El tejido adiposo (AT) es un sitio de activación de células inmunes y la interacción intensa. Casi todas las células del sistema inmune están presentes en AT y sus proporciones se alteran por la obesidad. Aislamiento adecuado, cuantificación y caracterización de las poblaciones de células inmunes son fundamentales para la comprensión de su papel en la enfermedad immunometabolic.
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Artículo de método
Aislamiento de tejido adiposo células inmunes
En este artículo
Resumen
Resumen
El descubrimiento de aumento de la infiltración de macrófagos en el tejido adiposo (AT) de los roedores y los seres humanos obesos ha dado lugar a una intensificación de interés en la contribución de células inmunes a la resistencia a la insulina local y sistémica. Aislamiento y cuantificación de diferentes poblaciones de células inmunes en magra y obesos AT es ahora una técnica comúnmente utilizada en los laboratorios immunometabolism; todavía extrema se debe tener cuidado tanto en el aislamiento de células del estroma vascular y en el análisis de citometría de flujo, de modo que los datos obtenidos es fiable e interpretables . En este video se demuestra cómo pica, digerir, y aislar la fracción vascular estromal enriquecida con células inmunes. A continuación, mostramos cómo los macrófagos etiqueta de anticuerpos y los linfocitos T y la forma de la puerta correctamente en los experimentos de citometría de flujo. Se proporcionan flujo representativos parcelas citometría de bajos magras y grasa de alto ratones obesos alimentados con grasa alimentados. Un elemento crítico de este análisis es el uso de anticuerpos que hacenno fluorescencia en los canales donde AT macrófagos son naturalmente autofluorescente, así como el uso de los controles de compensación adecuados.
Introducción
Históricamente, el tejido adiposo (AT) ha sido considerada como un órgano inerte de almacenamiento de lípidos, que se expande y contrae en respuesta al balance energético. Ahora entendemos que AT representa un órgano endocrino que segrega dinámica activamente una serie de hormonas, que influyen directamente en el comportamiento de alimentación y sistémicos homeostasis de la glucosa. Además, durante la última década ha habido un reconocimiento creciente de los numerosos poblaciones de células inmunes residentes en el AT fracción del estroma vascular (SVF), así como su contribución a la homeostasis de AT.
La capacidad de separar la AT adipo....
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Protocolo
1. Reactivos y suministros
Antes de iniciar este protocolo experimental, se preparan los siguientes reactivos:
- Etanol al 70%
- 1X PBS
- 1X DPBS (sin Ca y Mg) suplementado con 0,5% de BSA
- Tampón FACS: 1X DPBS (sin Ca y Mg), 2 mM de EDTA, y 1% de FCS
- Tampón ACK: 150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO3, y 0,1 mM Na 2 EDTA en agua
2. Recolección y Preparación de tejido adiposo
- La eutanasia a los ratones de acuerdo con los procedimientos aprobados IACUC específicos de cada institución.
- Mojar bien la piel con etanol al 70%....
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Resultados
Digestión con colagenasa de AT seguido de centrifugación diferencial se utilizó para aislar el SVF de almohadillas de grasa del epidídimo de ratones macho C57BL/6J alimentados con una baja en grasas (10% kcal de la grasa) o alta en grasas (60% kcal de la grasa) dieta (LFD y HFD , respectivamente) durante 16 semanas. Las células de la SVF fueron etiquetados con anticuerpos primarios conjugados con fluoróforo para cuantificar la proporción de cajeros automáticos viables (Figura 1) y AT células T (.......
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Discusión
El creciente interés en el papel del sistema inmune en las consecuencias metabólicas de la obesidad ha llevado al uso generalizado de citometría de flujo para caracterizar las células inmunes de la AT. Aunque el protocolo exacto varía entre los laboratorios en base a su propia experiencia y los equipos disponibles, los pasos críticos incluyen la digestión colagenasa, centrifugación diferencial, y la superficie de la célula etiquetado antígeno. El objetivo del presente artículo es proporcionar un protocolo detallado y gu.......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
JSO se apoya en un NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), Alaska con el apoyo de una beca posdoctoral de la Asociación Americana de Diabetes (7-10-MI-05), y AHH se apoya en un American Heart Association Fundada Investigator Award (12EIA8270000). Experimentos de citometría de flujo se realizaron en el Flujo VMC Citometría de recursos compartidos. El VMC Citometría de flujo de recursos compartidos con el apoyo del Centro de Investigación de Enfermedades Digestivas Vanderbilt (DK058404).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DPBS (sin Ca o Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| colagenasa | Sigma | C6885-5G | |
| solución de yoduro de propidio | Sigma | P4864-10 ml | |
| pila estable 20 microlitros | Rainin | SS-L10 | |
| Puntas de filtro de 20 microlitros | Rainin | SRL10F | |
| pila estable Puntas de 250 microlitros | Rainin | SS-L250 | |
| Puntas de 1000 microlitros | Rainin | GPS-L1000 | |
| Puntas de filtro de 1000 microlitros | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 puntas de filtro de microlitros | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn coladores | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| plato de peso mediano | Fisherbrand | 02-202B | |
| papel de aluminio | Fisherbrand | 1213100 | |
| tijeras de picar | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| Tubos cónicos de 50 ml | BD Falcon | 14-959-49A | |
| tapa filtrante Tubos FACS | BD FALCON | 352235 | |
| 10 ml estuche de pipetas 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| tubos de fondo redondo | BD Falcon | 352058 | |
| Jeringa de 5 ml | BD Falcon | 309646 | |
| V Placas Inferiores | Costar | 07-200-107 | |
| pipeta de bulbo de transferencia | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Agitador | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Estera adhesiva | Thermo Scientific | 1368750 | |
| centrífuga de cultivo celular | Sorvall | 75253839 | |
| Adaptadores Sorvall | 75003723 | ||
| Rata antiratón CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentración: 0,5 - 1 μ g/ 106 células |
| Rata anti-ratón F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Conjugado con fluoróforo: APC Concentración: 0,2 μ g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: 17-4321 |
| Rata anti-ratón CD11b | eBioscience | 11-0112 | Conjugado fluoróforo: FITC Concentración: 0,5 μ g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: 1/11/4031 |
| Hámster Armenio anti-ratón CD11c | eBioscience | 12-0114 | Conjugado de fluoróforo: PE Concentración: 0,8 μ g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: Dic-88 |
| Cabra anti-ratón MGL1/2 | R& D Systems | FAB4297P | Conjugado de fluoróforo: PE Concentración: 0,1 μ g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: IC108P |
| Cabra anti-ratón CD206 | R& D Systems | FAB2535P | Conjugado de fluoróforo: PE Concentración: 0,1 μ g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: IC108P |
| Rata anti-ratón CCR2 | R& D Systems | FAB5538P | Conjugado de fluoróforo: PE Concentración: 0,1 μ g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: IC013P |
| Hámster Armenio anti-ratón TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Conjugado de fluoróforo: APC Concentración: 0,2 μ g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: |
| 553956 Rata anti-ratón CD8a BD | Biosciences | 552877 | Conjugado de fluoróforo: PE-Cy7 Concentración: 0,8 μ g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: 552784 |
| Rata anti-ratón CD4 | BD Biosciences | 557956 | Conjugado con fluoróforo: Alexa Fluor 700 Concentración: 0,2 μ g/ 106 celdas Número de catálogo de control de isotipo: 557963 |
Tabla 1. Lista de Materiales y Reactivos. |
Referencias
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-ind....
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Reimpresiones y permisos
