Procedimiento para el Desarrollo de la Multi-profundidad Circular transversal endotelizado microcanales-on-a-chip

Summary

Una plataforma de micro-canales-on-a-chip fue desarrollado por la combinación de la técnica de fotolitografía reflowable fotosensible, litografía blanda, y microfluidos. La plataforma de microcanales endotelizado imita la geometría tridimensional (3D) de microvasos in vivo, se ejecuta bajo flujo de perfusión continua controlada, permite la formación de imágenes de alta calidad y en tiempo real y se puede aplicar para la investigación microvascular.

Abstract

Los esfuerzos se han centrado en el desarrollo de ensayos in vitro para el estudio de microvasos porque en estudios con animales in vivo son más que consume tiempo, es caro, y la observación y cuantificación son muy desafiante. Sin embargo, convencional en los ensayos de microvasos in vitro tienen limitaciones cuando se representa en microvasos in vivo con respecto a la geometría tridimensional (3D) y proporcionar flujo de fluido continuo. Usando una combinación de la técnica de fotolitografía reflowable fotosensible, litografía blanda, y microfluidos, hemos desarrollado un multi-profundidad endotelializadas transversales circulares microcanales-on-a-chip, que imita a la geometría 3D en vivo microvasos y se ejecuta bajo perfusión continua controlada flujo. Un fotoprotector reflowable positivo se utilizó para fabricar un molde principal con una red de microcanales de sección transversal semicircular. Por la alineación y unión de los dos (PDMS) microcanales polidimetilsiloxano replicated del molde maestro, se creó una red de microcanales cilíndrica. Los diámetros de los microcanales pueden ser bien controlados. Además, las células primarias endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) sembradas dentro del chip mostraron que las células se alineaban en la superficie interior de los microcanales de acuerdo con la perfusión controlada duradera para un período de tiempo entre 4 días a 2 semanas.

Introduction

Los microvasos, como una parte del sistema de circulación, median las interacciones entre la sangre y los tejidos, apoyar las actividades metabólicas, definir microambiente del tejido, y desempeñan un papel crítico en muchas condiciones patológicas y de salud. Recapitulación de microvasos funcionales in vitro podría proporcionar una plataforma para el estudio de fenómenos vasculares complejas. Sin embargo, convencional en los ensayos de microvasos in vitro, tales como ensayos de migración de células endoteliales, ensayos de formación de tubos endoteliales, y ensayos de anillos aórticos de rata y de ratón, no son capaces de recrear la microvasos in vivo con respecto a la geometría tridimensional (3D) y de control de flujo continuo ^1-8. Estudios de microvasos utilizando modelos animales y en ensayos in vivo, tales como ensayo de angiogénesis corneal, ensayo de angiogénesis de membrana corioalantoidea de pollo, y el ensayo de tapón de Matrigel, son más tiempo, alta en costo, desafiando con respecto a la observación y cuantificaciones, yplantear cuestiones éticas ^{1, 9-13.}

Los avances en la microfabricación y tecnologías de chips de microfluidos han permitido una gran variedad de conocimientos sobre ciencias biomédicas, mientras reduciendo el alto costo y la complejidad asociados con los animales de experimentación y en estudios in vivo ^14, como las condiciones biológicas controladas fácilmente y firmemente y entornos fluidos dinámicos, que no tendrían sido posible con las técnicas convencionales macroescala.

A continuación, presentamos un método para construir un endotelizado microcanales-on-a-chip que imita la geometría 3D de in vivo microvasos y se ejecuta bajo flujo de perfusión continua controlada mediante el uso de la combinación de la técnica de fotolitografía reflowable fotosensible, litografía blanda, y microfluidos.

Protocol

1. La fotolitografía Fabricación de Fotoresinas Molde Maestro

El siguiente protocolo muestra el proceso para la fabricación de los microcanales con diámetros entre 30-60 micras. Para obtener un microcanal con un diámetro más pequeño (menos de 30 micras), un solo giro de recubrimiento de resina fotosensible se necesita.

1. Transferir la resina fotosensible reflujo de la nevera a 4 ° C para la sala limpia 24 horas antes de su uso y deje que se caliente a temperatura ambiente.
2. Limpiar una oblea de silicio y hornear durante una hora a 150 ° C para permitir que se deshidrate. La deshidratación se ayudar a la adhesión a la resina fotosensible sustrato de silicio.
3. Spin-capa de la primera capa de resina fotosensible usando la siguiente receta:

Paso	Tiempo (segundos)	Velocidad (rpm)	Aceleración
1	2	300	alto
2	10	0
3	3	300	alto
4	60	600	alto
5	10	500	alto
6	10	600	alto

4. A continuación, cocer la oblea en una placa calefactora con una temperatura de 110 ° C durante 90 seg. Después de la cocción suave el espesor de la resina fotosensible será 20-30 micras.
5. Girar capa una segunda capa de resina fotosensible siguiendo la misma receta utilizada para la primera capa.
6. Hornear suave de la oblea de nuevo colocándolo en una placa caliente con una temperatura de 110 ° C durante 90 seg. Después de esto hornear suave el espesor de la resina fotosensible será 40-60 micras.
7. Generar patrones maestros positivos mediante la exposición de la photorESIST a la luz ultravioleta con una dosis de exposición de 14.500 mJ / cm ² a través de una máscara de la película.
8. Diluir el desarrollador con agua desionizada (DI) agua (1:2 (v / v)). Enjuague la oblea repetidamente en la solución hasta que el patrón está completamente desarrollado. Luego lave la oblea con agua desionizada y séquelo con gas nitrógeno.
9. Reflujo: Lugar de la oblea en una placa caliente con una temperatura de 120 ° C durante 4 min y cubierta con una placa de Petri de vidrio para evitar la evaporación del disolvente. Retire la oblea de la placa de cocción y deje que se enfríe a temperatura ambiente. El espesor de la resina fotosensible después del reflujo, será de 50-60 micras.

2. Fabricación litografía blanda de red de microcanales PDMS

1. Preparar la solución de polidimetilsiloxano (PDMS) en la relación en peso de 10:01 (base: agente de curado) y se mezcla a fondo usando un mezclador planetario centrífuga.
2. Echad la solución de PDMS sobre la reflowed molde matriz fotosensible. Coloque el PDMS fundido en un desecador durante 15 minutos para desgasificar. Utilice gas nitrógeno para eliminar cualquier burbuja restantes si es necesario.
3. Hornear el PDMS en un horno a una temperatura de 60 ° C durante 3 horas para permitir que se cure. A continuación, retire la capa de PDMS curado del molde maestro.
4. Use un punzón afilado para crear orificios de entrada / salida haciendo agujeros en la red de canales. Limpiar la superficie de la PDMS utilizando gas nitrógeno.
5. Tratar dos capas de PDMS con plasma de oxígeno durante 30 segundos en el interior de un limpiador de plasma a una presión de funcionamiento de 4,5 x 10 ^-2 Torr y una tasa de flujo de oxígeno de 3,5 m ³ / min. A continuación, alinee las superficies de la PDMS manualmente bajo un microscopio óptico. Utilice una gota de agua si es necesario para un mejor control de la alineación.
6. Hornear el dispositivo en un horno a 60 ° C durante 30 minutos para conseguir una unión permanente.

3. Cultura HUVEC y siembra en el chip

1. Cultura las HUVEC con medio de cultivo con L-glutamina suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). Para thSe han usado pasajes experimento E entre 2 y 5.
2. Una vez que las HUVEC son confluentes, contar las células y la cosecha de ellos por primera enjuagar las células con solución salina tamponada con HEPES (HEPES-BSS), y a continuación, tratar las células con tripsina / EDTA y se incuba durante 2-6 min a 37 ° C. Después de la tripsinización es completa, neutralizar la tripsina / EDTA con tripsina solución neutralizante. Centrifugar y suspender las células en medio de cultivo con 8% de dextrano para recogerlos. El dextrano se utiliza para aumentar la viscosidad media para ayudar en la siembra de células y una mejor unión.
3. Se trata el dispositivo con plasma de oxígeno durante 5 min con una presión de funcionamiento de 4,5 x 10 ^-2 Torr y una tasa de flujo de oxígeno de 3,5 m ³ / min. A continuación, cargue el dispositivo con agua DI y tratamiento con luz UV durante 8 horas en una campana de bioseguridad laminar para la esterilización.
4. Un día antes de que las células están listas, lave el aparato con 1x tampón fosfato salino (PBS 1x) después cubra con fibronectina (100 mg / ml, dilbuido con 1x PBS) y se incuba en el refrigerador a 4 ° C durante la noche.
5. Después de que el revestimiento de la fibronectina, lave el aparato con 1x PBS y luego cargar con medio de cultivo. Incubar el dispositivo a una temperatura de 37 ° C durante 15 min.
6. Cargar las células HUVEC en medio de cultivo 8% de dextrano con una concentración de células de 3-4 x 10 ⁶ células / ml. Coloque una gota de 20 l de células a una entrada del dispositivo y la inclinación de introducir las células en el canal microfluídico. Después de 15-20 min las células comienzan a adherirse a las paredes laterales de los canales. Girar el dispositivo cada 15 minutos para crear una distribución más uniforme de las células. Si es necesario, la carga adicional se puede realizar.

4. Configuración de perfusión a largo plazo

Después de 5-6 horas de cultivo estático, las HUVECs adjuntos comenzarán a extenderse plenamente. Configure la perfusión con un sistema de bomba de jeringa con mando a distancia, con un flujo constante de 10 l / h. La perfusión se puede ajustar fo un caudal mayor, y pueden durar un período de tiempo entre los 4 días a 2 semanas.

5. Tinción de células y caracterización Microscopio

1. Cuando las células alcanzan la confluencia en el interior del dispositivo, en primer lugar, lávese el dispositivo con 1x PBS para eliminar completamente el medio. A continuación, cargar el dispositivo con colorante rojo diluido con diluyente (4 l-1 ml). Cargar el medio de contraste similar al procedimiento de carga de las células. Incubar el dispositivo en la oscuridad durante 5 min a temperatura ambiente, y luego lavar el dispositivo con medio de cultivo para detener la tinción. Largo de incubación del medio de contraste puede causar toxicidad celular y disadhesion.
2. Cargar el dispositivo con colorante azul diluido en PBS 1x (2 gotas por ml). Incubar en la oscuridad durante 5 min a temperatura ambiente, luego lavar bien el dispositivo con 1x PBS.
3. Examinar la tinción de las células bajo un microscopio óptico invertido. Si la tinción era bueno, cargue los microcanales con un medio de fijación (3,5% de paraformaldehído diluido con 1x PBS), a continuación, sumerjael dispositivo de fijación de medio y cubrir completamente con papel de aluminio. Guarde el dispositivo en el refrigerador a una temperatura de 4 ° C para evitar que el dispositivo se seque y photobleaching. El dispositivo fijo está ahora listo para la formación de imágenes confocal, que puede ser realizado por un microscopio confocal de barrido láser.

Results

Nuestro enfoque para la fabricación de la red de microcanales de múltiples profundidad imita las complejas geometrías 3D de microvasos in vivo, en el que los microcanales han redondeado las secciones transversales ^15. Además, los diámetros de los canales de ramificación matrices y los canales de memoria de aproximadamente obedecen la ley de Murray para mantener el flujo de fluido a un nivel requerido para que la resistencia total del canal es baja y velocidades de flujo son más uniforme en toda la re...

Discussion

1. Fabricación del molde maestro

Uno de los principios rectores para el diseño y la morfometría vascular se conoce como la ley de Murray ^16, que establece que la distribución de los diámetros de los vasos a lo largo de la red se rige por consideraciones de energía mínimo. También establece que el cubo de los diámetros de un vaso principal en una bifurcación es igual a la suma de los cubos de los diámetros de los vasos hija (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
fuerte/material
fotorresistente	AZ Materiales electrónicos	AZP4620
	AZ Materiales electrónicos AZ Materiales electrónicos AZ	400K
PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
MCDB 131 Medio de cultivo	Invitrogen	10372-019
NacBlue Nuclei Tinción	Invitrogen	H1399
PKH Red Stain	Sigma	MINI26 y PKH26GL
Fibronectina	Gibco	PHE0023
L-Glutamina	Sigma	G7513
Fosfato Solución Salina Tamponada	Invitrogen	14040-133
HEPES Solución Salina Tamponada	Lonza	CC-5024
Tripsina/EDTA	Invitrogen	25300-062
Solución neutralizante de tripsina	Lonza	CC-5002
PDMS Agente de curado	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Células endoteliales primarias de la vena umbilical humana	Lonza	CC-2517
Suero fetal bovino	Lonza	14-501F
Diluyente C	Sigma	CGLDIL
Hoechst33342	Invitrogen, Sondas Moleculares	R37605
Dextrano	Sigma	95771
3.5% Paraformaldehído	Microscopía Electrónica Ciencia	15710-S
Equipment
Spinner	Laurell Technologies Corporation	WS-400BZ-6NPP/
	Productos BelArt	999320237
invertido	Nikon	Eclipse Ti
	Harvard Apparatus	PHD Ultra
Laminar Campana de bioseguridad	Thermo Scientific	1300 Series A2
Mezclador centrífugo planetario	Thinky	ARE-310
Horno Isotemp	Fisher Scientific	13-246-516GAQ
Microscopio óptico	Zeiss	Invertoskop 40C
Limpiador de plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Placa calefactora	Barnstead/Thermolyne Cimarec	SP131635
Microscopio confocal de barrido láser	Zeiss	LSM 510