Un Protocolo de fagos y de selección de afinidad utilizando cebos proteína recombinante

Summary

La presentación en fagos es una técnica poderosa para capturar las proteínas o restos de proteínas que interactúan con una molécula inmovilizada de interés. Una vez que se ha tomado una decisión del tipo de fago biblioteca de cDNA para crear y pantalla, el protocolo aquí descrito permite la selección por afinidad eficaz que conduce a la identificación de los interactores.

Abstract

Uso de fago recombinante como un andamio para presentar diversas porciones de proteínas codificadas por una biblioteca de ADNc clonado direccionalmente a las moléculas inmovilizadas de cebo es un medio eficaz para descubrir las interacciones. La técnica ha sido ampliamente utilizado para descubrir las interacciones proteína-proteína, pero la molécula cebo a ser cuestionada no tiene que ser restringida a las proteínas. El protocolo que aquí se presenta ha sido optimizado para permitir un modesto número de cebos que se proyectarán en réplicas de maximizar la identificación de clones independientes que presentan la misma proteína. Esto permite una mayor confianza en que interactúan las proteínas identificadas son interactores legítimos de la molécula de cebo. Control de la titulación del fago después de cada ronda de selección por afinidad proporciona información sobre cómo la selección por afinidad está progresando, así como sobre la eficacia de los controles negativos. Un medio de titulación de los fagos, y cómo y qué preparar con antelación para permitir que este proceso progrese lo más eficientementeposible, se presenta. Atributos de amplicones obtenidos después del aislamiento de la placa independiente se destacan que se puede utilizar para determinar lo bien que la selección por afinidad ha progresado. Se explican las técnicas de solución de problemas para minimizar los falsos positivos o de eludir persistentemente recuperó fago. Los medios para reducir la contaminación viral brote se discuten.

Introduction

¿Por qué utilizar la presentación en fagos y selección por afinidad en vez de las otras técnicas disponibles para miles de descubrir e investigar las interacciones de proteínas con otras moléculas? La presentación en fagos puede reclamar algunas ventajas únicas sobre otros métodos de detección de interacciones proteína-ligando ^{de 1-3,} incluyendo lo siguiente:

Muy amplio repertorio de moléculas de cebo

La razón más importante es en la diversidad de moléculas capaces de actuar como cebo en la selección por afinidad ^4. La presentación en fagos es un medio muy poderoso para aislar fragmentos de proteínas que interactúan con otras proteínas, nucleótidos, carbohidratos, etc ⁵ Esencialmente, si un polímero / molécula puede estar unido a un soporte recuperable, que puede ser examinado para afinidad con las proteínas mostradas de fagos. Además, la molécula de cebo se puede acceder para determinar si se retiene la actividad biológica cuando se inmoviliza ^6, si las condiciones utilizadas para reducir / eliminar su actividad son eficaces o ^6, de introducir modificaciones después de la traducción a la carnada antes de la selección por afinidad.

Resistencia a los fagos a factores externos

Una segunda razón para el uso de presentación en fagos, es que es posible que algunos cebos pueden requerir estrés ambiental (calor, altas concentraciones osmolíticas, cofactores específicos, etc.) Para capturar sus proteínas que interactúan, o las proteínas que se muestran fagos puede necesitar ser alterado de alguna manera antes de la selección por afinidad. El factor principal que se está estudiando es la interacción entre la proteína cebo y, no la condición de que permite la interacción que se produzca o si es letal para el organismo de prueba. El fago T7 está particularmente bien adaptado a este tipo de estudios, ya que puede soportar condiciones experimentales duras tanto intactas y viables (por ejemplo, el máximo térmico publicado para la viabilidad de T7 es de ~ 60 ° C ^7). Como un ejemplo de fago que altera la muestra Proproteínas, al examinar el proteoma de semillas de Arabidopsis thaliana para sustratos de proteína de la enzima reparadora, Proteína Isoaspartyl metil transferasa (PIMT), el virus usado en estos estudios habían sido "abierto" durante una semana, antes de cada ronda de selección por afinidad, para fomentar la introducción de isoaspartate (isoAsp) los residuos en las proteínas susceptibles ⁶ que no es posible en los organismos que pueden reconocer y reparar / metabolizar tales anomalías.

Metabólicamente inerte

Además, el fago son generalmente resistentes a venenos metabólicos y interferir moléculas pequeñas que, por lo menos, dar lugar a efectos pleiotrópicos sobre los organismos de prueba metabólicamente activas. Tras los lavados de rigurosidad, el veneno se elimina antes de que un gran volumen de bacterias se introducen para la infección de modo que el veneno se diluye a una gama inocuo para las bacterias o la replicación del fago posterior. Mientras investiga dianas proteicas de la reparación PIMTenzima, S-adenosil metionina (AdoMet) se utiliza para activar la enzima de microtitulación-placa-así inmovilizado para permitir la captura de la proteína diana mientras que confían en S-adenosil homocisteína (AdoHcy) para inactivar la enzima y proporcionar un control negativo útil en asegurar el conocimiento de que el virus no se vería influenciada negativamente por cualquiera AdoMet o AdoHcy ^6. Además, los miembros de ciertas familias de la embriogénesis tardía abundante de proteínas (LEA), investigados en este laboratorio, se sabe que altera su forma en presencia de aditivos tales como sacarosa ^8, que pueden alcanzar concentraciones de hasta 200 mm de semillas de soja en el punto de madurez fisiológica ^9. No se prevé que el virus sea influenciado por adición de sacarosa 200 mM en cada ronda de selección por afinidad, posiblemente necesario para determinadas interacciones de proteínas de LEA-cliente, que no es el caso de organismos de ensayo viables autónoma ^10.

Esta práctica de laboratorio se ha centrado en DESCUBRIRg interacciones proteína-proteína en semillas maduras, deshidratados o en germinación que subyacen en el mecanismo de protección proteoma almacenado durante la deshidratación ¹¹ o la reparación de componentes de la proteoma almacenado que son susceptibles a la formación isoAsp una vez que la semilla ha embebido ^6. Por lo tanto, la producción y purificación de las proteínas recombinantes requeridos como cebo en un estado activo, y la garantía de que se mantengan así, antes y después de que se inmovilizan, aunque con frecuencia difícil, es una piedra angular de nuestro trabajo. Sin embargo, a medida que cada escenario de producción de proteínas recombinantes es diferente, las condiciones para la optimización de la producción de proteína recombinante no se abordan aquí. Se insta a los usuarios a intentar, siempre que sea posible, para determinar si la proteína inmovilizada es aún funcional (por ejemplo, si se trata de una enzima, hacer un ensayo enzimático en los pocillos de la placa de microtitulación). Esto proporciona cierta confianza en que el cebo es biológicamente activo y por lo tanto, que cualquier interacción descubiertos sonalgo más propensos a tener relevancia biológica.

Protocol

Una representación gráfica de la procedimiento descrito a continuación (Figura 1) pone de relieve los dos componentes principales para la selección por afinidad utilizando una biblioteca de presentación de fagos: A) una biblioteca de ADNc de presentación en fagos probable que codifican proteínas con afinidad por el cebo y, b) un cebo recombinante purificada proteína. La producción de cebo (proteína recombinante) ha sido ampliamente examinado y literatura delineando las mejores prácticas para asegurar proteína recombinante soluble, activa a partir de E. ^12-13 coli, levadura eucariota ^14, insecto ^15-16, planta ^{17 a 18} o ^{19 a 20} células de mamíferos abundan.

En el siguiente protocolo, un hexahistidyl etiquetada proteína recombinante se ha usado como cebo. Esto permite la verificación de que las proteínas cebo permanecen en los pozos después de la incubación y el lavado de los pasos durante la noche.

1. ELISA para la retención de proteínas recombinantes en los pocillos de microtitulación Plate

1. Marcar unaplaca de microtitulación con tinta permanente, y que designan los pozos que contienen concentraciones de proteína. Realice esto en 3 repeticiones de pozos. Incluya 3 repeticiones de una serie de concentraciones de control negativo (proteína no hexahistidyl-etiquetado; BSA funciona bien ya que esta verificación de antecedentes).
2. Lavar la placa extensivamente con agua y eliminar el agua por el chasquido de la placa invertida sobre 4 capas de toallas de papel entre cada lavado.
3. Inmovilizar, en los primeros 3 pocillos, en 100 l de Tris, pH 7,5, (o tampón de elección) la concentración más alta de la proteína recombinante (10 mg / ml). Añadir a los próximos tres pozos de la proteína recombinante a (1,0 g / ml), etc, hasta 1,0 ng / ml. Haga lo mismo con la serie de concentración de BSA.
4. Cubra los platos con papel plástico y dejar toda la noche a 4 ° C.
5. A la mañana siguiente, eliminar la proteína a bofetadas plato boca abajo en 4-5 capas de toallas de papel.
6. Se lavan los pocillos 5x con 200 l de TBS 1x cada vez, dejando el tampónen los pozos de ~ 1 min cada vez y retirar el tampón de lavado a bofetadas la placa boca abajo sobre las toallas de papel después de cada lavado.
7. Bloquear la placa de ELISA en un agitador rotatorio usando 200 l 5% (w / v) de BSA o 200 l 5% (w / v) de reactivo de bloqueo en TBS a temperatura ambiente durante 2 horas (o sentado durante la noche estacionaria a 4 ° C si es conveniente ) envuelto en una envoltura de plástico.
8. Retire el exceso de solución de bloqueo a bofetadas la placa boca abajo sobre toallas de papel. Lave 4x 1 min cada vez con 200 l de 1x TBS, la eliminación de la solución de lavado a bofetadas el plato boca abajo.
9. Diluir penta-HIS anticuerpo primario 1/2, 000 en tampón de bloqueo y entregar 100 l a cada pocillo. Incubar 1-2 horas a temperatura ambiente con la placa estacionaria.
10. Retire el anticuerpo primario a bofetadas la placa boca abajo sobre toallas de papel. Lavar 4x 1 min cada vez con 200 l de 1x TBST. Retire cada lavado a bofetadas el plato boca abajo.
11. Diluir el anticuerpo secundario(De cabra anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina), en tampón de bloqueo y se incuba 100 l en cada pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente con la placa estacionaria.
12. Retire el anticuerpo secundario a bofetadas la placa boca abajo sobre toallas de papel. Lavar 4x 1 min cada vez con 200 l de 1x TBST. Retire cada lavado a bofetadas el plato boca abajo.
13. Coloque 200 l de solución de sustrato para-nitrofenilfosfato (pNPP) en cada pocillo. El sustrato es un sólido a -20 º C para hacer alícuotas y recuperar el número requerido de alícuotas necesarias para la detección del congelador con suficiente antelación de manera que esté completamente descongelado por esta etapa.
14. A los 30 minutos detener la reacción mediante la adición de 50 l de 3 M de NaOH a cada pocillo.
15. Leer la absorbancia a 405 nm inmediatamente en el lector de placas de ELISA.

Nota: Si la proteína recombinante de interés no adherirse a los pozos, es posible alterar ªla Composición E / pH del tampón considerablemente (tampón carbonato pH 10,0) o añadir agentes caotrópicos (urea) para intentar ayudar a proteína de unión a los pocillos de la placa de microtitulación. Sin embargo, el restablecimiento de la que la proteína recombinante: 1) permanece unido a los pocillos de la placa de microtitulación en las condiciones para la selección de afinidad y, se recomienda 2) mantiene su actividad biológica después de la retirada del pH alto / caotropo.

2. Crecimiento bacteriano Host (BLT5403) para Titulación

1. Autoclave (Figura 2A) diez frascos de 250 ml Erlenmeyer y 3 tubos de cultivo. Hacer LB líquido y agar LB para verter placas de medio sólido. Fresca de agar LB a 50 ° C y se añade ampicilina a 100 mg / ml antes de asépticamente vierten en placas de Petri en una campana de flujo (Figura 2B).
2. También en una campana de flujo (Figura 2B) consecutivas una LB, 100 g / ml de ampicilina (LB ^AMP100) placa de agar para colonias individuales de BLT5403 de acción mantuvo en 15% (v / v)glicerol a -80 ° C (Figura 2C). Coloque la placa boca abajo a 37 ° C durante la noche en una incubadora para el crecimiento (Figura 2D).
3. En la mañana, inocular 50 ml de LB ^AMP100 en un matraz Erlenmeyer de 250 ml con una sola colonia extraído desde la placa. Incubar a 37 ° C, 200 rpm en un agitador horizontal (figuras 2E y 2F), y el uso de un espectrofotómetro para controlar la densidad de células a una DO ₆₀₀ = 0,5 a 0,6 (Figura 2H).
4. Vierta las células en un tubo Falcon de 50 ml o similares, y mantenga a 4 ° C hasta su uso (Figura 2G). Las células generalmente seguirán siendo viables durante aproximadamente 1 semana.
5. Hacer 500 ml LB, colóquela en un matraz Fernbach desconcertado y autoclave ella. Una vez que es estéril, coloque el frasco a 4 ° C (Figura 2 G) o la temperatura ambiente hasta que la noche del "primer día" a continuación.

Nota: El anfitrión células bacterianasBLT5403, expresando una fuente plásmido transmitidas de la proteína de la cápside nativa de T7 sin que los vectores bajo número de copias de T7 mediados de, y no pueden replicarse con éxito, son extremadamente susceptibles al virus. Es imprescindible para evitar la contaminación. La contaminación eventualmente se producirá momento en el que todas las superficies en contacto con los / las bacterias infectadas por el virus se deben limpiar con 70% (v / v) de etanol o frotar con detergente (Figura 2I). Si este no es eficaz, se requiere una descontaminación completa de todas las superficies que pueden soportar Envirocide (Figura 2J). Comience BLT5403 células del congelador acción cada nueva ronda de selección por afinidad para ayudar a mitigar la contaminación de las acciones de 4 ° C, y aseguran las células vigorosas están siendo utilizados en el protocolo. Puntas de pipeta de barrera Filtro son esenciales.

3. Selección por afinidad

PRIMER DÍA

1. Marcar una placa de microtitulación con tinta permanente, y designar qué pozos contendrán que proteins / enmiendas. (Debido a los problemas de contaminación, las placas se nunca reutilizados). Realice esto en 3 repeticiones de pozos para cada proteína y tratamiento.
2. Lavar la placa extensivamente con agua y eliminar el agua por el chasquido de la placa invertida sobre 4 capas de toallas de papel entre cada lavado. Inmovilizar, en 100 l de Tris, pH 7,5, (o tampón de elección) la proteína recombinante (10 mg / ml) en seis pozos, o BSA (10 mg / ml) en tres pozos, para un total de 9 pozos para la primera ronda de selección por afinidad. Cubra el plato con papel plástico y dejar toda la noche a 4 ° C (Figura 2 G).
3. Asegúrese de que no matraces 9 x 250 ml Erlenmeyer (véase el punto 2.1) limpios, esterilizados en autoclave, y etiquetados apropiadamente (codificación con cinta de color funciona bien, la Figura 2F).
4. Calcular el volumen de lisado de fago a utilizar para cada pocillo basado en el título de la biblioteca que se utiliza y el número de fagos que se proyectarán.
5. Asegúrese de que las células BLT5403 frescos están listos para usarpara la titulación de esta selección por afinidad ronda de mañana (Figura 3A).
6. Asegurar suficiente TBS 1x (150 mM NaCl, 50 mM de Tris base, pH 7,6) y 1x TTBS (TBS 1x + 0,05% (v / v) de Tween 20) están disponibles para llevar a cabo 10 x 200 l lavados para el número de pozos que se utilizan . Además, preincubar la TTBS a la temperatura de selección por afinidad. Asegúrese de que existe una copia de seguridad, sellados, 50 ml tubo Falcon de 1x TTBS a la temperatura de selección por afinidad con la suficiente 1x TTBS.
7. Preparar 3 tratamientos x 3 repeticiones x 3 triplicados de 1,5 ml tubos Eppendorf (27 en total) con 990 l de LB ^{100 AMP} todas y etiquetar adecuadamente (por ejemplo, 10 ^-2). Estos son para las bacterias infectadas recuperadas de los pozos de la placa de microtitulación mañana. Marque la dilución en un lado del tubo (10 ^-2) y un número ascendente en el otro lado ("1"). Para cada tubo Eppendorf, también etiquetar un tubo de borosilicato y uno LB ¹⁰⁰ placa ^AMP. En este WAy, las placas y tubos de ensayo de borosilicato están numerados 1, 2, 3, 4, 5, etc. para hacer titulación vaya más rápido. Después, el número sencillo se puede adaptar a la dilución y el tratamiento en el tubo de Eppendorf (por ejemplo, el tubo n º 12 era la tercera triplicado de la primera replicación del control de BSA para la dilución 10 ^-5). La tienda de tubos Eppendorf y LB ¹⁰⁰ placas ^AMP durante la noche a 4 ° C (Figuras 2G y 3B).

Por ejemplo: Iniciar el etiquetado de 1,5 ml de tubos Eppendorf durante tres 10 ^-2 diluciones de fago a partir de la replicación de BSA uno así como 1, 2, y 3 (tres lecturas por triplicado de título de fago para la replicación de uno), y luego marcar tubos de ensayo de borosilicato de 1, 2, y 3 en el que las bacterias infectadas se mezclarán con las bacterias infectadas y la parte superior de agarosa antes de verter en placas de agar LB ^{100 AMP} (Figura 3C).

8. Para la serie dilutions, tubos Eppendorf de etiqueta y, en cada una, añadir 900 l de LB ^{100 AMP.} Una vez que las diluciones iniciales (10 ^-2) de las bacterias infectadas se hacen para cada proteína / tratamiento, la replicación, y por triplicado, mañana, se mezclaron bien y 100 l tomadas de ellos y se añadieron al tubo Eppendorf apropiado que contiene 900 l de LB ^{100 AMP} para la dilución 10 ^-3 (tubos 4, 5, y 6 para la replicación de un control de BSA). Estos se mezclan bien en su vuelta y los 10 ^-3 diluciones se pueden utilizar para hacer las diluciones 10 ^-4 (7, 8, 9). Utilice los 10 ^-4 diluciones para las 10 ^-5 diluciones (10, 11, 12), etc. para obtener el título para la primera de las tres repeticiones de BSA (pozos).
9. El mismo se hará para la replicación BSA dos (bien 2), la replicación BSA tres (bien 3), las tres repeticiones del cebo envenenado, y finalmente las tres repeticiones de los pozos del cebo. Al final, no debe haber tubos etiquetados from 1-135 (135 es el último triplicado de la última réplica de la carnada en la dilución máxima de 10 ^-6). Guarde estos tubos Eppendorf durante la noche a 4 ° C (Figura 3C muestra el Eppendorf y tubos de borosilicato para todas las diluciones de los triplicados de las tres repeticiones (los tres pozos) de BSA.
10. Comience 2 o 3 tubos de cultivo de células BLT5403 (escogidos a partir de colonias individuales de una placa durante la noche recién rayada LB ^AMP100; desde el paso 2.2) que crecen en el agitador de incubación (Figuras 2E y 2F) como un cultivo de una noche. Al ml LB (punto 2.5) 500, añadir ampicilina a 100 mg / ml y colocar el matraz Fernbach de la pinza en la incubadora de agitación por lo que será a 37 ° C y aireada la mañana siguiente (Figura 2F).

Nota: Alrededor de tres y cuatro pueden requerir diluciones aproximadas de hasta un 10 ^-10 volumen de pHage al volumen de LB a ^AMP100.

DÍA DOS

11. A la mañana siguiente, coloque los frascos esterilizados en autoclave y vacíos 9 x 250 ml Erlenmeyer (uno para cada placa de microtitulación de) en las abrazaderas en la coctelera de la incubación. Inocular los 500 ml LB ^{100 AMP} con 500 l de uno de los cultivos de una noche de BLT5403 células comenzaron ayer por la noche (véase el paso 3.8 anterior), cerrar de nuevo y empezar su crecimiento (37 ° C, 220 rpm). Encender el espectrofotómetro (Figura 2H) y ponerlo a leer la absorbencia a 600 nm.
12. Retire la placa de microtitulación de 4 ° C, retire la película de plástico, y eliminar cualquier proteína no unida de la placa por lavado 10 veces con 200 l cada vez de 1x TBS pH 7,5 y golpeando el plato boca abajo sobre la toalla de papel entre lavados. Bloquear con 200 l 5% (w / v) de BSA o 200 l 5% (w / v) de reactivo de bloqueo en TBS durante 1 hora (o durante la noche si es conveniente) con la placa envuelto en una envoltura de plástico.
13. Lavar la s de bloqueolución 10 veces con 200 l cada vez de 1x TBST, chasquidos con la placa invertida sobre 4 capas de toallas de papel entre lavados. Es posible volver a llenar los pocillos con 200 l de agua en esta etapa, cúbralos con papel plástico y ponerlos a 4 ° C para almacenar para un máximo de 1 semana.

Nota: Inicie la cultura muy pronto que, por el momento en el fago infectada por BLT5403 desde la finalización de la selección por afinidad están dispuestos a agregar, las células en los 500 ml son entre 0,6 y 1,0 OD _600. Si crecen mucho más allá de 1,0, la lisis no se puede producir debido a las restricciones de recursos como células acercan a la fase estacionaria. Si las células no alcanzan una DO ₆₀₀ de 0,6 por lo menos antes de la introducción de fago, la multiplicidad de la infección puede ser demasiado alta, matando rápidamente a las células, que puede influir en la representación de la lisado. Si las células no se están acercando a un OD ₆₀₀ de 0,6 por la finalización de la selección por afinidad, INOCUlate el matraz con más BLT5403 de la segunda (o incluso de ambos segundo y tercero) tubos de ensayo de agitación a 37 ° C (Figura 2F). Si un OD ₆₀₀ de 1,0 se está acercando demasiado rápido, apague el calentador y el agitador y abra la tapa para enfriar la cultura y matar de hambre a las bacterias para el oxígeno. Recomenzar calentamiento / agitación una vez que el fago se han agregado.

Desde aquí utilizar puntas con barrera de filtro para evitar la contaminación cruzada de los fagos.

14. Una vez que el matraz se inoculó, poner la biblioteca de fagos (100 l) con las proteínas, vuelva a sellar la placa con papel plástico y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora.
15. A los 55 minutos, registrar la OD ₆₀₀ de las células. El tiempo de duplicación es aproximadamente cada 20 min. Actúa en consecuencia (ver "Nota" más arriba).
16. Al cabo de una hora quitar la envoltura de plástico de la placa y lavar inmediatamente por agitación a cabo el fago en los residuos transformado y a continuación, añadir rápidamente 200 l de TB 1xST. (Utilice un multipipettor con una cabeza l 1 = 100 y la pipeta establecer el 2 [es decir, proporciona 200 l / émbolo depresión] para esto y se va rápidamente). Use un cronómetro durante 1 min. Después de 1 min, sacudir búfer en residuos transformado, placa justo al revés sobre una toalla de papel y el lugar de nuevo en el banco (C placa de 25 °). Repita los pasos de lavado 10x.
17. Después de la 10 ^ª lavado, tomar 200 l de BLT5403 células del tubo Falcon de 50 ml a 4 ° C y los puso en la parte inferior del pozo del que se ha eliminado el último lavado de TTBS. Envuelva las placas en papel plástico y poner a 37 º C durante 20 minutos para llegar a cualquier fago todavía pegado al cebo para infectar a las bacterias (véase la nota de discusión sobre fago persistentemente recuperado y / o un fondo elevado del fago indiscriminadamente vinculante).
18. Al final de 20 minutos, desenvolver las placas y tomar 10 l bacterias de la BSA a 25 ° C la replicación de un pozo y lo puso en los 990 l de LB ^{100 AMP} marcados"1". Repetir dos veces más para que así (tubos 2 y 3) resultante en 3 triplicados de 1/100 diluciones de los fagos de que bien. Esta es la replicación de BSA uno muestreado tres veces. Estas diluciones se utilizarán para estimar el título promedio ± SEM para que la replicación de BSA.
19. Haga lo mismo para la replicación del 2 y 3 de la BSA (tres muestras por triplicado de 10 l cada uno), para los tres pozos replicados de la proteína cebos envenenados, y para la proteína cebo. Establezca estos 27 tubos Eppendorf a un lado y conseguir los 170 l restantes de las bacterias infectadas en los pozos de cultivo hacia la lisis.
20. Si las bacterias en el matraz es a una DO ₆₀₀ = 0,6-1,0, se decantan 50 ml de células de la Fernbach matraz en cada uno de los matraces Erlenmeyer de 250 ml nueve. Tome los 170 l restantes de fagos infectados BLT5403 bacterias en la replicación BSA 1 bien y añadir a las células de 50 ml marcados "BSA Rep 1" (cinta amarilla). Haga esto durante los nueve pozos y los pusieron en la incubadora de agitación ( Figura 2F).
21. Monitorear las células en el agitador 37 ° C incubando de vez en cuando para la lisis (aproximadamente 3 horas desde el momento de la inoculación). Hacer las diluciones de las 27 diluciones iniciales (10 ^-2) en los correspondientes tubos Eppendorf, etiquetados durante este tiempo.
22. Para llevar a cabo estas diluciones a partir de los primeros 27 diluciones de 3.12, tome 100 l de la LB con bacterias de tubo Eppendorf de 1 (BSA replicación uno, primera de las tres muestras de esta dilución 1/100 de este pozo) y agregarlo a la 900 l de LB en tubo Eppendorf 4 (1 x 10 ^-4 dilución de la replicación de BSA uno, primera de las muestras por triplicado de este pozo).
23. Deseche la punta barrera de filtro por uno nuevo antes de recibir 100 l de la LB con bacterias de tubo Eppendorf 4 a añadir a los 900 l de LB en tubo Eppendorf 7 (1 x 10 ^-5 dilución de la replicación BSA uno, primero del triplicado muestras de este pozo). Continuar las diluciones (dpropio a 1 x 10 ^-6) para todos los triplicados de todas las repeticiones de todas las proteínas y los tratamientos (135 tubos en total).
24. Una vez que las células se han lisado, acercar la cultura a NaCl 0,5 M mediante la adición de 5 ml de una M NaCl almacén 5 y transferir a una botella de centrífuga de etiquetado.
25. Centrifugar a 8000 xg durante 10 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante (el virus) en un tubo limpio, estéril Falcon de 50 ml.
26. Añadir unas cuantas gotas de cloroformo al sobrenadante decantado en el tubo Falcon.
27. Almacenar a 4 ° C para la siguiente ronda de selección por afinidad.

4. Día Tres

1. Autoclave o blanquear todo el material de laboratorio que se ha utilizado en la generación de esta selección por afinidad ronda para prepararse para la siguiente ronda.

5. Titulación

1. Número tantos LB ¹⁰⁰ placas ^AMP sólidos, ya que hay diluciones en orden ascendente (Ahora debe haber 1 plato para cada tubo de borosilicato y tubos Eppendorf, cada uno con el mismo número). Put las placas en la incubadora a 37 ° C (Figura 3D).
2. Derretir la parte superior de agarosa (1,0 g Bacto triptona, extracto de levadura 0,5 g, 0,5 g de NaCl, 0,6 g de agarosa, diluir a 100 ml, autoclave) aflojando el tapón de la botella de agarosa superior y alternativamente el microondas la botella y remolinos que se mezcle hasta que la parte superior agarosa se haya derretido completamente. Ponga el frasco en el baño de agua para enfriar a 50 ° C (Figura 3E).
3. Tome una pipeta 10 ml de borosilicato con una bomba de pipeta adjunta. Enciende un mechero Bunsen. A su vez un soporte para tubos Falcon de espuma de poliestireno o tapa de la hielera al revés en el banquillo y colocar las placas LB100 AMP 1 al 6 (fresco de la incubadora a 37 ° C) en él, placa 1 superior (Figura 4). La espuma de poliestireno mantiene los platos calientes.
4. Ponga 250 l BLT5403 células de 4 ° C en cada uno de los tubos de ensayo de borosilicato numerados preparados en el día uno anteriormente (sección 3.7 y las Figuras 4B y 4C). Arkansasvan los tubos de borosilicato numerados en la misma serie ascendente como las diluciones en los tubos de 1,5 ml Eppendorf (Figura 4A).
5. Ponga 100 l de la dilución en el tubo Eppendorf 1 en los 250 l de células en el tubo de ensayo borosilicato 1 (Figuras 4D y 4E). Calentar el primero en 5 de la pipeta sobre la llama un poco (no demasiado! ~ 3 golpes, Figura 4F) y sumergirse en la parte superior de agarosa fundida. Tire hacia arriba de 3 ml y entregar rápidamente en el tubo de ensayo en la parte superior de la células / fago (Figura 4G).
6. Mezclar con un movimiento rápido con un dedo mientras sostiene el tubo con la otra mano (Figura 4H) y verter el contenido en la placa (Figura 4I). Incline la plancha y utilizar el tubo de ensayo para perseguir las burbujas y manchas secas hasta que toda la placa está cubierto por la agarosa superior. Déjelo a un lado, de pie en el banco que se enfríe.
7. Desechar el tubo de borosilicato, expulse la punta barrera de filtro, consiga ununo fresco y continuará hasta que todos los diluciones se han plateado. Recuperar LB ^{AMP 100} placas de la incubadora, ya que se agotan pero no más de 6 en un momento o se enfrían y la parte superior de agarosa se ​​solidifica demasiado rápidamente.
8. Una vez que la agarosa superior es sólida, girar las placas boca abajo (ES IMPORTANTE HACER ESTO). De lo contrario, el agar / agarosa "llora", se condensa en la tapa, se despliega en la parte superior de agarosa y se ejecuta sobre él, teniendo el fago con ella por lo que es imposible de título con precisión) y ya sea: 1) poner las placas en los 37 ° incubadora [Volverá 4 horas más tarde para contar el título como T7 es agresivo] O: 2) Dejar boca abajo en el banco y que están listos a la mañana siguiente a contar título.
9. Tomar todas las precauciones necesarias para protegerse contra la rotura de cristal, o lesiones si no, poner la tapa de la botella de agarosa superior trasera sin apretar y microondas la agarosa superior hasta que hierva. Haga esto dos veces. Deje que se enfríe, apriete eltapa y dejarlo a un lado. Gire el baño de agua a su temperatura normal o apagarlo. Ponga las diluciones en la nevera 4 ° C. Ellos serán necesarios para interpretar los títulos y / o rehacer algo de la titulación.

6. Determinación y cálculo de Titulación

1. Examine la placa formada en las placas y descartar aquellos con lisis confluente (Figura 5A por ejemplo 10 ^-2 dilución). Determine cuál de las diluciones en serie restantes se han producido pocos suficientemente la placa para permitir la suma exacta (Figuras 5A a 5B nd). Anote el número de la placa de estas placas (Tabla 1, Figura 5B).
2. Multiplicar el número de la placa por la dilución y luego multiplicar este número por 100 para obtener el número de unidades formadoras de placa por ml de bacterias infectadas tomadas de los pozos (es decir, sólo se tomaron 10 l de bacterias infectadas para cada uno de los triplicados y so esto debe multiplicarse por 100 para obtener recuentos por ml). Promediar el número de unidades formadoras de placas (UFP) por mililitro, (PFU / ml de bacterias infectadas no diluidos tomados fuera de la placa de microtitulación también), en los tres triplicados tomadas de este pozo.
3. Formar un magnífico medio de los recuentos de los tres pocillos replicados y calcular el error estándar de la media (Tabla 1). Esto es lo que se va a grabar en la figura del aumento en el título de fagos para cada ronda de afinidad y el tratamiento (Figura 5C) selección.

7. Aislamiento de la placa, la PCR, y secuenciación

1. Al final de afinidad ronda de selección 4, seleccione 18 individual, bien definido, las colonias de la placa y, utilizando una pipeta Pasteur estéril, palillo de dientes, puntas de pipeta amarillo o dispositivo similar, el núcleo de éstos la placa de las placas de titulación. Si el uso de tubos o consejos, primero mojar el interior con el de Tris-HCl, pH 8,5 en el tubo de Eppendorf (Figura 5D).
2. Si utiliza tubos, asegúrese de que el tubo de borosilicato tiene ninguna gota de exceso de Tris, oprima el bulbo y, con él todavía comprime, empuje la punta de la pipeta de borosilicato a través de una placa bien aislado derecho de la placa Petri de plástico a continuación (Figura 5E). Suelte la bombilla con la punta de pipeta todavía en la agarosa agar / superior y aspirar el núcleo (Figura 5F, véase la flecha).
3. Expulsar el núcleo en 100 l de Tris-HCl, pH 8,5 en el tubo apropiado (Figura 5G) y agitar brevemente.
4. Calentar 20 l de este volumen a 65 ° C durante 10 min.
5. Centrifugar el volumen calentado a 13.000 xg en una centrífuga de sobremesa a temperatura ambiente durante 10 min. Tome 3 l del sobrenadante de esta alícuota para ser utilizado en reacciones de PCR con T7-ARRIBA y ABAJO cebadores T7-.
6. Para cada uno de los aislados de placa 18, soluciones calentadas, hacen una reacción PCR de 50 l con una temperatura de hibridación de 58 ° C y 35 ciclos.
7. Ejecutar 20 l de each de reacción en un 1% (w / v) en gel de agarosa que contiene 0,015% (v / v) de bromuro de etidio. Visualice con un transiluminador usar protección adecuada para los ojos y guantes de laboratorio de nitrilo. (ADVERTENCIA: El bromuro de etidio es un mutágeno potente.) Fotografía del gel, y disponer de los materiales contaminados correctamente (Figuras 6A y 6B).
8. Si los amplicones son productos individuales, y no a partir del vector vacío (producto corre cerca de 100 pb en un 1% (w / v) de gel de agarosa TAE; las figuras 6A y 6B flechas), limpiar los 30 l restantes para su uso como una plantilla de secuenciación. Si no un único producto en el gel (Figura 6B, la placa 15), cortar la banda más prominente (s) a partir del gel y extraer el ADN del gel usando un kit.
9. Secuencia de los amplicones que no son vectores vacíos utilizando el cebador T7-UP.
10. Examine cada secuencia para los brazos de enlazador y, a partir de esta información, determinar dónde se encuentra el inicio de la inserción. Utilice el Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; Biblioteca Nacional de Medicina) para determinar la identidad del cDNA codificada, si la inserción es en el marco y, en caso afirmativo, cuál es la parte de la proteína de la secuencia de codificación (CDS) se ha mostrado y capturado por el cebo.

Results

Ser capaz de poner en peligro la capacidad de la carnada para interactuar con las proteínas en fagos (metabólicamente envenenando el cebo) proporciona un control negativo potente para esta técnica. También es aconsejable para determinar si el cebo, cuando se une a la placa de microtitulación así, conserva su función. Ambos controles aumentará la confianza que interactúan, las proteínas en fagos recuperados por el cebo nonpoisoned son legítimas.

Muestreo tres triplicado de cada pocillo aument...

Discussion

Mediante la ejecución del experimento en tres pocillos replicados, fago adquirido de forma independiente de la misma proteína de unión al cebo puede distinguirse incluso si son del mismo clon (es decir, no hay diferencia en la secuencia de nucleótidos de la región de CDS que ha sido adquirida, pero estos han sido recuperados de pozos independientes). De lo contrario, la única manera de distinguir entre el fago que codifica la misma proteína de unión a la carnada es si son independientemente inversa regiones tra...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Triptona	Becton Dickinson Co.
Extracto de levadura	Becton Dickinson	212750
Agar	Becton Dickinson	214010
Cloruro de sodio	Fisher Scientific	BP358-10
Agarose	Research Products International	A20090
Reactivo de bloqueo	EMD Chemicals Inc.	69064
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Hidróxido de sodio	Fisher Scientific	BP359-212
Dodecil sulfato de sodio	Fisher Scientific	BP166-500
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5
Cloroformo	Fisher Scientific	BP1145-1
Escherichia coli BLT5403	EMD Chemicals Inc.	BLT5403	Genotipo: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)Ampicilina
, Sal de sodio	Research Products International	A40040
Bromuro de etidio	Fisher Scientific	BP102-1
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich Corp.	A-9647
Anticuerpo primario Penta-HIS	Qiagen Inc.	34660
Conjugado de fosfatasa alcalina anti-ratón de cabra	Sigma-Aldrich Corp.	A-5153
para-Nitrofenilfosfato	Sigma-Aldrich Corp.	N-7653
Imprimación T7-UP	EMD Chemicals Inc.		5'-GGAGCTGTCGTCCAGTC-3'T7-DOWN
imprimación	EMD Chemicals Inc.		5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick
PCR Kit de purificación	Qiagen Inc.	28104
Kit de extracción de gel Qiaquick	Qiagen Inc.	28706
Big Dye Terminator v3.1 Kit de secuenciación de ciclo	Invitrogen Life Technologies	4336917
Bloque calefactor	Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)	18780
Placas de cultivo celular de 96 pocillos	Corning	Costar 3590
Isotemp Incubadora Horno	Fisher Scientific	516D
Pasteur Pipetas, 5 ¾ en	Fisher Scientific	13-678-20A
ChromaView Transilluminator	UVP Inc.	TS-15
UV Shield	Oberon	071AF
Guantes, Nitrilo	Fisher Scientific	19-170-010C
Tubos estériles de 1,5 ml	USA Scientific Inc	1615-5500
Pipetas de borosilicato de 10 ml Fisher	Scientific	13-678-25E
Tubos de cultivo de borosilicato	Fisher Scientific	14-961-27
Uniskan I, lector de placas ELISA	Labsystem y Flow Laboratories, Helsinki, Finlandia	Tipo 362