Derivado de la evolución temporal de la Liquidación glutamato con un análisis de deconvolución de Corrientes Transporter astrocíticos

Summary

Se describe un método analítico para estimar la vida útil de glutamato en las membranas de los astrocitos a partir de grabaciones electrofisiológicas de las corrientes de transportador de glutamato en astrocitos.

Abstract

La mayor densidad de transportadores de glutamato en el cerebro se encuentra en astrocitos. Transportadores de glutamato par el movimiento de glutamato a través de la membrana con el co-transporte de Na ⁺ y 3 1 H ⁺ y el contador-transporte de K ⁺ 1. La corriente estequiométrica generada por el proceso de transporte se puede controlar con su conjunto de células patch-clamp grabaciones de astrocitos. El curso temporal de la corriente registrada está conformado por el transcurso de tiempo del perfil de glutamato concentración a la que están expuestos los astrocitos, la cinética de los transportadores de glutamato, y las propiedades electrotonic pasivos de membranas astrocíticos. Aquí se describen los métodos experimentales y analíticos que se pueden utilizar para registrar las corrientes transportador de glutamato en los astrocitos y aislar el curso del tiempo de aclaramiento de glutamato de todos los otros factores que dan forma a la forma de onda de las corrientes transportador astrocíticos. Los métodos descritos aquí pueden ser utilizados para estimar la vida útil of flash uncaged y glutamato liberado sinápticamente en membranas astrocíticos en cualquier región del sistema nervioso central durante la salud y la enfermedad.

Introduction

Los astrocitos son uno de los tipos de células más abundantes en el cerebro con morfología en forma de estrella y salientes de membrana fina que se extienden a lo largo de la neuropilo y llegan a la vecina contactos sináptica ^1,2. Membrana celular Los astrocitos está densamente llena de moléculas transportadoras de glutamato ^3. En condiciones fisiológicas, los transportadores de glutamato se unen rápidamente glutamato en el lado extracelular de la membrana y lo transfieren al citoplasma de la célula. Al hacerlo, los transportadores mantienen baja la concentración basal de glutamato en el espacio extracelular ^4. Transportadores de glut....

Protocol

1. Preparación Slice

1. Preparar 500 ml de solución de corte / de almacenamiento que contiene (en mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 de CaCl _2, 1,3 _MgSO4 · 7 _H2O, 4 de MgCl _2, 26,2 _NaHCO3, 1 NaH ₂ PO _4, y 22 de glucosa, 320 mOsm, pH 7,4
2. Use un vaso de 250 ml para preparar una cámara de inmersión de los cortes, llénelo con 200 ml de solución de rebanar / almacenamiento, caliente en un baño de agua a 34 ° C y la burbuja con 95% O _2, 5% de CO _2.
3. Mantenga la solución restante rebanar / almacenamiento en una botella de vidrio a 4 ° C.
4. Utilice u....

Results

El éxito del enfoque analítico descrito aquí depende de manera crítica en la obtención de los registros electrofisiológicos de alta calidad de las corrientes de transportador a partir de astrocitos en cualquier región del sistema nervioso central. En cortes de hipocampo agudos ratón, los astrocitos pueden ser fácilmente identificados bajo Dodt iluminación o IR-DIC debido a su cuerpo de células pequeñas (Ø = 10 micras) y núcleo prominente (Figura 1). Su morfología distintiva en forma de estrella se puede.......

Discussion

Aquí se describe un enfoque experimental para obtener los registros electrofisiológicos a partir de astrocitos, un protocolo de análisis para aislar corrientes transportador de glutamato en los astrocitos y un método matemático para derivar el curso del tiempo de aclaramiento de glutamato de las corrientes transportador astrocíticos.

El éxito del análisis se basa en la capacidad de obtener alta calidad patch clamp grabaciones a partir de astrocitos y en la exactitud de los algoritmos de ajus.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGP52432	Tocris	1246
(R,S)-CPP	Tocris	173
DPCPX	Tocris	439
LY341495 sal disódica	Tocris	4062
MSOP	Tocris	803
NBQX sal disódica	Tocris	1044
D,L-TBOA	Tocis	1223
Picrotoxina	Sigma	P1675
MNI-L-glutamato	Tocris	1490
Alexa 594	Life Technologies	A10438	Electrodos de matriz opcionales
	Frederick Haer Company	MX21AES(JD3)
Capilares de vidrio de borosilicato	World Precision Instruments	PG10165-4
Extractor de micropipetas de vidrio de doble etapa	Narishige	PC-10
Loctite 404 adhesivo instantáneo	Ted Pella	46551
Xe lámpara	Rapp OptoElectronic	FlashMic
Igor Pro 6	Wavemetrics