Determinación de la estructura y coordinación de complejos péptido-metal mediante RMN 1D y 2D 1h

Resumen

Se determinó la estructura de la solución de RMN de un péptido modelo de metalochaperona con Cu (I), y se describe un protocolo detallado desde la preparación de la muestra y la recopilación de datos 1D y 2D hasta una estructura tridimensional.

Resumen

La unión del cobre (I) por las proteínas transportadoras de metalochaperonas evita la oxidación del cobre y la liberación de los iones tóxicos que pueden participar en reacciones redox dañinas. El complejo Cu (I) del modelo peptídico de una proteína metalochaperona de unión a Cu (I), que incluye la secuencia MTCSGCSRPG (subrayado se conserva), se determinó en solución en condiciones inertes mediante espectroscopia de RMN.

RMN es una técnica ampliamente aceptada para la determinación de estructuras de solución de proteínas y péptidos. Debido a la dificultad en la cristalización para proporcionar cristales individuales adecuados para la cristalografía de rayos X, la técnica de RMN es extremadamente valiosa, especialmente porque proporciona información sobre el estado de la solución en lugar del estado sólido. En este trabajo describimos todos los pasos que se requieren para la determinación completa de la estructura tridimensional por RMN. El protocolo incluye la preparación de muestras en un tubo de RMN, la recopilación y el procesamiento de datos 1D y 2D, la asignación e integración de picos, los cálculos de mecánica molecular y el análisis de estructuras. Es importante destacar que el análisis se llevó a cabo primero sin ningún enlace metal-ligando preestablecido, para garantizar una determinación confiable de la estructura de manera imparcial.

Introducción

Los péptidos son ampliamente utilizados como modelos de proteínas, posibles pistas de fármacos y agentes terapéuticos por derecho propio. Sin embargo, su pequeño tamaño y alto grado de flexibilidad a menudo impiden la determinación de la estructura por rayos X debido a las dificultades en la cristalización.

La resonancia magnética nuclear (RMN) se puede utilizar para determinar las estructuras e interacciones de los péptidos. El método puede proporcionar información sobre la estructura local y general, la unión y las interacciones de menor afinidad, y es aplicable a muestras difíciles, ya que se puede hacer en el estado de solución.

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. Apo-muestra: Disolver aproximadamente 1-2 mg del péptido en 450-500 μl de disolvente de grado RMN deuterado (las soluciones preferibles para muestras biológicas son D2O al 10% en agua o d6-DMSO ^11-12 si la muestra no se disuelve en agua o reacciona con ella).
2. Muestra reaccionada con cobre: Disuelva aproximadamente 1-2 mg del péptido con una cantidad equimolar de sal metálica en 450-500 μl del disolvente de RMN.
3. Filtre la solución utilizando un vidrio sinterizado, papel de filtración o cualquier otra técnica que se adapte a los compuestos bajo investigación y no los adsorba. Esto es esenci....

Resultados

Como parte de un estudio continuo sobre modelos de proteínas que se unen al cobre, se determinó mediante resonancia magnética nuclear en estado de solución la estructura de la secuencia conservada MT/HCXXC dentro del péptido lineal MTCSGCSRPG. El péptido fue hecho reaccionar con CuCl en un entorno inerte y el pH se midió en aproximadamente 3,0 mediante un indicador universal. La región de amida del péptido mostró una expansión tras la reacción con cobre, pasando de 6,7-8,5 a 6,6-9,0 ppm (Figura 2). El en.......

Discusión

La contribución de la información estructural para comprender los mecanismos de unión es bien aceptada. Los péptidos son útiles como modelos para la unión e interacciones de proteínas; sin embargo, no son susceptibles al método principal para la determinación de la estructura, la cristalografía de rayos X. La RMN es particularmente útil para estos sistemas, ya que las estructuras se pueden resolver fácilmente en solución. Esto es especialmente para el caso de los miméticos de metalochaperonas que además requieren la dete.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Espectrómetro Avance DMX 600 MHz Bruker
Tubos de muestra de RMN	Wilmad	535-PP
Guantera	MBraun	LM05-019
Liofilizador	VirTis	de sobremesaK
Péptido	BioChemia	Hecho a medida	>95% de pureza
Cloruro de cobre (1)	Aldrich	224332
Ácido clorhídrico	BioLab	231-595-7
Hidróxido de sodio	Gadot	1310-73-2
d6-Dimetilsulfóxido Aldrich	236926
Óxido de deuterio	Aldrich	151882