Heat-inducida por antígenos de recuperación: un método eficaz para detectar e identificar tipos de células progenitoras durante la neurogénesis del hipocampo adulto

Resumen

Durante la neurogénesis del hipocampo adulto, un conjunto distinto de marcadores genéticos se expresan cuando un reposo neuronal secuencial de células madre progresa y se desarrolla en una neurona funcionalmente integrado en el circuito. El uso de la recuperación de antígeno inducida por calor, tipos de células progenitoras que son de otro modo difíciles de detectar se identifican con una eficacia mejorada.

Resumen

Los métodos tradicionales de inmunohistoquímica (IHC) siguientes de fijación del tejido permiten la visualización de varios tipos de células. Estos suelen proceder a la aplicación de anticuerpos para unirse a antígenos e identificar células con características que son una función de la biología y el desarrollo inherente. Neurogénesis en el hipocampo de adultos es un proceso secuencial en la que una célula madre neural de reposo puede convertirse en activa y proceder a través de las etapas de la proliferación, la diferenciación, la maduración y la integración funcional. Cada fase es distinta con una morfología característica y la regulación positiva de genes. La identificación de estas fases es importante entender los mecanismos de regulación en el juego y cualquier alteración en este proceso que subyacen en la fisiopatología de los trastornos debilitantes. Nuestro enfoque de recuperación de antígeno inducida por el calor mejora la intensidad de la señal que se detecta y permite la correcta identificación del tipo de células progenitoras. Como se discutió en estepapel, sobre todo, nos permite evitar los problemas actuales en la detección de ciertos tipos de células progenitoras.

Introducción

La neurogénesis, la generación de nuevas neuronas a partir de células madre neurales, ahora se sabe que se producen constantemente en la edad adulta en dos regiones especializadas en el cerebro. Estos incluyen la zona subventricular (SVZ) de el bulbo olfativo y la zona subgranular (SGZ) de la circunvolución dentada en el hipocampo. Durante la última década, el campo de la neurogénesis del hipocampo adulto ha visto un trabajo importante. La región ha atraído mucho interés ya que las neuronas recién nacidas en la SGZ contribuyen a la plasticidad neuronal mejorada que puede mantener las funciones cerebrales específicas ^1-5. Neurogénesis del hipocampo adulto se ha implicado a desempeñar un papel importante en la regulación del estado de ánimo, la regeneración y el aprendizaje y la memoria. Por lo tanto, ha habido un esfuerzo concertado para entender el desarrollo y la regulación de las neuronas en este rico nicho neurogénico.

Un aspecto inevitable e importante de estudiar neurogénesis del hipocampo adulto es la identificación de sta separadobios que una célula madre neural activado atraviesa en su camino a convertirse en una neurona completamente funcional. En este proceso, la célula madre neural de reposo se activa y procede a través de una serie de principios activos y finales de los tipos de células progenitoras activas (Figura 1). Estas poblaciones distintas de progenitores neurales pueden ser identificadas por la morfología y su expresión de marcadores moleculares tales como MCM2, nestina, tbr2 y Doublecortin (DCX) y NeuN que guían la conversión de RGLs en sus respectivos tipos de células progenitoras. La nestina es una proteína de filamento intermedio que se expresa a través de las células de la glia-como radiales y algunos tipos de células progenitoras tempranas. Otro marcador es tbr2 que se expresa específicamente en las células progenitoras de amplificación. La expresión del transgén tbr2 está inicialmente apagada en las células de tipo 1 (radial-glia similares), activado a través de los Type-2a, progenitores-Type 2ab y Type-2b y apagó entre los más diferenciado Type-3 e inmaduroneuronas (Figura 1). DCX es un marcador de la migración neuronal que se expresa en el Tipo-2ab, Tipo-2b y Tipo-3 progenitores neurales. El uso de esta combinación de tres marcadores, podemos etiquetar subtipos distintos de progenitores neurales. Estos incluyen el tipo 1 (MCM2 + nestin + tbr2-), Tipo-2a (MCM2 + nestin + tbr2 +), Tipo-2ab (MCM2 parcial + nestin-tbr2 + y parcial MCM2 + tbr2 + DCX-), Tipo-2b ( MCM2 + + tbr2 DCX +) y Tipo-3 (MCM2 + tbr2-DCX +). Células post-mitóticas tales como las neuronas inmaduras y funcionalmente integrados pueden ser identificados mediante la utilización de DCX y el marcador neuronal maduro, NeuN.

Los métodos tradicionales de IHC utilizan anticuerpos para identificar antígenos para tipos de células específicas en función de su expresión génica. La visualización posterior a través de técnicas de formación de imágenes de alta resolución tales como la microscopía confocal se puede utilizar para su identificación. Sin embargo, actualmente hay problemas que existen con estos métodos que no permiten la identificación eficaz delos tipos de células de células glia-como radiales y progenitoras tempranas. Es difícil identificar estos tipos de células particulares debido a que el anticuerpo aplicado no es capaz de penetrar y unir la proteína nestina de manera eficiente. La nestina es la proteína de filamento intermedio que comprende los procesos radiales producidas por la célula-glía como radial. La ineficiente de unión de un anticuerpo al antígeno puede ser el resultado de muchos factores, incluyendo tiempo de fijación, la temperatura y la técnica utilizada ^6-7. Para ayudar a resolver estos problemas, hemos desarrollado un antígeno de recuperación o método de "ebullición". Además de nestina, este método de recuperación de antígeno también mejora la tinción para otros marcadores tales como Ki67, BrdU, la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), tbr2 y MCM2. Nuestro método combina junto enfoques químicos y físicos. Se trata de la fijación química del tejido en paraformaldehído y la posterior alta temperatura de ebullición de secciones de hipocampo coronales delgadas en un tampón de un desnaturalizante y chaotroptratamiento IC. Esto mejora la accesibilidad del antígeno al anticuerpo, mejora la especificidad del anticuerpo y permite una mejor identificación de los tipos de células progenitoras. Nuestro enfoque es simple de usar que requiere herramientas y reactivos en su mayoría ya están disponibles en el laboratorio. Hemos utilizado extensivamente para estudiar el desarrollo de las células madre neurales y su regulación a través de factores ambientales o genéticos intrínsecos extrínsecos ^8.

Protocolo

1. Pre-inmunohistoquímica: Perfusión e Histología

1. Perfundir ratones según un protocolo transcardial generales adaptados para los ratones y extraer los cerebros en paraformaldehído al 4% (PFA) ^9.
2. Agregar los cerebros en PFA durante la noche a 4 ° C (por ejemplo, un tubo cónico de 10 ml llena con PFA). Tenga en PFA durante al menos 12 a 24 horas, no más de 36 horas para el pleno fijación. Después de la fijación durante la noche, vaciar PFA de tubo cónico, pero dejan el cerebro por dentro. Verter 30% de sacarosa en el tubo y lavar los cerebros durante un breve 5 segundos para eliminar cualquier PFA residual. Finalmente, el tubo de llenado que contiene cerebros con 30% de sacarosa de nuevo. Mantener el cerebro en sacarosa a 4 ° C hasta que el cerebro se hunden hasta el fondo del tubo.
3. Cortar 40 micras secciones del cerebro en un micrótomo. Consulte a un atlas de cerebro de ratón para iniciar la recogida de las secciones desde el principio del giro dentado hasta su extremo. Preservar secciones de solución anticongelante (una receta simple es de 300 g de sacarosa en 500 ml de 0,1 M PBS y 300 ml ethileno glicol) hasta que esté listo para inmunohistoquímica.
4. Monte el tejido cortado en portaobjetos de microscopio específicamente diseñadas para adherirse fuertemente a los tejidos. Estas diapositivas proporcionan una fuerte influencia en el tejido durante la fase de ebullición. Después de montar el tejido, por favor, dejar secar diapositivas durante 10 min o hasta que esté completamente seco. El secado puede ser acelerado si el portaobjetos se apoyó en una superficie vertical con el borde inferior de la diapositiva en una toalla de papel. Si se está montando más de una diapositiva, el otro carro (s) se puede dejar secar durante ese tiempo (1-2 horas está bien) hasta que esté listo para proceder con el siguiente paso.
5. Una vez que la diapositiva está seca, lavar con PBS tres veces durante 5 minutos cada uno y seco otra vez (tampón PBS = M NaCl 0,137, 0,0027 M KCl, 0,0119 M Na ₂ PO _4). Esto garantiza que la química anterior (tales como glicerol a partir de solución de almacenamiento anticongelante) se elimina suficientemente y no puede perjudicar la adherencia del tejido a la diapositiva.

2. Preparación de los reactivos y Minor Equipos

1. Preparar Solución A (0,1 M o ácido cítrico 19,21 g / l) y la solución B (0,1 M o 24,9 g l de citrato / Tris-sodio) en la que se pueden hervir secciones de tejido.
2. En un cilindro graduado, combinar 9 ml de la solución A y 41 ml de la solución B. Añadir 450 ml de _ddH2O a esta mezcla.
3. Vierta esta mezcla en un recipiente vacío (por ejemplo, una caja de puntas de pipeta de vacío) que es apto para microondas.

3. Inducida por calor La recuperación del antígeno

1. Hervir la solución hecha en el paso 2 durante 5 minutos a la elaboración de normas en el microondas estándar. La solución se iniciará de ebullición a o por encima de 100 ° C.
2. Una vez que hierva, retire con cuidado el recipiente del horno de microondas y coloque las diapositivas secas en él, lo que garantiza la diapositiva-cara con secciones de hipocampo está mirando hacia abajo y totalmente expuesta al líquido. Si es posible, coloque los portaobjetos en un ángulo contra las paredes de la caja y la pila otras diapositivas que les rodean. Asegurar su "encajar" dentro de la caja de is apretado para las diapositivas no tienen espacio para moverse en la parte superior de uno al otro.
3. Hierva esta mezcla con diapositivas durante 7 minutos a los ajustes estándar en el microondas. La solución se hierve durante este tiempo en o por encima de 100 ° C.
4. Durante esta etapa de ebullición, llenar dos cubos de hielo hasta la mitad con hielo.
5. Una vez que hierva en el paso 3.3, retire el recipiente del horno de microondas y colocarlo dentro de uno de los cubos de hielo. Verter el resto del hielo desde el otro cubo de todo el recipiente y cubrir por completo. Dejar reposar durante 1 hora.

4. Primaria y Secundaria tinción de anticuerpos

1. Al final del período de espera de 1 hora, eliminar las diapositivas desde el recipiente y lavar con TBS-T 3x tampón durante 5 min cada uno. Cualquier aparato puede ser utilizado para llevar a cabo estos lavados básicos. (Tampón TBS = Tris HCl 50 mM, NaCl 150 mM, TBS-T = 0,05% de Triton X-100 tampón TBS, TBS-TT = 4% de suero de burro tampón TBS-T).
2. Después del lavado, deje que los portaobjetos se sequen en un lugar oscuro ( Por ejemplo, dentro de un cajón de banco, coloque una toalla de papel en el interior del cajón y la inclinación de la diapositiva en contra de ella) durante 5-10 minutos o hasta que la diapositiva es totalmente seco. Durante este período, preparar una cámara para la tinción de anticuerpo primario durante la noche. Una cámara de tinción simple puede incluir un recipiente con un área superficial grande lleno de _ddH2O y una etapa en el interior del recipiente, en la parte superior de la cual la corredera puede apoyarse por encima de la ddH ₂ O.
3. Una vez que el carro se haya secado, dibuja un contorno alrededor de las secciones de tejido utilizando una pluma repelente al agua. Durante el paso 4.5, este esquema actúa como una barrera que impida la mezcla de anticuerpo que fluye sobre.
4. Preparar la mezcla de anticuerpo primario en TBS-TT. Por lo menos 500 l se requiere para cubrir toda una diapositiva, por ejemplo, si el anticuerpo de valores es en 1:500 concentración, añadir 1 l de anticuerpo particular, para 500 l de TBS-TT). Utilizar anticuerpos primarios como se menciona en la tabla reactivos.
5. Colocar el portaobjetos secos en la parte superior de la etapa en la víaaining cámara. Añadir 500 l de los anticuerpos primarios lentamente y cubrir toda la superficie. Cubra el aparato entero y envolver en papel de aluminio para bloquear la luz externa. Dejar reposar durante toda la noche a temperatura ambiente.
6. El día siguiente, lavar el portaobjetos tres veces durante 5 minutos cada uno con tampón TBS-T. Deje que se seque en un lugar oscuro, como se describe en el paso 4.2.
7. Preparar la mezcla de anticuerpo secundario similar a la etapa 4.4. Consulte la tabla de reactivos para anticuerpos secundarios.
8. Colocar el portaobjetos en la cámara de secado tinción como se describe en los puntos 4.2 y 4.5. Añadir 500 l de los anticuerpos secundarios lentamente y cubrir toda la superficie. Envuelva la cámara de tinción en papel de aluminio para protegerlo de la luz externa. Dejar reposar cubierto y protegido de la luz exterior durante al menos 2 horas a temperatura ambiente.
9. Después de la terminación de la tinción secundaria, lavar el portaobjetos tres veces durante 5 minutos cada uno con tampón TBS-T. Deje que el portaobjetos seco en una zona oscura. Después del secado, ponga solución de montaje y cubrir la diapositiva won un cubreobjetos evitando cuidadosamente toda introducción de burbujas. Deje que el portaobjetos se sientan en una zona oscura durante al menos 2 horas antes de su análisis posterior.
10. Realice time-lapse o análisis confocal en el tejido manchado.

Resultados

Neurogénesis en el hipocampo de adultos es un proceso secuencial en el que el tipo de células progenitoras representante en cada etapa puede ser identificado con una combinación de marcadores. Fijación química cuidadosa y antígeno de recuperación mejora la eficacia y la accesibilidad de los marcadores que son difíciles de detectar. Uno de ellos es nestina que se expresa entre las células madre radiales-gliales como neuronales y algunos tipos de células progenitoras tempranas activos. Nestin puede ser una proteína clave ...

Discusión

Los pasos más importantes para el éxito de la recuperación de antígeno y la tinción de tipos de células progenitoras son: 1) la utilización de buena perfusión y tejido fijado del espesor coronal óptima; 2) con tiempo suficiente para la ebullición y posterior enfriamiento durante la recuperación de antígenos, y 3) la destreza manual en montaje secciones coronales fijos y prevenir su daño al hacerlo.

Es crítico para IHC usar tejido perfundido que ha sufrido suficiente fijación pero no sobre-fi...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
SuperFrost Plus Slide	Fisherbrand	12-550-15	Proporciona una fuerte adherencia al tejido del hipocampo durante la ebullición
PVA/DABCO Medios de montaje	Sigma Aldrich	10981-100 ml
Nestin (pollo)	Aves Lab	NES	Marcador de células madre neurales
GFAP (conejo)	Dako North America	Z033401-2 Marcador de	astrocitos y células madre neurales
MCM2 (ratón)	Laboratorio de Transducción BD	610701	Marcador de proliferación
DCX (cabra)	Santa Cruz Biotechnology	SC8066	Marcador de neuronas inmaduras
Tbr2 (conejo)	Abcam	Ab23345	Marcador progenitor amplificador
NeuN (ratón)	Millipore	MAB377	Marcador de neuronas maduras
Cy2 (anti-conejo)	Jackson Immunoresearch	111-226-047
Cy2 (anti-pollo)	Jackson Immunoresearch	303-165-006
Cy5 (anti-ratón)	Jackson Immunoresearch	315-175-047
Cy5 (anti-cabra)	Jackson Immunoresearch	305-165-047
DAPI	Life Technologies Corporation	D1306
Dako	Bolígrafo S2002	Dako	Bolígrafo repelente al agua