En este artículo presentamos micro-iontoforesis rápida de los neurotransmisores como técnica para investigar la integración de las señales postsináptica con alta precisión espacial y temporal.
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Artículo de método
Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica
En este artículo
Resumen
Resumen
Uno de los intereses fundamentales de la neurociencia es entender la integración de entradas excitadoras e inhibidoras a lo largo de la muy compleja estructura del árbol dendrítico, que finalmente conduce a la producción neuronal de potenciales de acción en el axón. La influencia de diversos parámetros espaciales y temporales de entrada sináptica específica en la salida neuronal está actualmente bajo investigación, por ejemplo, la atenuación dependiente de la distancia de las entradas dendríticas, la interacción dependiente de la ubicación de las entradas espacialmente segregadas, la influencia de la inhibición GABAergig en la integración excitatorio, lineal y modos de integración no lineales, y muchos más.
Con micro-iontoforesis rápido de glutamato y GABA es posible investigar con precisión la integración espacial y temporal de la excitación glutamatérgica y la inhibición GABAérgica. Requisitos técnicos críticos son o bien una lámpara fluorescente activado, el diodo emisor de luz (LED), o una de dos fotones scanning microscopio para visualizar ramas dendríticas sin introducir significativa foto-daño del tejido. Además, es muy importante tener un amplificador de micro-iontoforesis que permite la compensación de capacitancia rápido de pipetas de alta resistencia. Otro punto crucial es que ningún transmisor se libera involuntariamente por la pipeta durante el experimento.
Una vez establecida, esta técnica dará señales fiables y reproducibles con una alta especificidad y neurotransmisor ubicación. En comparación con el glutamato y GABA uncaging, iontoforesis rápido permite el uso de dos transmisores en el mismo tiempo pero en lugares muy distantes sin limitación para el campo de visión. También hay ventajas en comparación con la estimulación eléctrica focal de axones: con micro-iontoforesis se conoce definitivamente la ubicación del sitio de entrada y es seguro de que sólo se libera el neurotransmisor de interés. Sin embargo, tiene que tener en cuenta que sólo con micro-iontoforesis lapostsynapse se activa y aspectos presináptica de la liberación de neurotransmisores que no se resuelven. En este artículo se demuestra cómo crear micro-iontoforesis en experimentos de cortes de cerebro.
Introducción
Las neuronas en el sistema nervioso central reciben una variedad de entradas sinápticas en sus procesos dendríticos delgadas y ramificadas 1. Allí, la mayoría de las entradas excitadoras dendríticas están mediadas por las sinapsis glutamatérgicas. Estas sinapsis se pueden activar de una manera distribuida en el espacio, lo que resulta en la integración lineal postsináptica de los potenciales postsinápticos excitatorios (EPSP). Si las sinapsis se activan de forma simultánea y en proximidad espacial en la dendrita, estas entradas excitadoras pueden ser integrados supra-linealmente y generan picos dendríticas 2-5.
Ademá....
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Protocolo
1. Requisitos del sistema
- Sistema de microscopio: buena visualización de la dendrita es crucial. Si está disponible, utilice un sistema de microscopía de escaneo láser de dos fotones. En nuestros experimentos hemos utilizado un ámbito TRIM II, LaVision Biotec, Bielefeld, Alemania o un sistema Ultima IV, Tecnologías de la Prairie, Middleton, Wisconsin equipado con un Ti: Sapphire-pulsos láser ultrarrápidos (Camaleón Ultra II, coherente) y un objetivo de alto NA (60X, 0,9 NA, Olympus) para visualizar las dendritas que habíamos llenado con un colorante fluorescente a través de la pipeta parche. Aunque se cree que foto-daño a ser menos graves utilizando la exp....
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Resultados
Un enfoque simple para determinar la extensión espacial de la iontoforesis es para retraer la pipeta iontoforético paso a paso de la dendrita, mientras se mantiene constante la glutamato expulsado. Hemos encontrado que la extensión espacial de una estimulación de micro-iontoforético tenía un diámetro de aproximadamente 12 micras (Figura 1 que muestra radio). ¿Qué tan profundo en el tejido de la iontoforesis se puede utilizar depende de la rigidez de la pipeta. Sin embargo, las pipetas iontoforéticos nec.......
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Discusión
Aquí le explicamos cómo aplicar micro-iontoforesis rápida de los neurotransmisores para investigar la integración sináptica en las dendritas. Esta técnica se ha utilizado con éxito para investigar la transmisión sináptica glutamatérgica y GABAérgica en diferentes regiones del cerebro in vitro e in vivo 9,20-22. Micro-iontoforesis se ha utilizado durante más de 60 años, pero en los primeros años, se utiliza sobre todo para bien aplicar localmente neurotransmisores y fármacos en escalas de tie.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Damos las gracias a Hans Reiner pólder, Martin Fuhrmann y Walker Jackson para leer detenidamente el manuscrito. Los autores recibieron financiación que fue proporcionada por el Ministerio de Investigación MIWF del estado de Renania del Norte-Westfalia (SR), el BMBF-Projekträger DLR colaboración entre Estados Unidos y Alemania en neurociencia computacional (CRCNS, SR), Centros de Excelencia en Enfermedades Neurodegenerativas (COEN; SR), y la Universidad del programa de financiación habitual Bonn (BONFOR; SR).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| escaneo láser < fuerte/> | |||
| fotones (TRIM Scope II) y Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Alemania | ||
| Microscopio de barrido láser de dos fotones Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, EE. UU | . | |
| Ti:Láser de pulso ultrarrápido de zafiro | Chameleon Ultra II, Coherente | ||
| Objetivo 60X, NA 0.9 | Olympus | ||
| Microscopio vertical Zeiss Axioskop 2 FS | TILLPhotonics, Grä estanterías, Alemania | ||
| Monocromador | TILLPhotonics, Grä estanterías, Alemania | ||
| sistema de microiontoforesis MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Alemania | ||
| Tirador Sutter P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Filamentos de vidrio (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Alemania | ||
| Reactivo | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Sondas moleculares | de vida A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Sondas moleculares tecnologías de vida | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sacarosa | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucosa | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconato | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-ácido | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Fosfocreatina | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ácido glutámico | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
Referencias
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the....
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Reimpresiones y permisos
