La presentación en fagos es una técnica poderosa para capturar las proteínas o restos de proteínas que interactúan con una molécula inmovilizada de interés. Una vez que se ha tomado una decisión del tipo de fago biblioteca de cDNA para crear y pantalla, el protocolo aquí descrito permite la selección por afinidad eficaz que conduce a la identificación de los interactores.
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Artículo de método
Un Protocolo de fagos y de selección de afinidad utilizando cebos proteína recombinante
En este artículo
Resumen
Resumen
Uso de fago recombinante como un andamio para presentar diversas porciones de proteínas codificadas por una biblioteca de ADNc clonado direccionalmente a las moléculas inmovilizadas de cebo es un medio eficaz para descubrir las interacciones. La técnica ha sido ampliamente utilizado para descubrir las interacciones proteína-proteína, pero la molécula cebo a ser cuestionada no tiene que ser restringida a las proteínas. El protocolo que aquí se presenta ha sido optimizado para permitir un modesto número de cebos que se proyectarán en réplicas de maximizar la identificación de clones independientes que presentan la misma proteína. Esto permite una mayor confianza en que interactúan las proteínas identificadas son interactores legítimos de la molécula de cebo. Control de la titulación del fago después de cada ronda de selección por afinidad proporciona información sobre cómo la selección por afinidad está progresando, así como sobre la eficacia de los controles negativos. Un medio de titulación de los fagos, y cómo y qué preparar con antelación para permitir que este proceso progrese lo más eficientementeposible, se presenta. Atributos de amplicones obtenidos después del aislamiento de la placa independiente se destacan que se puede utilizar para determinar lo bien que la selección por afinidad ha progresado. Se explican las técnicas de solución de problemas para minimizar los falsos positivos o de eludir persistentemente recuperó fago. Los medios para reducir la contaminación viral brote se discuten.
Introducción
¿Por qué utilizar la presentación en fagos y selección por afinidad en vez de las otras técnicas disponibles para miles de descubrir e investigar las interacciones de proteínas con otras moléculas? La presentación en fagos puede reclamar algunas ventajas únicas sobre otros métodos de detección de interacciones proteína-ligando de 1-3, incluyendo lo siguiente:
Muy amplio repertorio de moléculas de cebo
La razón más importante es en la diversidad de moléculas capaces de actuar como cebo en la selección por afinidad 4. La presentación en fagos es un medio muy poderoso para aislar fragmentos de ....
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Protocolo
Una representación gráfica de la procedimiento descrito a continuación (Figura 1) pone de relieve los dos componentes principales para la selección por afinidad utilizando una biblioteca de presentación de fagos: A) una biblioteca de ADNc de presentación en fagos probable que codifican proteínas con afinidad por el cebo y, b) un cebo recombinante purificada proteína. La producción de cebo (proteína recombinante) ha sido ampliamente examinado y literatura delineando las mejores prácticas para asegurar proteína recombinante soluble, activa a partir de E. 12-13 coli, levadura eucariota 14, insecto 15-16,
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Resultados
Ser capaz de poner en peligro la capacidad de la carnada para interactuar con las proteínas en fagos (metabólicamente envenenando el cebo) proporciona un control negativo potente para esta técnica. También es aconsejable para determinar si el cebo, cuando se une a la placa de microtitulación así, conserva su función. Ambos controles aumentará la confianza que interactúan, las proteínas en fagos recuperados por el cebo nonpoisoned son legítimas.
Muestreo tres triplicado de cada pocillo aument.......
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Discusión
Mediante la ejecución del experimento en tres pocillos replicados, fago adquirido de forma independiente de la misma proteína de unión al cebo puede distinguirse incluso si son del mismo clon (es decir, no hay diferencia en la secuencia de nucleótidos de la región de CDS que ha sido adquirida, pero estos han sido recuperados de pozos independientes). De lo contrario, la única manera de distinguir entre el fago que codifica la misma proteína de unión a la carnada es si son independientemente inversa regiones tra.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este proyecto fue parcialmente financiado por un IOS NSF (0849230); Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), Fondo Semilla USDA (2011 a 04375), y Sir Frederick McMaster de Becas de Investigación de ABD.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Triptona | Becton Dickinson Co. | ||
| Extracto de levadura | Becton Dickinson | 212750 | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Cloruro de sodio | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Agarose | Research Products International | A20090 | |
| Reactivo de bloqueo | EMD Chemicals Inc. | 69064 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Hidróxido de sodio | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Dodecil sulfato de sodio | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Cloroformo | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Escherichia coli BLT5403 | EMD Chemicals Inc. | BLT5403 | Genotipo: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)Ampicilina |
| , Sal de sodio | Research Products International | A40040 | |
| Bromuro de etidio | Fisher Scientific | BP102-1 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich Corp. | A-9647 | |
| Anticuerpo primario Penta-HIS | Qiagen Inc. | 34660 | |
| Conjugado de fosfatasa alcalina anti-ratón de cabra | Sigma-Aldrich Corp. | A-5153 | |
| para-Nitrofenilfosfato | Sigma-Aldrich Corp. | N-7653 | |
| Imprimación T7-UP | EMD Chemicals Inc. | 5'-GGAGCTGTCGTCCAGTC-3'T7-DOWN | |
| imprimación | EMD Chemicals Inc. | 5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick | |
| PCR Kit de purificación | Qiagen Inc. | 28104 | |
| Kit de extracción de gel Qiaquick | Qiagen Inc. | 28706 | |
| Big Dye Terminator v3.1 Kit de secuenciación de ciclo | Invitrogen Life Technologies | 4336917 | |
| Bloque calefactor | Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) | 18780 | |
| Placas de cultivo celular de 96 pocillos | Corning | Costar 3590 | |
| Isotemp Incubadora Horno | Fisher Scientific | 516D | |
| Pasteur Pipetas, 5 ¾ en | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ChromaView Transilluminator | UVP Inc. | TS-15 | |
| UV Shield | Oberon | 071AF | |
| Guantes, Nitrilo | Fisher Scientific | 19-170-010C | |
| Tubos estériles de 1,5 ml | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| Pipetas de borosilicato de 10 ml Fisher | Scientific | 13-678-25E | |
| Tubos de cultivo de borosilicato | Fisher Scientific | 14-961-27 | |
| Uniskan I, lector de placas ELISA | Labsystem y Flow Laboratories, Helsinki, Finlandia | Tipo 362 |
Referencias
- Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
- Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
- Li, W.
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Reimpresiones y permisos
