Artículo de método

Derribo Gene a gran escala en C. elegans Utilizar bibliotecas de alimentación de dsRNA para generar sólidas fenotipos de pérdida de función

DOI:

10.3791/50693

⸱

25 de septiembre de 2013

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1Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts, Amherst, 2Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts, Amherst

En este artículo

Resumen

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Mientras dsRNA alimentación en C. elegans es una poderosa herramienta para evaluar la función de los genes, los protocolos actuales para pantallas de alimentación a gran escala resultan en eficiencias desmontables variables. Se describe un protocolo mejorado para realizar a gran escala pantallas de alimentación de RNAi que se traduce en caída altamente eficaz y reproducible de la expresión génica.

Resumen

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ARN de interferencia alimentando gusanos bacterias que expresan dsRNAs ha sido una herramienta útil para evaluar la función de genes en C. elegans. Si bien esta estrategia funciona bien cuando un pequeño número de genes están dirigidos por caída, pantallas de alimentación a gran escala muestran eficiencias variables desmontables, lo que limita su utilidad. Hemos deconstruido protocolos desmontables de RNAi publicados previamente y se encontró que la fuente primaria de la caída reducida puede atribuirse a la pérdida de plásmidos que codifican dsRNA de las bacterias alimentados a los animales. Basándose en estas observaciones, hemos desarrollado un protocolo de alimentación de dsRNA que reduce en gran medida o elimina la pérdida de plásmido para lograr eficiente, de alto rendimiento de la precipitación. Se demuestra que este protocolo producirá robusto, reproducible golpe abajo de C. elegans genes en múltiples tipos de tejidos, incluyendo las neuronas, y permitirán caída eficiente en pantallas de gran escala. Este protocolo utiliza una alimentación de dsRNA disponible comercialmentebiblioteca y describe todos los pasos necesarios para duplicar la biblioteca y realizar pantallas de ARN de doble cadena. El protocolo no requiere el uso de cualquier equipo sofisticado, y por lo tanto puede ser realizada por cualquier C. elegans laboratorio.

Introducción

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Históricamente, las pantallas de genética en C. elegans se han realizado mediante el tratamiento de los animales con un mutágeno químico tal como metanosulfonato de etilo para crear mutaciones aleatorias dentro del DNA. Progenie o grandprogeny de animales mutados son entonces aislados que presentan un fenotipo anormal deseado. La mutación responsable de causar el fenotipo se identifica a continuación a través de un procedimiento de asignación de mano de obra intensiva o mediante la secuenciación de todo el genoma del gusano mutante. Hay muchas ventajas a la realización de este tipo de pantallas de mutagénesis química, ya que crean lesiones permanentes en el ....

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Protocolo

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Nota: Este protocolo se puede utilizar para identificar los genes requeridos para una variedad de procesos biológicos en una variedad de tipos de tejidos. Como un control de calidad necesario durante la pantalla, los animales son alimentados tanto positivos como negativos bacterias que expresan dsRNA de control para demostrar los efectos de RNAi en el tejido diana.

Otros protocolos de alimentación publicados crecen bacterias dsRNA-expresan en presencia de ya sea 50 mg / ml de ampicilina o 25 mg / ml de carbenicilina 8-10. Hemos encontrado que las bacterias cultivadas bajo cualquiera de estas condiciones pierden el plás....

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Resultados

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Fenotipos desmontables P0 comenzarán a aparecer después de 2-3 días de alimentación de los animales dsRNA expresando bacterias. Algunos fenotipos tempranos incluyen la detención y la letalidad de las larvas y se deben observar en el 2-3% de todos los pozos que alimentan. Estos mismos fenotipos también se observaron en los animales de la generación F1. La presencia de huevos de F1 que no logran salir del cascarón es otro fenotipo F1 común, y juntos, se observará estos tres fenotipos en casi el 10% de todos los pozos en l.......

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Discusión

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Hemos descrito un protocolo que utiliza una biblioteca de alimentación dsRNA disponible en el mercado para realizar pantallas de gran escala en C. elegans. Proporcionamos todas las instrucciones para duplicar la biblioteca y para utilizar de manera eficaz. Se demuestra que este enfoque es capaz de identificar genes implicados en diferentes procesos biológicos en diferentes tejidos del animal. Mientras que los fenotipos que describimos aquí son fácilmente observables (UNC, Egl, y Dpy), este protocolo se puede ad.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud MH097163. Algunas cepas fueron proporcionados por la CGC, que es financiado por la Oficina de NIH de los programas de infraestructuras de investigación (P40-OD010440).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivo/Material
96 pocillos Placa de fondo plano Falcon Fisher Scientific353072
lámina adhesivaUSA Scientific2923-0100
Nunc omniplateFisher Scientific267060
2.0 ml de profundidad Polipropileno de 96 pocillos MasterblockUSA Scientific5678-0285Tapas esterilizables en autoclave
para placas de pocillos profundosUSA Scientific5665-6101
50 ml combitipsUSA Scientific4796-5000envueltos individualmente
DepósitoUSA Scientific2977-8500autoclavable
placas de 12 pocillosUSA ScientificCC7682-7512envueltos individualmente
biblioteca de alimentación de dsRNAOpenBiosystemsRCE1181tienda -80 ° C
AmpicilinaFisher ScientificBP1760-5
TetraciclinaFisher ScientificBP912-100
CarbenicillinaEspere de 2 a 4 semanas para la entrega www.biochemicaldirect.com
Agar bacteriológico Ultrapuro grado A Affymetrix10906para placas helicoidales
Equipment
Rodillo BrayerUSA Scientific9127-2940
B– Replicador KEL de 96 pinesFisher Scientific05-450-9microagitador esterilizable en autoclave
Thomas Scientific1231A933 mm orbit
12 canales pipeta multicanal (0.5-10 μ l)Pipeta7112-0510
(30-300 μ l)Pipeta manual USA Scientific7112-3300
Repeater Plus USAScientific4026-0201
estéril multicanal de 12 canales USA Scientific

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mello, C. C., Conte, D. Jr Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
  2. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Tabar....

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