Procedimiento para el Desarrollo de la Multi-profundidad Circular transversal endotelizado microcanales-on-a-chip

Resumen

Una plataforma de micro-canales-on-a-chip fue desarrollado por la combinación de la técnica de fotolitografía reflowable fotosensible, litografía blanda, y microfluidos. La plataforma de microcanales endotelizado imita la geometría tridimensional (3D) de microvasos in vivo, se ejecuta bajo flujo de perfusión continua controlada, permite la formación de imágenes de alta calidad y en tiempo real y se puede aplicar para la investigación microvascular.

Resumen

Los esfuerzos se han centrado en el desarrollo de ensayos in vitro para el estudio de microvasos porque en estudios con animales in vivo son más que consume tiempo, es caro, y la observación y cuantificación son muy desafiante. Sin embargo, convencional en los ensayos de microvasos in vitro tienen limitaciones cuando se representa en microvasos in vivo con respecto a la geometría tridimensional (3D) y proporcionar flujo de fluido continuo. Usando una combinación de la técnica de fotolitografía reflowable fotosensible, litografía blanda, y microfluidos, hemos desarrollado un multi-profundidad endotelializadas transversales circulares microcanales-on-a-chip, que imita a la geometría 3D en vivo microvasos y se ejecuta bajo perfusión continua controlada flujo. Un fotoprotector reflowable positivo se utilizó para fabricar un molde principal con una red de microcanales de sección transversal semicircular. Por la alineación y unión de los dos (PDMS) microcanales polidimetilsiloxano replicated del molde maestro, se creó una red de microcanales cilíndrica. Los diámetros de los microcanales pueden ser bien controlados. Además, las células primarias endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) sembradas dentro del chip mostraron que las células se alineaban en la superficie interior de los microcanales de acuerdo con la perfusión controlada duradera para un período de tiempo entre 4 días a 2 semanas.

Introducción

Los microvasos, como una parte del sistema de circulación, median las interacciones entre la sangre y los tejidos, apoyar las actividades metabólicas, definir microambiente del tejido, y desempeñan un papel crítico en muchas condiciones patológicas y de salud. Recapitulación de microvasos funcionales in vitro podría proporcionar una plataforma para el estudio de fenómenos vasculares complejas. Sin embargo, convencional en los ensayos de microvasos in vitro, tales como ensayos de migración de células endoteliales, ensayos de formación de tubos endoteliales, y ensayos de anillos aórticos de rata y de ratón, no son capaces de recrear la microv....

Protocolo

1. La fotolitografía Fabricación de Fotoresinas Molde Maestro

El siguiente protocolo muestra el proceso para la fabricación de los microcanales con diámetros entre 30-60 micras. Para obtener un microcanal con un diámetro más pequeño (menos de 30 micras), un solo giro de recubrimiento de resina fotosensible se necesita.

1. Transferir la resina fotosensible reflujo de la nevera a 4 ° C para la sala limpia 24 horas antes de su uso y deje que se caliente a temperatura ambiente.
2. Limpiar una oblea de silicio y hornear durante una hora a 150 ° C para permitir que se deshidrate. La deshidratación se ayudar a la adhesión a la res....

Resultados

Nuestro enfoque para la fabricación de la red de microcanales de múltiples profundidad imita las complejas geometrías 3D de microvasos in vivo, en el que los microcanales han redondeado las secciones transversales ^15. Además, los diámetros de los canales de ramificación matrices y los canales de memoria de aproximadamente obedecen la ley de Murray para mantener el flujo de fluido a un nivel requerido para que la resistencia total del canal es baja y velocidades de flujo son más uniforme en toda la re.......

Discusión

1. Fabricación del molde maestro

Uno de los principios rectores para el diseño y la morfometría vascular se conoce como la ley de Murray ^16, que establece que la distribución de los diámetros de los vasos a lo largo de la red se rige por consideraciones de energía mínimo. También establece que el cubo de los diámetros de un vaso principal en una bifurcación es igual a la suma de los cubos de los diámetros de los vasos hija (

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
fuerte/material
fotorresistente	AZ Materiales electrónicos	AZP4620
	AZ Materiales electrónicos AZ Materiales electrónicos AZ	400K
PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
MCDB 131 Medio de cultivo	Invitrogen	10372-019
NacBlue Nuclei Tinción	Invitrogen	H1399
PKH Red Stain	Sigma	MINI26 y PKH26GL
Fibronectina	Gibco	PHE0023
L-Glutamina	Sigma	G7513
Fosfato Solución Salina Tamponada	Invitrogen	14040-133
HEPES Solución Salina Tamponada	Lonza	CC-5024
Tripsina/EDTA	Invitrogen	25300-062
Solución neutralizante de tripsina	Lonza	CC-5002
PDMS Agente de curado	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Células endoteliales primarias de la vena umbilical humana	Lonza	CC-2517
Suero fetal bovino	Lonza	14-501F
Diluyente C	Sigma	CGLDIL
Hoechst33342	Invitrogen, Sondas Moleculares	R37605
Dextrano	Sigma	95771
3.5% Paraformaldehído	Microscopía Electrónica Ciencia	15710-S
Equipment
Spinner	Laurell Technologies Corporation	WS-400BZ-6NPP/
	Productos BelArt	999320237
invertido	Nikon	Eclipse Ti
	Harvard Apparatus	PHD Ultra
Laminar Campana de bioseguridad	Thermo Scientific	1300 Series A2
Mezclador centrífugo planetario	Thinky	ARE-310
Horno Isotemp	Fisher Scientific	13-246-516GAQ
Microscopio óptico	Zeiss	Invertoskop 40C
Limpiador de plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Placa calefactora	Barnstead/Thermolyne Cimarec	SP131635
Microscopio confocal de barrido láser	Zeiss	LSM 510

Desarrollador de Desecador LITE Microscopio Sistema de bomba de jeringa