espejo debe estar alineado de manera que la pared frontal del contenedor se vea como una línea (como lo indica la flecha en la Figura 3).
  3. Conecte el panel de calibración al puerto paralelo (de la tarjeta de la cámara) y presione el botón 'LED panel on/off' en el módulo de grabación para encender los LED.
  4. Coloque el panel de calibración en el contenedor de observación vacío de manera que los 5 LED se puedan ver en las vistas frontal, superior y lateral en el monitor de la computadora como en la Figura 3 (a veces el cable bloquea la vista, en este caso muévalo). Asegúrese también de que los LED estén por debajo de las marcas del nivel del agua (estas marcas están grabadas en los recipientes de observación a 135 mm del fondo interior del tanque) y que la posición del panel sea estable (para que no se mueva al llenar el recipiente con agua en el paso 1.9).
  5. Apague las luces de la cámara de observación y cierre la cortina (tenga cuidado de no tocar el cable del panel de calibración o el espejo lateral).
  6. Pulse el botón "Ubicación de datos" y cree o seleccione una carpeta para los archivos de calibración. Estos archivos se utilizarán para todas las grabaciones posteriores (o experimentos) hasta que sea necesaria una recalibración. Por lo tanto, lo ideal es que los datos de calibración formen parte del nombre de la carpeta de calibración.
  7. Ajuste los tres cuadros rojos en la pantalla de la computadora de manera que cada uno abarque los 5 LED en cualquiera de las tres vistas (Figura 4, panel izquierdo). De nuevo, utilice 'ganancia' y 'obturador' en 'Control de cámara' para obtener imágenes claras de los LED, sin imágenes de otros puntos de luz (que se deben al ruido, los reflejos o las gotas de agua en la pared del contenedor), como en la Figura 4, panel derecho.
  8. Apague los LED y presione el botón 'Recoger calibración sin agua'. En la pantalla del ordenador aparecen 5 etiquetas ('x') numeradas del 0 al 4. Encienda el panel. Las ubicaciones de las etiquetas deben coincidir con los LED. De lo contrario, repita el paso 1.7 (consulte la Figura 4 para ver una ilustración de la asignación incorrecta de etiquetas en el panel izquierdo y la asignación correcta de etiquetas en el panel derecho).
  9. Llene la cámara de observación con agua hasta la marca. Los LED deben estar por debajo del nivel del agua (como se explicó en el paso 1.4). Si están por encima del nivel del agua, vacíe el recipiente y vuelva al paso 1.4. Al llenar el agua en el recipiente, tenga cuidado de que el panel LED no se mueva. Sin embargo, si esto sucede, vacíe el contenedor y vuelva al paso 1.4. Esto es importante, porque la calibración se basa en determinar las diferencias entre las posiciones de los LED registrados sin y con agua.
  10. Presione el botón 'Recoger calibración con agua'. De nuevo, al igual que en el paso 1.8, aparecerán cinco etiquetas en la pantalla, que en la mayoría de los casos estarán ligeramente desplazadas de las obtenidas durante la calibración sin agua. En este paso, es posible que sea necesario reajustar la ganancia y el obturador. Repita hasta que las etiquetas estén colocadas correctamente en la parte superior de los LED (como en la Figura 4, panel derecho).
  11. Encienda las luces en la cámara de observación, ajuste la ganancia y el obturador (en 'Control de la cámara') para que la imagen no sea demasiado brillante.
  12. En la figura 5 se muestran los seis puntos que deben seleccionarse secuencialmente haciendo clic con el botón derecho del ratón. Asegúrese de que los puntos estén en las líneas designadas: 1. vista frontal del nivel del agua, 2. cresta superior izquierda del contenedor en la vista superior, 3. línea vertical que delinea la pared frontal en la vista lateral. La longitud de la línea no es esencial. Entre las posiciones 1 y 2, 3 y 4, y 5 y 6, aparecerán líneas rectas (los números no aparecerán en la pantalla). Presione 'Recopilar información del contenedor' para guardar esta información.
  13. Retire el espejo lateral y el panel LED y llene el agua exactamente hasta la marca. Selecciona 'Iniciar grabación'. Una nueva ventana pregunta la duración en minutos. Para el propósito actual, 1 minuto es suficiente. Presione Aceptar.
  14. Después de grabar, salga del módulo de grabación, abra el módulo de trayectoria, seleccione la carpeta de calibración (realizada en el paso 1.6) con 'Ubicación de datos' (la carga del archivo puede llevar algún tiempo). Esta carpeta contiene los archivos de calibración y los archivos de los datos recién registrados (paso 1.13).
  15. Presione el botón 'Adquirir fondo'. Se abre una nueva ventana, sin cambiar nada presione OK. Espere hasta que aparezca una imagen (al revés) del tanque de observación en el monitor. A continuación, pulsa 'Cargar fondo'. Se corregirá la imagen de fondo. Se abre una nueva ventana que pide ajustar las cajas. Solo tienes que pulsar OK.
  16. Presione secuencialmente el botón del tercero al séptimo: 'Cargar correspondencia sin agua', 'Calibrar cámara(s) virtual(es)', 'Cargar correspondencia refractada', 'Recopilar geometrías de contenedores', 'Recuperar información de contenedores de animales'. Este último paso puede tardar varios minutos. Se completa cuando aparecen tres líneas blancas en la pantalla (que son las líneas que se dibujaron en el paso 1.12). Presione el botón "Guardar información del contenedor".
  17. Presione el botón 'Recopilar volumen'. Ahora, como se muestra en la Figura 6, marque consecutivamente las 8 esquinas del cuerpo de agua, que es un cuboide. Para cada punto, primero haga clic en él en la vista frontal y luego en la vista superior.
  18. Seleccione '3D' en la esquina izquierda de la ventana. Ahora se abre una nueva ventana que muestra el contorno de una caja con un fondo blanco (como en la Figura 15, pero sin la trayectoria). Haga clic con el botón derecho del ratón para seleccionar las rotaciones y traslaciones de la vista de cuadro. Si no aparece ninguna imagen o si la imagen no es la de un cuboide (es decir, en el paso 1.17 las esquinas se hicieron clic con el botón derecho en el orden incorrecto), haga lo siguiente: mientras deja, pero no cierra el Módulo de Trayectoria, usando Windows vaya a la carpeta de calibración (realizada en el paso 1.6), seleccione la subcarpeta 'Datos del contenedor de animales' y elimine el archivo llamado TankVertices y repita el paso 1.17.
  19. Enhorabuena, se ha completado la calibración. Lo ideal es realizar una prueba con un pez ficticio para comprobar si todo funciona bien. La buena noticia es que la recalibración solo debe realizarse si las posiciones del espejo o de la cámara se han alterado (aunque sea ligeramente) o si hay problemas con el seguimiento (consulte la sección 3).

2. Grabación

  1. Coloque el recipiente de observación lleno de agua hasta las marcas en la cámara de observación de manera que los pies del recipiente se inserten en los orificios provistos para una alineación correcta. Oriente el contenedor de tal manera que las paredes semitransparentes (o paredes blancas en nuestro ejemplo, consulte la Discusión) miren hacia el lado más alejado y hacia la derecha, como se ve desde la cámara.
  2. Encienda las luces del compartimento, coloque el pescado (experimental o ficticio) en el recipiente y cierre las cortinas. Nota: el sistema puede registrar varios peces (ver la sección de Resultados Representativos); Sin embargo, es aconsejable adquirir algo de experiencia con el sistema registrando primero un solo pez.
  3. Abra el módulo de grabación. En la pantalla aparece la imagen de la vista frontal y superior (espejo) del contenedor. Es posible que la imagen no sea la ideal (por ejemplo, sobreexpuesta, por ejemplo, Figura 7) y que deba ajustarse (los siguientes tres pasos) para obtener un buen contraste entre los peces y el fondo (por ejemplo, Figura 8).
  4. Seleccione 'Control de cámara' y, en la ventana de 'Configuración general' que se abre, ajuste 'Obturador' y 'Ganancia' (después de deseleccionar las casillas correspondientes a la derecha, consulte la Figura 9) de tal manera que la imagen no esté sobreexpuesta y haya un buen contraste entre los peces y el fondo.
  5. En el lado izquierdo de la ventana 'Control de cámara', seleccione 'Balance de blancos/Color' y en la nueva ventana, anule la selección del cuadro 'Automático' y ajuste los valores de rojo y azul (consulte la Figura 10) para obtener el mejor contraste de color tanto en la vista frontal como en la superior.
  6. Puede ser necesario cambiar varias veces entre ajustar el color (en 'Balance de blancos/Color') y ajustar la ganancia y el obturador (en 'Configuración general') para obtener la mejor configuración de la cámara. Tenga en cuenta que incluso si estuviera satisfecho sin ningún ajuste, es crucial anular la selección de las casillas 'Obturador', 'Ganancia' y 'Auto' (como se explica en los pasos 2.4 y 2.5), de lo contrario, el fondo fluctuará en el transcurso de la grabación, lo que hace imposible extraer las trayectorias. No cambie ninguna de las otras configuraciones. Cuando termine, cierre la ventana 'Control de la cámara'.
  7. En el menú principal del módulo de registros, seleccione 'Ubicación de datos' para crear o abrir una carpeta creada anteriormente. Tenga en cuenta que cada grabación (por ejemplo, pez o cardúmen) tiene su propia carpeta, que idealmente debería ser una subcarpeta de la carpeta del experimento.
  8. Presione 'Iniciar grabación'. Se abre una ventana que pregunta la duración de la grabación en minutos (solo ingrese números enteros). Presione 'OK', lo que inicia la sesión de grabación real.
  9. Si la grabación se ha completado, salga del programa. Antes de grabar el siguiente pez, se recomienda reiniciar la computadora. Utilice la opción Reiniciar en Windows para conservar la configuración de la cámara (de los pasos 2.4 y 2.5). La necesidad de reiniciar la computadora entre grabaciones se debe a algunos problemas con la tarjeta de la cámara.
  10. Antes de ir al módulo de trayectoria para la reconstrucción de rutas, copie y pegue las subcarpetas 'Datos del contenedor de animales' y 'Datos de correspondencia' de la carpeta de calibración (hecha en la sección uno de este protocolo) en cada carpeta que se creó durante la grabación. En estas últimas carpetas están presentes otras dos subcarpetas, a saber, 'Datos sin procesar' y 'Marcas de tiempo'. El primero contiene todos los fotogramas grabados en formato JPEG; Este último contiene información sobre el número total de fotogramas y los intervalos entre los fotogramas (en mseg).

3. Reconstrucción de ruta

  1. Abra el módulo de trayectoria, presione 'Ubicación de datos' para seleccionar la carpeta que se creó con el módulo de registro y luego presione el botón 'Configuración del sistema' para abrir los 'Parámetros' (consulte la Figura 11).
  2. Seleccione una vista superior e inferior de umbrales de color. Un buen valor inicial es 1.000. Si este valor es bajo, es más probable que el software registre ruido. Sin embargo, si el valor es demasiado alto, es posible que el pez esté por debajo del rango de detección. Más adelante (pasos 3.11 y 3.12) puede ser necesario reajustar los umbrales de color. Tenga en cuenta también que los umbrales de color superior e inferior no tienen que ser los mismos.
  3. Seleccione Umbrales de tamaño de vista superior e inferior. Un buen valor inicial para un pez cebra de tamaño mediano es 10, para uno muy grande 20 y para uno muy pequeño 5. Cuanto mayor sea el umbral de tamaño, menos probable es que capte ruido. Sin embargo, si es demasiado alto, es posible que el software tampoco pueda detectar los peces. De nuevo, en los pasos 3.11 y 3.12 podría ser necesario reajustar los umbrales de tamaño. Tenga en cuenta también que los umbrales de tamaño superior e inferior no tienen por qué ser los mismos.
  4. Para 'Umbral de tamaño superior' un valor de 3.000 suele ser bueno y para 'Longitud específica' déjelo en 220 (ya preestablecido). El "número de peces" se refiere al número de peces en el tanque de observación. "Número máximo de puntos" se refiere al número total de fotogramas. Recuerde (o escriba) este número o uno ligeramente inferior (por ejemplo, 45.703 podría memorizarse como 45.000). Presione Aceptar.
  5. Pulse secuencialmente los botones 'Cargar correspondencia sin agua', 'Calibrar cámara(s) virtual(es)' y 'Cargar información del contenedor de animales'. Se generará un mensaje de error si las subcarpetas de calibración 'Datos del contenedor de animales' y 'Datos correspondientes' no se han copiado en la carpeta experimental actual (consulte el paso 2.10). Si es así, copie y pegue esas subcarpetas ahora y presione los botones nuevamente.
  6. Pulsa el botón 'Adquirir fondo'. Una nueva ventana le pedirá que rellene 'from' y 'to' con los valores predeterminados 0 y 100, respectivamente. Cambie 100 por el número máximo de fotogramas (en el ejemplo dado en el paso 3.4 esto podría simplificarse como 45.000). Presione Aceptar.
  7. Espere hasta que aparezca una imagen (distorsionada). A continuación, pulsa "Cargar fondo", lo que dará como resultado el establecimiento de la imagen de fondo correcta. El pez no debería ser visible en esta imagen de fondo. Si el pez es visible, intente adquirir un mejor fondo de otros segmentos de registro (por ejemplo, pruebe 0-1.000, 1.000-2.000, etc. en el paso 3.6).
  8. Si el pez no se movió en absoluto durante la sesión de grabación, la única forma de adquirir un fondo es eliminar el pez y hacer una nueva grabación corta sin el pez, pero con la misma configuración de 'Controles de cámara' (esto es importante). Adquiera el fondo y copie la subcarpeta 'Datos de fondo' en la carpeta experimental actual. Ahora presione 'Cargar fondo', no presione 'Adquirir fondo'. Tenga en cuenta que abrir y cerrar la cortina a menudo da como resultado un fondo algo cambiado, por lo que podría ser necesario ajustar los umbrales en los pasos 3.2 y 3.3 para reducir el ruido. El paso 3.11 muestra cómo comprobar si hay ruido.
  9. Después de cargar el fondo, ajuste los tres cuadros rojos (con la ayuda del ratón) como se muestra en la Figura 12. Las casillas marcan las áreas en las que el software está buscando los peces. Cierre la casilla de la izquierda (es decir, redúzcala a una línea o un punto) porque la vista lateral solo se usa para la calibración (como se explicó en el paso 1.7).
  10. Presione el botón 'Comenzar a generar trayectorias'. Se abre una ventana que pide el número de fotograma inicial. Vaya con el '0' predeterminado. Después de presionar 'OK', se abre la ventana 'Asignaciones de etiquetas' (consulte la Figura 13). Presione 'Avanzar' hasta que aparezca la etiqueta ('X0') en la pantalla. Si la etiqueta no está colocada en la imagen del pez, presione 'No' hasta que esté colocada correctamente. A continuación, pulse 'Ir'. Si nunca se asigna correctamente (o en absoluto), presione 'Ir' de todos modos y busque el problema (siguiente paso).
  11. Comienza la reconstrucción del camino. Idealmente, la etiqueta siempre (o al menos la mayor parte del tiempo) debe colocarse en la imagen del pez. Si a menudo se coloca incorrectamente, abra la ventana 'Información' (segunda opción encima de la pantalla de video). La figura 14A muestra el caso ideal, donde solo se ven los contornos de los peces. La Figura 14B muestra un caso de ruido excesivo que impide la correcta asignación de etiquetas. Si ve una imagen clara del pez sin ruido (como en la Figura 14A), pero la etiqueta nunca o rara vez se asigna correctamente, entonces la razón más probable es que la calibración esté desactivada. Recalibrar y rehacer la reconstrucción de la ruta. Si durante la calibración, el espejo y las cámaras no se mueven, los nuevos datos de calibración se pueden utilizar para las grabaciones realizadas anteriormente.
  12. En caso de ruido excesivo (como en la Figura 14B), presione 'Stop' en el menú principal y elija nuevos umbrales de color y tamaño (pasos 3.2 y 3.3). Compruebe también si las cajas rojas (paso 3.9) se pueden reducir un poco (por ejemplo, para excluir el ruido generado por los movimientos del agua en la parte superior). Tenga en cuenta que a veces el programa se 'atasca' (si no se pudo asignar ninguna etiqueta): en este caso, reinicie el programa.
  13. Mira la trayectoria en la pantalla 3D (tercera opción encima de la pantalla). Figura 15. representa un ejemplo de trayectoria. Al hacer clic con el botón derecho del ratón, seleccione entre la rotación y las traslaciones de la configuración 3D.
  14. Cuando se complete la trayectoria, presione secuencialmente los botones 'Guardar' (no 'Detener', ¡que elimina la trayectoria!), 'Limpieza de trayectoria' y 'Suavizado de trayectoria'. Se abre una nueva ventana que muestra los parámetros de filtro para el suavizado (Figura 16). No modifique los valores predeterminados antes de haber adquirido más experiencia con el sistema. Presione 'Aceptar'.
  15. A estas alturas debería estar claro por qué era tan importante elegir una buena configuración de la cámara (con un buen contraste entre los peces y el fondo) antes de grabar (ver pasos 2.4-2.6). Proceda al tratamiento de datos.

4. Procesamiento de datos

  1. Primero, eche un vistazo a la carpeta que se utilizó para registrar los peces (Figura 17). Contiene las subcarpetas 'Datos de contenedores de animales' y 'Datos de correspondencia' que se copiaron de la carpeta de calibración (paso 2.10), las subcarpetas 'Marcas de tiempo' y 'Datos brutos' que se crearon durante el registro de los peces y las subcarpetas 'Datos de fondo' y 'Trayectorias' que se crearon durante la reconstrucción de la ruta.
  2. La figura 17 también muestra que la subcarpeta 'Trayectorias' contiene tres archivos. El archivo point.smoothed es el archivo que se utilizará para el procesamiento posterior de datos. En el caso de registro de varios peces (por ejemplo, un experimento de cardúmenes), para cada pez se generará un archivo point.smoothed-file separado.
  3. En la figura 18 se muestra la parte superior de un archivo point.smoothed-file de ejemplo. La primera línea da el número total de muestras o fotogramas, la segunda línea la duración de la grabación (en minutos) y la tercera línea las coordenadas (secuencia: x, z, y) del centro del cuerpo de agua en relación con la cámara. A esto le sigue una línea para cada fotograma que proporciona las coordenadas x, y, z (en mm) para el pez y la duración de esa muestra (en segundos).
  4. Hay dos formas de procesar los datos proporcionados en los archivos point.smoothed: utilizar el Módulo de Procesamiento de Datos o utilizar otro software, como Excel o MATLAB para realizar cálculos que (todavía) no están incorporados en el Módulo de Procesamiento de Datos.
  5. Abra el módulo de procesamiento de datos, seleccione "Proyecto" en la barra de herramientas y, a continuación, en el menú desplegable, seleccione "Nuevo" y, a continuación, rellene un nombre para el experimento. Seleccione 'Editar proyecto' en la barra de herramientas, seleccione 'Agregar al proyecto' en el menú desplegable, seguido de 'Nuevo grupo' y complete un nombre para el grupo (por ejemplo, 'Controles'). Tenga en cuenta que en este momento los nombres de proyectos y grupos no se usan realmente, sino que los nombres deben completarse. Las carpetas creadas se pueden utilizar para almacenar los archivos de salida (consulte el paso 4.10).
  6. Seleccione un grupo (por ejemplo, 'Controles') en la ventana de la derecha (consulte la Figura 19). La barra de herramientas cambiará. Seleccione 'Editar grupo', luego 'Agregar al grupo' en el menú desplegable, luego 'Nuevas mediciones'. Esto abrirá un navegador. Abra la carpeta creada durante la grabación (paso 2.7), seleccione la subcarpeta 'trayectorias' y luego el archivo point.smoothed. En el ejemplo presentado en la Figura 19, para el Grupo A se cargaron seis archivos, para el Grupo B cuatro archivos. (Nótese que en el ejemplo ilustrado los archivos suavizados tienen las extensiones 0 y 1, porque en ese experimento se probaron dos peces dorados simultáneamente).
  7. Para el análisis, seleccione el archivo suavizado de puntos en la ventana de la derecha, seleccione 'Procesamiento de datos', seleccione 'Puntos finales únicos' en el menú desplegable y, a modo de ejemplo, seleccione 'Congelación de duración' (Figura 20). Se abre una ventana para especificar la congelación en términos de umbral de velocidad y umbral de duración. En el ejemplo, el pez pasa el 25,86 % del tiempo de observación congelándose.
  8. Para familiarizarse con el programa, pruebe otros ejemplos, como Distancia de viaje, Distribución de profundidad (que le permite determinar el número de niveles de profundidad) y Frecuencia de ráfaga.
  9. Hay cálculos más avanzados, como el análisis espectral de, por ejemplo, el componente z de la aceleración. En este caso, seleccione 'Características de series temporales', luego 'Análisis de dominio de frecuencia TD', 'Análisis espectral' y 'Espectro de aceleración Z'. El análisis de Fourier se realizará sobre el parámetro indicado (para la explicación7). No todas las opciones que se muestran en el menú están completamente implementadas. Por ejemplo, 'Tortuosidad de camino' solo se agregó experimentalmente.
  10. Al seleccionar la opción 'Procesamiento por lotes con umbral predeterminado', se calcularán alrededor de 200 puntos finales. En este contexto, 'default' significa que se han establecido delimitadores. Por ejemplo, actualmente la distribución de profundidad se calcula para tres niveles de profundidad, la distribución angular se calcula para cuatro secciones (es decir, cuadrantes), etc. Después de generar los parámetros, se abre una nueva ventana que solicita la ubicación y el nombre del archivo que se va a crear. Estos se guardarán en formato CSV y se pueden importar a otro software, como Excel, para su posterior procesamiento.
  11. A diferencia del Módulo de Registro y el Módulo de Trayectoria, el Módulo de Procesamiento de Datos es un módulo en evolución que se adaptará aún más a los requisitos de los investigadores.

Resultados

Se compraron hembras de pez cebra (Danio rerio) de seis meses de edad de una cepa silvestre no especificada ("aleta corta") de Aquatica Tropicals, Inc. En total se utilizaron 120 peces cebra. Fueron aclimatados a las condiciones de laboratorio durante aproximadamente 8 semanas en acuarios de 38 L antes de comenzar los experimentos. La temperatura del agua fue igual a la temperatura ambiente (~23 °C). Régimen de luz: 14 horas con luz (6:00-20:00), 10 horas sin luz. Los peces cebra se alimentaron tres veces al día: a las 8:00 con copos Tetra tropical; a las 12:00 con larvas vivas de artemia; a las 15:00 con copos Tetra tropical. En los días de los experimentos, los peces cebra solo se alimentaron con copos a las 8:00. Inmediatamente después de la segunda grabación, los peces cebra fueron eutanasiados con tricaina metanosulfonato (MS-222) a 300 mg/L.

Para el grupo control se utilizaron 14 cuartetos (es decir, grupos de cuatro pececillos cebra) (n = 14), y para el grupo con MK-801 se utilizaron 16 cuartetos (n = 16). Después de una exposición de 1 hora a 10 µM de MK-801 (comenzando a las 9:30) en recipientes de 1 L, los cuartetos se transfirieron a los recipientes de observación. La grabación comenzó inmediatamente (a las 10:30) y duró 20 min. Posteriormente, los pececillos cebra permanecieron en los recipientes durante 3,5 horas. Durante este período, se proporcionó aireación mediante un tubo conectado a una bomba de aire. A las 14:00 se realizó una segunda grabación de 20 min. El objetivo de las dos grabaciones fue estudiar los efectos de la habituación y/o la disminución de los efectos de las drogas (la semivida del MK-801 en ratas es de aproximadamente 2 horas28). Analizamos (1) las distancias sociales promedio (también llamadas distancias interindividuales11,29) como medida de cohesión social, (2) la distribución vertical en diez niveles de profundidad, (3) la distribución horizontal en cuatro zonas radiales (véase el recuadro de la Figura 24A para la ubicación de las zonas) y en cuadrantes (véase el recuadro de la Figura 24B para la ubicación de los cuadrantes), y (4) los tres componentes (x, y, z) de la distancia recorrida. Los datos se promediaron por cada grupo de peces. Después de que las pruebas de Shapiro-Wilks demostraron que no todas las variables se distribuían normalmente, se aplicaron pruebas U de Mann-Whitney para todas las variables con el fin de comparar las medias de los grupos control y con MK-801. Estas comparaciones se realizaron por separado para las sesiones matutinas y vespertinas. Se utilizó un valor de α = 0,05/4 = 0,0125, ya que se emplearon cuatro (grupos de) variables (véase arriba).

Figura 2A muestra un ejemplo típico de cuadro para peces cebra control y Figura 2B muestra un ejemplo típico de cuadro para peces cebra tratados con MK-801, ambos registrados durante la sesión matutina. Obsérvese que los peces cebra control estaban cerca del fondo, cerca de la pared frontal (es decir, el lado más cercano a la cámara) y permanecieron muy juntos (es decir, la cohesión social fue alta). En contraste, los peces cebra tratados con MK-801 estaban cerca de la superficie, no mostraron ninguna preferencia en el plano horizontal y nadaron a una distancia considerable unos de otros (es decir, la cohesión social fue baja). Figura 21 muestra trayectorias representativas. Los peces cebra control tuvieron una clara tendencia a permanecer en el lado frontal del recipiente de observación. Además, permanecieron cerca del fondo la mayor parte del tiempo. Los peces cebra tratados con MK-801, por otro lado, nadaron en cualquier lugar del plano horizontal. Sin embargo, tuvieron una clara preferencia por los niveles superiores de profundidad a las 10:30. A las 14:00, su distribución vertical se volvió más homogénea.

El análisis cuantitativo de los datos confirmó nuestra descripción. Figura 22A muestra que la distancia social promedio (es decir, las distancias interindividuales promedio entre los cuatro peces cebra de los cuartetos) fue en los peces cebra tratados con MK-801 más de tres veces mayor que en los peces cebra control durante la mañana (a las 10:30), con U = 0 y p<0.00001. Tras 3,5 horas de habituación (a las 14:00), la distancia social en los peces cebra control aumentó, mientras que permaneció más o menos sin cambios en los peces cebra tratados con MK-801. Sin embargo, siguió siendo significativamente diferente entre ambos grupos (U = 19, p<0.0005). Figura 22B muestra las líneas de tiempo de la distancia social para los dos grupos experimentales tanto a las 10:30 como a las 14:00.

La distribución vertical también fue muy diferente para ambos grupos. Figura 23 muestra que tanto por la mañana (10:30) como por la tarde (14:00), los peces cebra control pasaron la mayor parte del tiempo en los dos o tres niveles de profundidad más bajos (es decir, los niveles más cercanos al fondo del recipiente de observación). Por otro lado, los peces cebra tratados con MK-801 nadaron la mayor parte del tiempo cerca de la superficie del agua a las 10:30 (Figura 23A). Después de 3,5 hr de habituación, a las 14:00 se distribuyeron más o menos uniformemente en todos los niveles de profundidad.

La distribución horizontal también fue muy diferente para ambos grupos experimentales. En la Figura 24A se observa que los peces cebra tratados con MK-801 pasaron menos tiempo en la zona externa y más tiempo en las zonas media y central que los peces cebra del grupo control. Las diferencias entre los grupos con respecto a los cuadrantes fueron aún más evidentes (Figura 24B). Los peces cebra control mostraron una preferencia muy marcada por los dos cuadrantes frontales (1 y 4), es decir, el lado del recipiente más cercano a la cámara. Por el contrario, los peces cebra tratados con MK-801 se distribuyeron más o menos de manera uniforme en los cuatro cuadrantes.

En cuanto a los parámetros cinemáticos, limitamos aquí la discusión a la distancia recorrida (Figura 25). Los peces cebra tratados con MK-801 se desplazaron más que los peces cebra del grupo control. Curiosamente, esta diferencia fue especialmente significativa en la componente y de la distancia recorrida. Esta es la dirección de la cámara (véase la Figura 1). De hecho, los peces cebra del control permanecieron la mayor parte del tiempo cerca de la pared frontal, en los cuadrantes 1 y 4 (como se puede observar en las Figuras 24A y 24B). Por el contrario, los peces cebra tratados con MK-801 se movieron de un lado a otro entre las mitades frontal y posterior del recipiente.

Aquí, hemos presentado solo una muestra de las posibles formas de analizar los datos proporcionados por el experimento. En este punto, nos abstenemos de asignar ninguna interpretación biológica específica a los resultados. Sin embargo, vale la pena mencionar que se ha encontrado que MK-801 induce aislamiento social30 y reduce los comportamientos investigativos sociales en ratas31, y se ha estudiado como modelo para los síntomas negativos de la esquizofrenia30. Además, ha provocado hiperactividad31, comportamiento de giro en círculos32, deterioro sensorial33 y reducción de la inhibición del prepulso34 en mamíferos. Aunque no probamos específicamente estos deterioros, nuestros hallazgos parecen ser consistentes con ellos. Se requieren configuraciones experimentales más específicas para determinar si los efectos descritos de MK-801 en pez cebra son comparables a los descritos en mamíferos. También serían necesarios análisis y experimentos adicionales para decidir si la ansiedad, los problemas respiratorios, la desorientación espacial, el déficit de atención, la estereotipia etc. tuvieron roles significativos en los comportamientos alterados inducidos por MK-801 en el pez cebra.

Diagrama del montaje de medición óptica con cámara, computadora, cubo y espejo; estudio de fotónica.
Figura 1. Diagrama esquemático del aparato. La cámara captura cuadros (es decir, imágenes fijas) que muestran tanto la vista frontal como la vista superior del tanque de observación. Los cuadros se almacenan en la computadora para su posterior procesamiento. Obsérvese las posiciones de las dimensiones xyz, que son importantes para describir las características tridimensionales de los movimientos y ubicaciones del pez cebra. En nuestro experimento (véase Resultados Representativos), las dos paredes sombreadas en la figura (y el fondo del tanque) estaban pintadas de blanco, mientras que las otras dos paredes eran transparentes. Haga clic aquí para ver la imagen ampliada.

Experimento de comportamiento en acuario, dos acuarios con distribución de peces, configuración del estudio conductual.
Figura 2. Marcos de ejemplo. Obsérvese que las vistas frontal o superior por separado se caracterizan por una pérdida de información. Esto es especialmente evidente en el panel B, donde los tres peces cebra de la izquierda parecen estar muy próximos entre sí al observar la vista frontal, mientras que la vista superior muestra que esto no es cierto. Por otro lado, la vista superior no proporciona ninguna indicación sobre la distancia respecto al fondo. A) Peces cebra control. B) Peces cebra tratados con 10 µM de MK-801. Obsérvese que el color (azul) del fondo fue generado por el software de grabación y se eligió para obtener un buen contraste. El color real de las paredes trasera y lateral derecha, así como del fondo, era blanco. Haga clic aquí para ver la imagen ampliada.

Sistema de seguimiento del comportamiento de animales acuáticos; configuración del análisis de video; panel de calibración; proceso de monitoreo.
Figura 3. Alineación del espejo lateral. La flecha blanca de la izquierda indica la pared frontal (más cercana a la cámara) en el espejo lateral. Si son visibles dos líneas, corrija la posición del espejo lateral hasta que solo sea visible una línea (paso 1.2). Los 5 LED del panel de calibración son claramente visibles en las tres vistas. Tenga en cuenta que, dado que las luces de la cámara están encendidas, se observan muchos otros reflejos en el panel LED (paso 1.4). Haga clic aquí para ver la imagen ampliada.

Proceso de detección de partículas, cuadros marcados en rojo, diagrama de análisis óptico, condiciones de poca luz.
Figura 4. Etiquetado de los LED. El panel izquierdo muestra que las cinco etiquetas (numeradas del 0 al 4) identificadas mediante el procedimiento de calibración no coinciden con los LED reales. Además de los LED, pueden observarse otros puntos luminosos (en realidad reflexiones). En el panel derecho, la ganancia y el obturador se redujeron de manera que solo son visibles los LED. Ahora las cinco etiquetas se asignan correctamente (como se describe en los pasos 1.7-1.10). Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño.

Interfaz de software de seguimiento del comportamiento de animales acuáticos que muestra el control de la cámara y la configuración de calibración.
Figura 5. Recopilar información del recipiente. Se muestra la secuencia de los seis puntos que deben seleccionarse (haciendo clic derecho con el ratón). Las líneas se dibujarán automáticamente. Tenga en cuenta que los números indicados aquí no aparecen en la pantalla. Una vez finalizado, presione 'Recopilar información del recipiente' (como se describe en el paso 1.12). Haga clic aquí para ver la imagen en tamaño mayor.

Diagrama del experimento de hidrodinámica; configuración del tanque de dinámica de fluidos y flotabilidad; componentes anotados.
Figura 6. Volumen recolectado. Haga clic con el botón derecho del ratón en las ubicaciones indicadas que marcan las esquinas del cuerpo de agua: primero marque la esquina en la vista frontal y luego en la vista superior. A continuación, pase a la siguiente esquina (de 1 a 8). Tenga en cuenta que los ocho puntos marcan el contorno del cuerpo de agua, no el del tanque. También observe que al hacer clic con el botón derecho del ratón solo aparece 'x0', lo cual desaparecerá nuevamente al hacer clic en el siguiente punto (por lo tanto, los números 1-8 no aparecen realmente en la pantalla). El procedimiento se describe en el paso 1.17. Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño.

Configuración para el seguimiento del comportamiento de animales acuáticos con control de cámara, monitoreando el movimiento del animal en un tanque de agua.
Figura 7. Contraste sin corregir. La imagen está sobreexpuesta y el contraste entre el pez y el fondo (especialmente en la vista frontal) es bajo. Haga clic aquí para ver la imagen en tamaño mayor.

Configuración acuática con peces utilizada en el estudio de equilibrio estático; experimento en dinámica de fluidos.

Figura 8. Contraste corregido. El contraste ahora está mejorado en comparación con la Figura 7. Obsérvese que los colores en la pantalla son colores falsos. Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño.

Interfaz de configuración de la cámara para Bumblebee2 BB2-03S2C, que muestra ajustes de brillo, exposición y saturación.
Figura 9. Configuración general. Después de seleccionar 'Control de cámara' en el menú principal, se abre la ventana de 'Configuración general'. Deseleccione las casillas 'Obturador' y 'Ganancia' y use los controles deslizantes para encontrar el mejor contraste entre el pez y el fondo. Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño.

Interfaz gráfica de ajuste del balance de blancos de la cámara; controles deslizantes rojo/azul; optimización del procesamiento de imágenes.
Figura 10. Configuración de color. En la ventana de «Balance de blancos/Color», desactive la casilla «Auto» y utilice los controles deslizantes de «Rojo» y «Azul» para encontrar la mejor combinación que proporcione un buen contraste entre el pez y el fondo. Parámetros. Después de abrir el Módulo de trayectoria, seleccione el archivo experimental con «Ubicación de los datos» y luego abra la ventana de «Parámetros» mediante «Configuración del sistema». Aquí se asignan valores iniciales adecuados a los parámetros. Haga clic aquí para ver la imagen en tamaño mayor.

Interfaz del software de seguimiento del comportamiento de animales acuáticos; parámetros de calibración; configuración del análisis de video.
Figura 11. Parámetros. Después de abrir el Módulo de Trayectoria, seleccione el archivo experimental con ‘Ubicación de los datos’ y luego abra la ventana de ‘Parámetros’ con ‘Configuración del sistema’. Aquí se asignan valores iniciales adecuados a los parámetros. .Haga clic aquí para ver la imagen en tamaño mayor.

Configuración de seguimiento del comportamiento acuático, calibración del sistema 3D, interfaz del software, análisis de trayectorias.
Figura 12. Alineación de la caja. Observe cómo las cajas rojas de las vistas superior y frontal definen las áreas en las que podría encontrarse el pez. La caja de la izquierda se reduce a una línea para excluir esta área de la búsqueda. Haga clic aquí para ver la imagen ampliada.

Interfaz del software de seguimiento de animales acuáticos, que muestra la configuración de calibración y monitoreo para el análisis del comportamiento.

Figura 13. Asignaciones de etiquetas. Después de presionar el botón «Iniciar generación de trayectorias» y seleccionar el fotograma inicial (normalmente el fotograma n.º 0), se abre la ventana «Asignaciones de etiquetas». Presione «Avanzar paso a paso» hasta que la etiqueta («X0») aparezca en la pantalla. Si la etiqueta no está colocada sobre la imagen del pez, presione «No» hasta que quede colocada correctamente. Luego, presione «Aceptar». Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño.

Diagrama de análisis dinámico con vector de fuerza, concentración de tensiones; componentes etiquetados como A, B.
Figura 14. Pantalla de información. El panel (A) muestra la asignación correcta de la etiqueta. La etiqueta ('X0') se coloca sobre la imagen del pez en ambas vistas. Normalmente, una línea atraviesa la etiqueta. El panel (B) muestra ruido excesivo y ausencia de asignación de etiqueta. Los fotogramas se adquirieron a partir de la misma grabación modificando los umbrales de color y tamaño (en el paso 2.2) de 1.000-50 y 10-5, respectivamente. Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño.

Análisis de trayectoria 3D, diagrama vectorial que ilustra el movimiento de partículas en coordenadas cartesianas.
Figura 15. Representación tridimensional del camino reconstruido. El origen de las flechas se encuentra en la esquina frontal izquierda del tanque, a efectos de orientación (véase también la Figura 1). Así, en este ejemplo, el pez permanece cerca de la pared izquierda (relativa a la cámara). Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño.

Ventana de configuración de parámetros para suavizado de trayectoria; ajustes del filtro: umbrales de ruido, tamaño de ventana.
Figura 16. Suavizado de trayectoria. Esta ventana se abre tras pulsar el botón «Suavizado de trayectoria». Por ahora, acepte el valor predeterminado pulsando «Aceptar». Haga clic aquí para ver la imagen en tamaño mayor.

Diagrama de organización de archivos que muestra la transferencia de datos desde la carpeta "fish1" a la subcarpeta "Trajectories".
Figura 17. Subcarpetas. Se muestra arriba la carpeta generada durante la grabación. Después de la reconstrucción de la trayectoria, contiene las seis subcarpetas indicadas. Haga clic aquí para ver la imagen en tamaño mayor.

Datos numéricos en formato de texto para análisis estadístico.
Figura 18. Archivo suavizado. Se muestra la parte superior de un ejemplo de archivo point.smoothed, que indica el número de fotogramas, la duración de la grabación (en min), las coordenadas del centro del cuerpo de agua respecto a la cámara y, para cada fotograma, las coordenadas y la duración. Haga clic aquí para ver la imagen en tamaño mayor.

Interfaz del software de procesamiento de datos para analizar datos de trayectoria; configuración del proyecto y asignaciones de grupos.
Figura 19. Procesamiento de datos. Selección de los archivos que se analizarán (ventana derecha). Haga clic aquí para ver la imagen en tamaño mayor.

Interfaz de procesamiento de datos 3D de ABMT que muestra la configuración del análisis de inmovilidad para la evaluación de trayectorias.
Figura 20. Ejemplo de análisis. Los puntos finales de interés se pueden calcular seleccionándolos desde el menú. En este ejemplo, se seleccionó «Duración de la inmovilidad». El programa solicita introducir umbrales de velocidad y duración que definan la inmovilidad. El resultado se expresa como porcentaje de la duración total de la grabación. Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño.

Diagrama de análisis de locomoción, rastreando trayectorias en peces cebra control y con MK-801 a lo largo de intervalos de tiempo.
Figura 21. Trayectorias representativas. Se presentan dos trayectorias representativas para peces cebra control y dos trayectorias representativas para peces cebra tratados con 10 µM de MK-801, correspondientes a la sesión matutina que comienza a las 10:30 (fila superior) y a la sesión vespertina que comienza a las 14:00 (fila inferior). Las trayectorias de cada pez cebra dentro de cada cuarteto se representan con un color diferente. Sin embargo, obsérvese que podría haber ocurrido un intercambio de etiquetas. Se requiere corrección manual si es fundamental seguir las líneas individuales. El lado frontal izquierdo (origen de las flechas insertadas) del recipiente representado es el lado más cercano a la cámara (véase la Figura 1 para la posición del tanque). Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño.

Análisis de distancia social; gráfico; control frente al efecto de MK-801; resultados comparativos de sesiones; series temporales.
Figura 22. Distancia social promedio entre peces. A) Se presentan las distancias sociales promedio para peces cebra control y peces cebra tratados con 10 µM MK-801 durante las sesiones matutinas y vespertinas. Se muestran la media y el error estándar de la media (S.E.M.). ***, p<0.001. B) Se presentan las líneas de tiempo de la distancia interindividual promedio para ambos grupos. Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño.

Análisis de profundidad; gráfico multivariado; comparación entre control y MK-801; porcentaje de tiempo frente a niveles de profundidad.
Figura 23. Distribución por profundidad. A) Distribución de los peces cebra en diez niveles de profundidad iguales (siendo el nivel 1 el más cercano al fondo) durante la sesión matutina. B) Distribución de los peces cebra durante la sesión vespertina. Se muestran la media y el error estándar de la media (S.E.M.). *, p<0.0125; **, p<0.005; ***, p<0.001. Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño.

Gráfico de proporción temporal por zona radial y cuadrante; análisis de datos; resultados del experimento psicológico.
Figura 24. Distribuciones horizontales. (A) Se presenta la distribución temporal en las cuatro zonas radiales de los grupos experimentales. El recuadro muestra la ubicación de las zonas desde el centro hacia la periferia: zonas central, media, externa y zonas de esquina combinadas. (B) Se presenta la distribución temporal en los cuatro cuadrantes de los grupos experimentales. El recuadro muestra la ubicación de los cuadrantes. Las paredes indicadas con líneas dobles representan paredes blancas, mientras que las representadas con líneas simples corresponden a paredes transparentes. La cámara se encuentra a la izquierda del recuadro, es decir, más cercana a los cuadrantes 1 y 4 (véase también la Figura 1). Se muestran la media y el error estándar de la media (S.E.M.). Los asteriscos negros indican comparaciones entre los grupos para la sesión matutina y los asteriscos grises para las sesiones vespertinas: *, p<0,0125; **, p<0,005; ***, p<0,001. Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño.

Gráfico de equilibrio estático; distancia recorrida vs. coordenadas; control vs. MK-801; análisis de datos.
Figura 25. Distancia recorrida. Se muestran las componentes xyz de la distancia recorrida por los peces cebra durante las sesiones matutinas y vespertinas. Se presentan la media y el error estándar de la media (S.E.M.). Los asteriscos negros indican comparaciones entre los grupos para la sesión matutina y los asteriscos grises para las sesiones vespertinas: *, p<0.0125; ***, p<0.001. Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño.

Discusión

El procedimiento experimental que se muestra aquí permite registrar peces cebra individuales, parejas de peces cebra (por ejemplo , para estudiar el apareamiento o la agresión) y cardúmenes de peces cebra (como se muestra en el ejemplo representativo). El sistema es especialmente adecuado para obtener simultáneamente información sobre la distribución 3D (vertical y horizontal), las características cinemáticas (por ejemplo, velocidad, aceleración, ángulo de giro) y los parámetros sociales (por ejemplo, la cohesión social). A continuación, enumeramos algunos temas importantes a considerar al planificar experimentos.

Dependiendo del procedimiento experimental, se pueden estudiar diferentes sistemas de comportamiento. Por ejemplo, para explorar la neofobia (es decir, el miedo a nuevos entornos), la grabación debe iniciarse inmediatamente después de introducir el pez cebra en el tanque de observación (después de esperar unos segundos a que el agua se asiente para disminuir el ruido), sin habituación previa11,17,37. Por otro lado, algunos temas de investigación pueden requerir que el pez cebra esté bien habituado, por ejemplo, al estudiar los efectos de las feromonas de alarma16. Al estudiar grupos de peces cebra, el experimentador debe tener en cuenta que, aunque el software minimiza el cambio de etiquetas, en este momento no es posible seguir al pez cebra individual en todo momento. Esto tampoco es importante para los estudios de cardúmenes donde el énfasis está en la cohesión social, pero sería crucial cuando se explora la agresión o el apareamiento. La reasignación manual de etiquetas es una opción, pero puede llevar mucho tiempo.

El color de las paredes del contenedor de observación y de la cámara de observación puede tener una gran influencia en el comportamiento del pez cebra. Por ejemplo, se ha descrito que las paredes blancas inducen respuestas de aversión36, 37. Al probar diferentes colores, tenga en cuenta dos cosas: 1) es importante que la pared frontal (es decir, la pared más cercana a la cámara) permanezca transparente y que una tapa (si se usa una) también debe ser transparente; 2) Al seleccionar un color nunca antes utilizado, primero determine si el contraste entre el pez cebra y el fondo es apropiado para grabar. Haz una prueba. Cambiar la configuración de la cámara para grabar (ganancia, obturador, rojo y azul, como se explica en los pasos 2.5 y 2.6) y la configuración para la reconstrucción de la trayectoria (por ejemplo, umbrales de color y tamaño, como se explica en los pasos 3.3, 3.5, 3.11 y 3.12) puede marcar una gran diferencia. Una vez más, la experiencia con el sistema contribuirá en gran medida a decidir qué es posible.

Dependiendo del propósito del experimento, podría ser deseable una fuente de luz con diferentes características (por ejemplo, espectro, intensidad). Las barras LED se pueden reemplazar fácilmente. Asegúrese de que la luz llegue a todas las partes del recipiente.

Si el experimento requiere que el pez cebra permanezca en el recipiente de observación durante varias horas, asegúrese de proporcionar aireación. Se puede conectar un tubo de aire a la esquina trasera derecha con un clip. Verifique en la pantalla de la computadora que el clip no interfiera con la grabación, es decir, que el pez cebra no se oculta en ningún momento a la vista. En las figuras 2A y 2B , el clip negro se puede ver en la vista superior. Idealmente, la aireación debe proporcionarse antes o entre grabaciones, pero no durante la grabación para evitar el ruido. También tenga en cuenta que activar o desactivar la aireación fuerte puede asustar al pez cebra.

Si el experimento requiere mantener el pez cebra en el recipiente durante la noche, es útil cubrir la cámara de observación con una tapa transparente para evitar que el pez cebra salte (lo cual es una ocurrencia muy común). Si no se quita la cubierta antes de grabar (para no molestar al pez cebra), tenga en cuenta los dos puntos siguientes: 1) asegúrese de que las imágenes especulares de las fuentes de luz no obstruyan la grabación (por ejemplo, cambiando las fuentes de luz o eligiendo una tapa que refleje la luz solo mínimamente); 2) tenga en cuenta que la tapa puede empañarse cuando se usa durante la noche, especialmente porque en este caso también se debe proporcionar aireación; Una forma de reducir esto es elegir una tapa con pequeños agujeros.

Para algunos experimentos, podría ser esencial determinar el comportamiento de referencia del pez cebra antes de administrar un medicamento. En este caso, el medicamento se puede agregar entre sesiones por medio de un tubo (similar al tubo de aireación discutido anteriormente).

Aunque aquí se centró el registro del pez cebra (Danio rerio), otras especies de peces, por supuesto, también se pueden registrar con el sistema. Se ha utilizado para estudiar comportamientos en peces dorados (juveniles) (Carassius auratus), barbo tigre (Barbus tetrazona) y cola de espada verde (Xiphophorus helleri).

Finalmente, debe tenerse en cuenta que otras dimensiones de los tanques de observación son principalmente posibles. Sin embargo, requeriría reconfigurar el sistema y encontrar un buen equilibrio entre la resolución espacial y temporal cuando se utilizan contenedores de observación mucho más grandes. Además, la forma del recipiente debe ser cuboide. El número de peces cebra u otros sujetos experimentales es teóricamente ilimitado; sin embargo, el intercambio de etiquetas aumenta con el número de sujetos.

Divulgaciones

Hans Maaswinkel, Liqun Zhu y Wei Weng son empleados de xyZfish, Ronkonkoma NY, que produce el sistema de seguimiento utilizado en este artículo.

Agradecimientos

Los autores no tienen agradecimientos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Hardware de seguimiento AABT-3DxyZfishAABT IIIncluye cámara, tarjeta de video, compartimento de observación con espejo e iluminación
AABT-3D Equipo de calibraciónxyZfishcalibContiene panel de calibración y espejo lateral
AABT-3D Contenedores de observaciónxyZfishcubos 
AABT-3D Software de seguimientoxyZfishv.1.0 
ComputadoraopcionalN/AWindows XP o superior
(+)-MK-801 maleato de hidrógenoSigmaM107 
Bomba de aireFusion500 
Tubo de línea de aire de 3/16"Lee' s Productos para acuarios y mascotas14508 
Clips de carpeta medianosOfficeDepot 561339Para fijar la línea de aire al contenedor de observación

Referencias

  1. Brennan, C. H. Zebrafish behavioural assays of translational relevance for the study of psychiatric disease. Rev. Neurosci. 22, 37-48 (2011).
  2. Kabashi, E., Brustein, E., Champagne, N., Drapeau, P. Zebrafish models for the functional genomics of neurogenetic disorders. Biochim. Biophys. Acta. 1812, 335-345 (2011).
  3. McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth. Defects. Res. C. Embryo Today. 93, 67-114 (2011).
  4. Kurta, A., Palestis, B. Effects of ethanol on the shoaling behavior of zebrafish (Danio rerio). Dose-Response. 8, 527-533 (2010).
  5. Sison, M., Gerlai, R. Behavioral performance altering effects of MK-801 in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain Res. 220, 331-337 (2011).
  6. Delcourt, J., Denoël, M., Ylieff, M., Poncin, P. Video multitracking of fish behaviour: a synthesis and future perspectives. Fish Fish. 14, 186-204 (2013).
  7. Zhu, L., Weng, W. Catadioptric stereo-vision system for the real-time monitoring of 3D behavior in aquatic animals. Physiol. Behav. 91, 106-119 (2007).
  8. System for 3D monitoring and analysis of motion behavior of targets. US patent. , 8306260 (2012).
  9. Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6, e17597(2011).
  10. Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. The immediate and the delayed effects of buspirone on zebrafish (Danio rerio) in an open field test: a 3-D approach. Behav. Brain Res. 234, 365-374 (2012).
  11. Maaswinkel, H., Le, X., He, L., Zhu, L., Weng, W. Dissociating the effects of habituation, black walls, buspirone and ethanol on anxiety-like behavioral responses in shoaling zebrafish. A 3D approach to social behavior. Pharmacol. Biochem. Behav. 108, 16-27 (2013).
  12. Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. The advantages of a 3D-automatic recording system for the study of shoaling behavior in zebrafish. 10th International Conference Zebrafish Development and Genetics, Madison, , (2012).
  13. Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. An automatic recording system to quantify antagonistic interactions between zebrafish. Abstract. 10th International Conference Zebrafish Development and Genetics, Madison, , (2012).
  14. Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol. Rev. Camb. Phil. Soc. 83, 13-34 (2008).
  15. Krause, J., Hartmann, N., Pritchard, V. L. The influence of nutritional state on shoal choice in zebrafish, Danio rerio. Anim. Behav. 57, 771-775 (1999).
  16. Speedie, N., Gerlai, R. Alarm substance induced behavioral responses in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain Res. 188, 168-177 (2008).
  17. Gebauer, D. L., Pagnussat, N., Piato, A. L., Schaeffer, I. C., Bonan, C. D., Lara, D. R. Effects of anxiolytics in zebrafish: similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and. 99, 480-486 (2011).
  18. Paull, G. C., Filby, A. L., Giddins, H. G., Coe, T. S., Hamilton, P. B., Tyler, C. R. Dominance hierarchies in zebrafish (Danio rerio) and their relationship with reproductive success. Zebrafish. 7, 109-117 (2010).
  19. Engeszer, R. E., Ryan, M. J., Parichy, D. M. Learned social preference in zebrafish. Curr. Biol. 14, 881-884 (2004).
  20. Mathur, P., Guo, S. Use of zebrafish as a model to understand mechanisms of addiction and complex neurobehavioral phenotypes. Neurobiol. Dis. 40, 66-72 (2010).
  21. Tropepe, V., Sive, H. L. Can zebrafish be used as a model to study the neurodevelopmental causes of autism. Genes Brain Behav. 2, 268-281 (2003).
  22. Echevarria, D. J., Hammack, C. M., Pratt, D. W., Hosemann, J. D. A novel behavioral test battery to assess global drug effects using zebrafish. Int. J. Comp. Psychol. 21, 19-34 (2008).
  23. Seibt, K. J., Piato, A. L., Luz Oliveira, da, Capiotti, R., Vianna, K. M., R, M., Bonan, C. D. Antipsychotic drugs reverse MK-801 induced cognitive and social interaction deficits in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain. Res. 224, 135-139 (2011).
  24. Zou, H., et al. Low dose MK-801 reduces social investigation in mice. Pharmacol. Biochem. Behav. 90, 753-757 (2008).
  25. Ng, M. C., Hsu, C. P., Wu, Y. J., Wu, S. Y., Yang, Y. L., Lu, K. T. Effect of MK-801-induced impairment of inhibitory avoidance learning in zebrafish via inactivation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) in telencephalon. Fish Physiol. Biochem. 38, 1099-1106 (2012).
  26. Sison, M., Gerlai, R. Associative learning performance is impaired in zebrafish (Danio rerio) by the NMDA-R antagonist MK-801. Neurobiol. Learn. Mem. 96, 230-237 (2011).
  27. Swain, H. A., Sigstad, C., Scalzo, F. M. Effects of dizocilpine (MK-801) on circling behavior, swimming activity, and place preference in zebrafish (Danio rerio). Neurotox. Teratol. 26, 725-729 (2004).
  28. Vezzani, A., et al. Kinetics of MK-801 and its effect on quinolinic acid-induced seizures and neurotoxicity in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 249, 278-283 (1989).
  29. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. J. Neurosci. Methods. 210, 266-271 (2012).
  30. Rung, J. P., Carlsson, A., Rydén Markinhuhta, K., Carlsson, M. L. (+)-MK-801 induced social withdrawal in rats; a model for negative symptoms of schizophrenia. Prog. Neuro-psychopharmacol. Biol. Psych. 29, 827-832 (2005).
  31. Gururajan, A., Taylor, D. A., Malone, D. T. Cannabidiol and clozapine reverse MK-801-induced deficits in social interaction and hyperactivity in Sprague-Dawley rats. J. Psychopharmacol. 226, 1317-1332 (2012).
  32. Burket, J. A., Cannon, W. R., Jacome, L. F., Deutsch, S. I. MK-801, a noncompetitive NMDA receptor antagonist, elicits circling behavior in the genetically inbred Balb/c mouse strain. Brain Res. Bull. 83, 337-339 (2010).
  33. Saunders, J. A., Gandal, M. J., Roberts, T. P., Siegel, S. J. NMDA antagonist MK801 recreates auditory electrophysiology disruption present in autism and other neurodevelopmental disorders. Behav. Brain Res. 234, 233-237 (2012).
  34. Brosda, J., et al. Pharmacological and parametrical investigation of prepulse inhibition of startle and prepulse elicited reactions in Wistar rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 99, 22-28 (2011).
  35. Wong, K., et al. Analyzing habituation responses to novelty in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain Res. 208, 450-457 (2010).
  36. Maximino, C., et al. Parametric analyses of anxiety in zebrafish scototaxis. Behav. Brain Res. 210, 1-7 (2010).
  37. Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7, e36931(2012).

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