Células Madre Programación para Terapéutico Angiogénesis Uso Biodegradable polimérico nanopartículas

Summary

Se describe el método de las células madre de programación para sobreexpresar factores terapéuticos para la angiogénesis usando nanopartículas poliméricas biodegradables. Procesos descritos incluyen la síntesis de polímeros, la transfección de células madre derivadas de tejido adiposo in vitro, y la validación de la eficacia de las células madre programado para promover la angiogénesis en un modelo de isquemia de las extremidades posteriores murino.

Abstract

Crecimiento vascular controlada es crítico para la regeneración de tejidos y la cicatrización de heridas con éxito, así como para el tratamiento de enfermedades isquémicas tales como accidente cerebrovascular, ataque al corazón o enfermedades arteriales periféricas. Entrega directa de los factores de crecimiento angiogénicos tiene el potencial de estimular el crecimiento de los vasos sanguíneos, pero a menudo se asocia a limitaciones como la falta de focalización y la corta vida media in vivo. La terapia génica ofrece un enfoque alternativo mediante la entrega de genes que codifican factores angiogénicos, pero a menudo requiere el uso de virus, y está limitado por cuestiones de seguridad. Aquí se describe una estrategia recientemente desarrollada para estimular el crecimiento vascular por las células madre de programación para sobreexpresar factores angiogénicos in situ usando nanopartículas poliméricas biodegradables. Específicamente nuestra estrategia utiliza células madre como vehículos de entrega mediante el aprovechamiento de su capacidad para migrar hacia los tejidos isquémicos in vivo. Usando los vectores poliméricos optimizados, derivadas de tejido adiposocélulas madre fueron modificados para sobreexpresar un gen que codifica el factor angiogénico de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Se describen los procesos para la síntesis de polímero, la formación de nanopartículas, la transfección de células madre in vitro, así como los métodos para la validación de la eficacia de las células madre de VEGF-expresión para la promoción de la angiogénesis en un modelo de isquemia de las extremidades posteriores murino.

Introduction

El objetivo general de esta técnica es el de promover la angiogénesis terapéutica utilizando células madre no programados de forma viral que sobreexpresa factores terapéuticos en el sitio de la isquemia. Las células madre fueron modificadas ex vivo primero el uso de nanopartículas biodegradables sintetizados en el laboratorio, y luego trasplantadas en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores para validar su potencial para la mejora de la angiogénesis y de salvamento tejido.

Crecimiento vascular controlada es un componente importante de la regeneración de tejidos éxito, así como para el tratamiento de diversas enfermedades isquémicas tales como apoplejía, isquemia de los miembros, y el infarto de miocardio. Varias estrategias se han desarrollado para promover el crecimiento vascular, incluyendo la entrega del factor de crecimiento y la terapia basada en células. ¹ A pesar de la eficacia observada en los modelos de enfermedades de los animales, estos métodos todavía se enfrentan a limitaciones tales como la necesidad de dosis suprafisiológicas para la entrega del factor de crecimiento, o insuficiente paracrinaliberar por células solas. Una estrategia potencial para superar las limitaciones anteriores es combinar la terapia de células madre y terapia génica, por el que las células madre están programados genéticamente ex vivo antes del trasplante para sobreexpresar factores terapéuticos deseables. Este enfoque ha sido demostrado en varios modelos de enfermedad incluyendo la isquemia del miembro posterior ^2, enfermedades del corazón ^3, la curación del hueso ⁴ y lesión neural ^5, etc. Sin embargo, la mayoría de las técnicas de terapia génica se basan en vectores virales, que se asocian con preocupaciones de seguridad tales como la inmunogenicidad potencial y la mutagénesis por inserción. Biomateriales mediada la entrega de genes no virales pueden superar estas limitaciones, pero a menudo sufren de baja eficiencia de transfección. Para acelerar el descubrimiento de nuevos biomateriales para una eficiente administración de genes no virales, estudios recientes han utilizado la química combinatoria y el enfoque de selección de alto rendimiento. Bibliotecas de polímeros biodegradables tales como poli (ES-β aminotros) (PBAE) se han desarrollado y proyectado, lo que llevó al descubrimiento de los principales polímeros con un marcado aumento de la eficacia de transfección en comparación con los homólogos de vectores poliméricos convencionales. ^6-7

En la presente memoria, se describe la síntesis de PBAE y la verificación de su capacidad para transfectar células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) in vitro, seguido de posterior trasplante de ADSC genéticamente modificados-que sobreexpresan el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores . Los resultados se evaluaron mediante el seguimiento del destino celular utilizando imágenes de bioluminiscencia, la evaluación de la reperfusión de tejidos utilizando láser Doppler perfusión de imagen (LDPI), y la determinación de la angiogénesis y el tejido de rescate por la histología.

Protocol

1. Síntesis de polímero

1. En una campana de humos, pesar 3,523 mg de butandioldiacrilato (C) y transferir a un vial de centelleo de vidrio que contiene una barra de agitación.
2. Pre-calor 5-amino-1-pentanol (32) a 90 ° C para solubilizar la sal, a continuación, en una campana de humos, pesar 1,533 mg de 32 y añadir al vial de centelleo que contiene C. Este método se traducirá en una relación molar de C: 32 = 1:1,2.
3. Colocar inmediatamente el vial que contiene dos soluciones en una placa de agitación. Ajuste la velocidad de agitación a 600 rpm.
4. Transferir el vial de centelleo para un horno ajustado a 90 º C. Ajuste la velocidad de agitación a 1000 rpm durante 4 horas. Si la barra de agitación se queda atascado, baje la velocidad. Después de 4 horas, la velocidad baja a 300 rpm y se mantiene a 90 º C durante otros 12 a 16 h.
5. Añadir 5 g de C32 a 10 ml de tetrahidrofurano anhidro (THF) en un vial de centelleo de vidrio que contiene una barra de agitación. Envuelva en papel de aluminio y el vórtice de alta hasta que esté completamente disuelta.
6. En un vial de centelleo de vidrio conta separadanando una barra de agitación, se añaden 10 mM de Tetraethyleneglycoldiamine (122). Añadir 40 ml de THF.
7. Coloque ambos viales (C32 y 122) sobre una placa de agitación durante 5 minutos y después se combinan juntos. Cubierta en papel de aluminio y dejar a temperatura ambiente de agitación a 400 rpm durante 24 horas. El producto final se denomina C32-122.
8. Pesar 5 x 50 ml tubos Falcon por cada 5 g lote de C32-122. Tenga en cuenta la masa de cada tubo en un cuaderno.
9. Transferencia de 30 ml de éter dietílico anhidro a cada tubo Falcon de 50 ml.
10. Transferencia de 10 ml de C32-122 a cada tubo Falcon de 50 ml.
11. Tubos Falcon Vortex vigorosamente y centrifugar a 2500 rpm durante 2 min. Nota: El polímero extraído recogerá en la base del tubo.
12. Deseche la solución superior y repita los pasos 1.9 y 1.11 dos veces más.
13. Coloque los tubos abiertos que contienen el extraído C32-122 en el desecador y vacío durante la noche. Asegúrese de que todos los tubos estén protegidos de la luz.
14. Pesar todos los tubos que contenían C32-122 para determinar la masa final de lapolímero extraído.
15. Se disuelve el polímero extraído en DMSO anhidro a una concentración de 100 mg / ml.
16. Guarde el polímero disuelto a -20 ° C protegido de la luz y la humedad.

2. La siembra de células

1. Pre-capa de la base de un T-150 matraz de cultivo de tejido con 0,1% (peso / volumen) de gelatina. La gelatina debe permanecer en el matraz durante 30-45 min. El recubrimiento de gelatina ayuda a la adhesión de ADSC.
2. Aspirar la gelatina de la matraz T-150 pre-revestido.
3. Añadir 4 x 10 ⁶ ADSC (≤ paso 3) al matraz en 20 ml de DMEM que contenía 10% de FBS, 1% penicilina / estreptomicina y 10 ng / ml de bFGF.
4. Colocar el matraz T-150 en la incubadora a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante la noche.
5. Comience procedimiento de transfección el día siguiente.

3. Preparación de nanopartículas y Transfección

1. El siguiente procedimiento es para la preparación de nanopartículas que contienen ADN plásmido 16.1 g por1,0 x 10 ⁶ células en un polímero al plásmido relación en peso de 30:1.
2. Diluir ADN plásmido (1 mg / ml, pVEGF165, Aldevron, ND, EE.UU.) a una concentración final de 120 g / ml en acetato de sodio (25 mM) en un tubo Falcon de 15 ml.
3. Diluir C32-122 (100 mg / ml) a una concentración final de 3,6 mg / ml en acetato de sodio (25 mM) en un segundo tubo Falcon de 15 ml.
4. Combine el contenido de cada tubo Falcon en un solo tubo Falcon de 15 ml y agitar inmediatamente a temperatura alta durante 10 segundos.
5. Deje que el tubo de reposar a temperatura ambiente durante 10 min para la formación de nanopartículas que se produzca.
6. Mientras se incuba, reemplace medio en el frasco de cultivo de tejidos con DMEM 7,8 ml plenamente complementado por 1,0 x 10 ⁶ células transfectadas.
7. Transferir la solución de nanopartículas en el matraz de cultivo de tejidos y la inclinación hacia adelante y hacia atrás para repartir uniformemente.
8. Colocar el matraz de cultivo de tejidos en la incubadora a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 4 horas.
9. Después de 2 horas, sustituya el nanopartícu que contiene los medios de comunicación con DMEM.
10. Después de una incubación adicional de 2 horas a 37 ° C, 5% de CO _2, las células están listas para la inyección in vivo.

4. Miembro Posterior Procedimiento Isquemia

1. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con el cuidado y uso de animales directrices del Comité de la Universidad de Stanford y protocolos APLAC aprobados. Generar el modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores se realizó como se describió anteriormente. ⁸ Por favor, consulte la referencia para obtener instrucciones detalladas. Una breve descripción se proporciona a continuación.
2. Coloque el ratón bajo anestesia con isoflurano 1-3% de dosificación por inhalación y tasa de flujo de oxígeno de 1 l / min. Asegúrese de profundidad anestésica mediante pizca dedo del pie, la reducción de la frecuencia respiratoria, y el letargo.
3. Eliminar el vello de la región abdominal y ambas áreas los miembros posteriores del ratón con crema de afeitar.
4. Hacer la incisión en el centro de medial del muslo hacia la línea media y luego se corta a través de la almohadilla de grasa que recubre al explantear la arteria femoral.
5. Se une la arteria en dos sitios: el sitio distal (cerca de la rodilla) y el sitio proximal (distal al ligamento inguinal).
6. Para crear las ligaduras, separar la arteria de la vena y el hilo de sutura de seda 5-0 alrededor de la arteria. Ate la arteria con dos nudos para hacer la ligadura.
7. Retire la arteria entre los dos puntos de ligadura.
8. Lavar el área quirúrgica con PBS y luego suturar la incisión cerrada.
9. La anestesia puede ahora ser retirado. Mantenga caliente del ratón hasta que re-despertar. Para el cuidado post-operatorio, 2-4 mg / kg de lidocaína puede ser inyectado por vía subcutánea en el sitio de la incisión antes de volver a despertar. Además el manejo del dolor puede incluir la administración subcutánea de 0,05 a 0,1 mg / kg de buprenorfina a las 12 y 24 h. Supervisar el estado de salud de los ratones una vez al día durante siete días observando los cambios en el patrón respiratorio, dolor o dificultad evidente, y el color de la piel.
10. Confirme la isquemia de las extremidades posteriores por imágenes de perfusión Doppler láser.

5. Inyecciones de células

1. Cuando las células transfectadas y los ratones están listos, lavar las células transfectadas con PBS, trypsinize, centrifugar, y luego contar.
2. Resuspender las células a una densidad de 10 x 10 ⁶ células por ml en PBS.
3. Las suspensiones celulares deben ser separados en tubos Eppendorf separados en un volumen de 110 l. Esto asegurará que cada ratón recibe una cantidad igual de células.
4. Coloque cada ratón bajo anestesia (2,5% de isoflurano, tasa de flujo de 1 l / min de oxígeno).
5. Limpie la zona de inyección con toallitas con alcohol.
6. Utilizando una jeringa de tuberculina 27 G, dibujar las celdas hacia arriba y hacia abajo en la jeringa para asegurarse de que se consigue una suspensión homogénea. Elaborar 100 l de volumen de la suspensión celular en la jeringa.
7. Inyectar la mitad de la suspensión celular en la región del músculo aductor y luego inyectar la otra mitad en la región de músculo de la pantorrilla. Tras la inyección, deje la jeringa en su lugar por lo menos durante 15 a 30 segundos paraevitar fugas de la suspensión celular.
8. Los controles apropiados para el estudio de los animales son: 1) las células transfectadas con un plásmido no codificante (por ejemplo, plásmido sin actividad biológica), 2) las células por sí solas, y 3) PBS.
9. Cuando las inyecciones se han completado, extraiga el ratón de la anestesia y mantener caliente hasta que el ratón se re-se despierta.

6. Imágenes de bioluminiscencia

1. Para empezar imágenes de bioluminiscencia (BLI), anestesiar a los ratones como se describió anteriormente.
2. Limpie la zona de inyección con toallitas con alcohol.
3. Utilizando la jeringa de insulina, la carga 100 l de 15 mg / ml de D-luciferina (el sustrato para la luciferasa de luciérnaga). Mantenga el sustrato de la luz.
4. Para llevar a cabo inyecciones intraperitoneales, mantenga los ratones por la piel de su espalda para tirar de su piel tensa anterior. Introduzca la aguja por vía intraperitoneal en la región abdominal e inyectar 100 l de sustrato.
5. Coloque el ratón en la cámara de imágenes IVIS luciferasa bajo anestesia.
6. Imagen de los ratones con un tiempo de exposición de 1,0 min. Cuando se establecen los parámetros, comienzan a adquirir las imágenes.
7. Cuando se adquiere la imagen, marque la región de interés para medir la señal de luciferasa. En este caso, marcar la extremidad isquémica en el sitio de la célula de la inyección.
8. Continuar midiendo la señal de luciferasa cada 3-5 minutos hasta que la señal llega a un pico y comienza a declinar. Este es el valor utilizado para la comparación en todos los ratones y en varios puntos de tiempo.
9. Cuando termine, quite a los ratones de la cámara y de la anestesia. Mantener caliente hasta que los ratones re-despertar.

7. Laser Doppler Perfusión

1. Imágenes de perfusión Doppler con láser se realiza como se describe anteriormente. ⁸ El procedimiento se describe brevemente aquí.
2. Antes de Doppler el ratón debe estar bien afeitado en las áreas que cubren los dos miembros posteriores y en la región abdominal para evitar artefacto debido al cabello.
3. Cuando se prepara para la imagen Doppler, el mouSE debe ser anestesiado como se describe anteriormente.
4. Caliente el ratón para 36 ° C en una placa caliente mientras se monitorea la temperatura corporal mediante termómetro rectal.
5. Coloque el ratón sobre una superficie de color negro no reflectante y mantener anestesiado por cono de la nariz. El ratón debe ser colocado en su superficie dorsal, con sus extremidades expuestas de manera uniforme.
6. Coloque el sensor de láser Doppler aproximadamente 15 cm por encima del ratón y dirigir el puntero láser del sensor hacia la región de la ingle del ratón.
7. Cuando el ratón y el sensor Doppler están en posición, las imágenes se pueden tomar utilizando el software LDPIwin pulsando el botón Start.
8. Las medidas relativas perfusión podrían adoptarse, indicando ambos miembros posteriores (isquémico y no isquémico) como región de interés (ROI). La relación de promedio de perfusión de la extremidad posterior isquémica de la no isquémica indicará la perfusión relativa.

8. Procedimiento de la cosecha de tejidos

1. Cuando se prepara para tis ratón de cosechademandar por histología y / o procesamiento bioquímico, el ratón debe ser sacrificado. Aquí, el ratón es sacrificado mediante la exposición a 5% de isoflurano durante 3-5 min, a continuación la eutanasia el ratón por dislocación cervical.
2. Cortar la piel que recubre la extremidad posterior que rodea circunferencialmente a la región abdominal distal y proximal a la extremidad posterior. La piel se corta de la ventral a las superficies dorsales, de tal manera que la piel se puede tirar hacia atrás sobre el miembro posterior para el pie.
3. Al tirar de la piel de la espalda, las extremidades podría ser amputada mediante la utilización de tijeras de disección roma para cortar en la articulación de la pelvis y el fémur.
4. Dos tejidos principales son tomados para el análisis: los músculos aductores mediales y los músculos gemelos.
5. Para histología, insertar uno o ambos tejidos en la temperatura óptima de corte (OCT) para cryosectioning.
6. Para el análisis bioquímico, recoger uno o ambos tejidos en un Eppendorf de 1,5 ml y sumergir en un baño de nitrógeno líquido durante al menos 2 min. Las muestras pueden seralmacenado a -80 ° C para el procesamiento futuro.

Results

Al mezclar juntos, el polímero cargado positivamente (C32-122) y el plásmido de ADN auto-ensambla con carga negativa en las nanopartículas. La formación de nanopartículas se puede confirmar mediante el análisis de electroforesis es decir, la formación de complejos entre C32-122 y el ADN plasmídico se prevenir la movilización del ADN durante la electroforesis. El polímero sirve como un reactivo de transfección para facilitar el incremento de la absorción de ADN en las células diana y la expresión subsiguiente de...

Discussion

Aquí se presenta un método para programar las células madre adultas para sobreexpresar factores terapéuticos utilizando nanopartículas biodegradables no virales. Esta plataforma es particularmente útil para el tratamiento de enfermedades en las que las células madre, naturalmente, puede casa, tales como la isquemia y el cáncer. ^9-10 Además, la plataforma de administración de genes no viral permite la sobreexpresión transitoria de factores terapéuticos, que es adecuado para la mayoría de la regeneración de tej...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
Suero fetal bovino	Invitrogen	10082
Penicilina/Estreptomicina	Invitrogen	15070
Factor de crecimiento básico de fibroblastos	Peprotech	100-18B
1,4-butanodiol Diacrilato (90 %)	Sigma Aldrich	411744	Acrónimo: C
5- amino-1-pentanol (97 %)	Alfa Aesar	2508-29-4	Acrónimo: 32
Tetraetilenglidodinamina > 99 %)	Molecular Biosciences	17774	Acrónimo: 122
Acetato de sodio	G-Biosciences	R010
Fosfato tamponado solución salina	Invitrogen	14190-144
Tetrahiofurano anhidro (> 99.9 %)	Sigma Aldrich	401757
éter dietílico anhidro (> 99 %)	Fisher Scientific	E138-4
DMSO anhidro (> 99.9 %)	Sigma Aldrich	276855
Gelatina	Sigma Aldrich	G9391
Tripsina-EDTA	Invitrogen	25200
D-luciferina	GoldBio
Temperatura óptima de corte (O.C.T)	Tissue-Tek	4583
Rat anti-Mouse CD31	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 594 anti-ratas IgG	Invitrogen	A11007