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Artículo de método

Identificación de poblaciones específicas de neuronas sensoriales para el estudio de los canales iónicos expresados

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DOI:

10.3791/50782

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24 de diciembre de 2013

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1Baker Laboratory of Pharmacology, Department of Pharmacology, Kirksville College of Osteopathic Medicine, AT Still University of Health Sciences

En este artículo

Resumen

Las neuronas sensoriales aferentes envían información sensorial desde la periferia al sistema nervioso central. La identificación de neuronas aferentes específicas ayudará a comprender su fisiología. Describimos un método de marcaje retrógrado para identificar neuronas aferentes y estudiamos los canales iónicos dependientes de voltaje en estas neuronas utilizando electrofisiología e inmunocitoquímica de patch clamp.

Resumen

Las neuronas sensoriales transmiten señales desde varias partes del cuerpo al sistema nervioso central. El soma de estas neuronas se encuentra en los ganglios de la raíz dorsal que recubren la columna vertebral. La comprensión de los receptores y canales expresados por estas neuronas aferentes sensoriales podría conducir a nuevas terapias para la enfermedad. El paso inicial es identificar el subconjunto específico de neuronas sensoriales de interés. En este trabajo describimos un método para identificar las neuronas aferentes que inervan los músculos mediante marcaje retrógrado utilizando un colorante fluorescente DiI (perclorato de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina). Comprender la contribución de los canales iónicos a la excitación de las aferencias musculares podría ayudar a controlar mejor la excitabilidad excesiva inducida por ciertos estados patológicos, como la enfermedad vascular periférica o la insuficiencia cardíaca. Utilizamos dos enfoques para identificar los canales iónicos dependientes del voltaje expresados por estas neuronas, electrofisiología de pinza de parche e inmunocitoquímica. Si bien la electrofisiología más los bloqueadores farmacológicos pueden identificar tipos de canales iónicos funcionales, utilizamos la inmunocitoquímica para identificar canales para los que no había bloqueadores específicos disponibles y para comprender mejor el patrón de distribución de canales iónicos en la población celular. Estas técnicas se pueden aplicar a otras áreas del sistema nervioso para estudiar grupos neuronales específicos.

Introducción

Los ganglios de la raíz dorsal (DRG) están compuestos por somas de neuronas aferentes que inervan varias partes del cuerpo, y se pueden obtener conocimientos importantes del estudio de las neuronas sensoriales con diferentes objetivos de inervación1. Se utilizan varios métodos indirectos o invasivos para aislar e identificar las neuronas aferentes para, por ejemplo, inyectar el nervio con marcadores como fluorogold1, inyectar tinte en los músculos mediante el método quirúrgico2. De los diferentes colorantes que se han utilizado con éxito para etiquetar neuronas y tractos neuronales, los tintes fluorescentes como DiI son ampliamente utilizados en los trazados neuroanatómicos debido a su rápida absorción por las terminales neuronales, la retención a largo plazo en las neuronas y la falta de transferencia entre neuronas3. Las neuronas aferentes marcadas con DiI se pueden visualizar fácilmente utilizando un microscopio fluorescente para un estudio detallado. Sin embargo, una limitación es que marcadores como DiI pueden perderse de las células durante la permeabilización celular necesaria para la inmunocitoquímica con epítopos intracelulares4. Aquí describimos un método que utiliza DiI inyectado en el músculo esquelético para identificar las neuronas aferentes musculares en el DRG. También describimos un método de permeabilización celular que retiene DiI en la neurona al tiempo que permite el acceso de anticuerpos a los epítopos intracelulares. Demostramos el uso de la electrofisiología y la inmunocitoquímica para estudiar estas neuronas identificadas, así como describimos las distintas ventajas de cada técnica en el estudio de los canales iónicos que controlan la excitabilidad neuronal. Finalmente, describimos los problemas potenciales que pueden dificultar la interpretación de los datos electrofisiológicos. Hemos utilizado estos métodos para identificar las neuronas aferentes musculares y cutáneas y determinar los canales de sodio (NaV) dependientes de voltaje expresados en estas neuronas identificadas8. Sin embargo, estos métodos se pueden adaptar a una variedad de preparaciones para estudiar subconjuntos identificados de neuronas que inervan un tejido objetivo o núcleo cerebral en particular.

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Protocolo

Nota: Todo el trabajo con animales debe realizarse de acuerdo con las pautas institucionales y de cuidado de animales.

1. Preparación del animal y etiquetado

  1. Anestesiar ratas: Anestesiar a una rata (típicamente 150-400 g) usando una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (50 mg/kg de peso corporal), xilacina (5 mg/kg) y acepromazina (1 mg/kg). Verifique los reflejos pellizcando el pie, espere hasta que no haya respuesta. Dado que la respuesta a la anestesia varía de un animal a otro, es mejor determinar el efecto de los anestésicos mediante la prueba de los reflejos del dolor.
  2. Solución de DiI: Pesar el polvo de DiI y disolverlo en DMSO 100% estéril para obtener una solución al 1,5% (15 mg/ml). Guarde la solución a temperatura ambiente en un ambiente seco hasta su uso.
  3. Inyecciones de DiI: afeitar el pelo sobre el área de la pantorrilla en ambas patas de la rata anestesiada con una navaja de afeitar eléctrica.
    1. Llene una jeringa estéril de 1 ml (aguja de 11/4 en 27 G) con 200 μl de solución de DiI al 1,5%. Inserte lentamente la aguja paralela al eje largo de cada músculo gastrocnemio e inyecte 100 μl de DiI en el músculo mientras retrocede lentamente la aguja fuera del músculo (~ 10 segundos) sin retirarse del músculo.
    2. Antes de retirar la aguja del músculo, tire hacia atrás del émbolo de la jeringa para asegurarse de que el tinte ya no fluya por la punta, espere 10 segundos y luego retire la aguja del músculo. Este paso evita la fuga de DiI de la aguja a la piel, lo que podría marcar aferencias cutáneas.
    3. Repita para la otra pierna.
    4. Espere de 4 a 5 días para que el DiI sea transportado desde el músculo hasta el DRG.

2. Disección y aislamiento neuronal

  1. Soluciones:
    1. Prepare la Solución Salina Balanceada de Hank (HBSS) y la Solución Salina Balanceada de Earle's (EBSS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, filtre, esterilice y almacene a 4 °C.
    2. Medio de cultivo (MEM Plus): Mezclar 89 ml de medios esenciales mínimos (MEM), 10 ml de suero fetal bovino (FBS), 1 ml de solución de penicilina-estreptomicina, filtrar, esterilizar y almacenar a 4 °C.
    3. Solución de polilisina: disolver el polvo de hidrobromuro de poli-L-lisina (10 mg/100 ml) en una solución de borato de sodio 0,1 M, pH 8,4, esterilizar por filtro y almacenar las alícuotas a -20 °C.
  2. Recubrimiento de cubreobjetos
    1. Limpie los cubreobjetos de vidrio (redondos de 12 mm) en etanol al 70% durante 3-4 horas y seque al aire en una campana de cultivo estéril.
    2. Coloque los cubreobjetos secos en la solución de polilisina O/N.
    3. Retirar de la solución de polilisina y lavar en agua destilada estéril 2 veces durante 5 minutos cada una para eliminar el exceso de polilisina.
    4. Separe los cubreobjetos, séquelos en campana de cultivo y guárdelos a 4 oC.
  3. Preparación para la disección
    1. Coloque en hielo un vaso de precipitados con 10 ml de HBSS, una placa de Petri de 35 mm y una placa de Petri de 100 mm.
    2. Enzimas de peso: 7 mg de colagenasa, 1 mg de ADNasa y 10 mg de tripsina.
    3. Precaliente un baño de agua agitada a 37 oC y coloque en el baño un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 10 ml de EBSS para calentar.
  4. disección:
    1. Sacrificar rata de acuerdo con un protocolo aprobado por IACUC. Carbon se utilizó dióxido para sacrificar a la rata.
    2. Extirpar rápidamente la espalda cortando la piel de la espalda, eliminar el tejido conectivo y muscular a lo largo de la columna vertebral para una mejor exposición y extirpar la sección lumbar de la columna vertebral (extremo de la región torácica al hueso ilíaco; Figura 1).
    3. Coloque la columna vertebral aislada en la placa de Petri de 100 mm y, con una pipeta Pasteur estéril, aplique una solución de HBSS fría para mantener la preparación húmeda y fría.
    4. Corta los músculos de los lados de la columna vertebral. Realizar una laminectomía dorsal, utilizando rongeurs o tijeras, y extraer suavemente el hueso que encierra los huecos que contienen el DRG.
    5. Aplique repetidamente HBSS helado (~ 1 ml) durante este procedimiento.
    6. Aislar el GRD cortando los nervios periféricos y centrales (dejando 1-2 mm de nervio para facilitar el manejo de los ganglios)
    7. Coloque el DRG aislado en la placa de Petri de 35 mm que contiene tampón HBSS helado.
    8. Repita hasta que todos los DRG L-4 y L-5 hayan sido aislados. La DRG torácica puede aislarse y procesarse por separado como un control negativo para el etiquetado de DiI.
    9. Coloque el plato con DRG aislado bajo un microscopio de disección y retire el exceso de nervios y vasos sanguíneos con microtijeras y pinzas.
    10. Corte el DRG para una mejor exposición a las enzimas, pero no desenvaine el DRG.
  5. Disociación de neuronas DRG:
    1. Agregue las enzimas en el medio EBSS tibio (mantenido en el baño de agua). Agitar brevemente para disolver y esterilizar con filtro.
    2. Con una pipeta Pasteur estéril, coloque todo el DRG en la solución enzimática. Minimice el volumen de HBSS que se agrega con DRG, ya que el HBSS diluirá la mezcla de enzimas. Gasifique el matraz con 95% deO2 y 5% de CO2 durante 60 segundos antes de tapar herméticamente el matraz.
    3. Incubar el matraz en el baño de agua agitable ajustado a 37 °C durante 60 min a 240 rpm.
    4. Al final de la incubación, agite vigorosamente el matraz 50x para disociar el DRG5.
    5. En condiciones estériles, añadir 5 ml de MEM Plus al matraz para detener las enzimas.
    6. Transfiera el contenido del matraz a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml y centrifugue a 16 x g durante 6 min.
    7. Retirar y desechar el sobrenadante, añadir 5 ml de MEM Plus a la muestra. Triturar suavemente con una pipeta para romper el pellet.
    8. Repita el paso de centrifugación, retire y deseche el sobrenadante y agregue 500 μl de MEM Plus. Triturar suavemente con una punta de pipeta de 1 ml en una pipeta para hacer una suspensión celular.
    9. Coloque un cubreobjetos de vidrio recubierto de polilisina en un plato estéril vacío de 35 mm. Agregue una gota (~50 μl) de la suspensión de celdas al centro del cubreobjetos.
    10. Repita hasta que se agote la solución celular.
    11. Coloque las placas de 35 mm en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 1 hora para permitir que las neuronas se adhieran a los cubreobjetos.
    12. Agregue 2 ml adicionales de medio en cada plato y devuélvalo a la incubadora.

3. Grabación de la abrazadera de parche

  1. Soluciones para el registro: estas soluciones son para el registro de corrientes de NaV. Ejemplos de soluciones con diferente composición se pueden encontrar en estas referencias5-7.
    1. Solución externa: (en mM) 45 NaCl, 100 N-metil-d-glucamina (NMG)•Cl, 4 MnCl2, 10 Na•HEPES y 10 glucosa, con pH = 7,4 y osmolaridad = 320 mOsm.
    2. Solución interna: (en mM) 104 NMG•Cl, 14 Creatina•PO4, 6 MgCl2, 10 NMG•HEPES, 5 Tris•ATP, 10 NMG2•EGTA y 0,3 Tris2•GTP con pH 7,4 y osmolaridad = 300 mOsm.
  2. Medición de corrientes iónicas:
    1. Extraiga los electrodos de registro de los capilares de vidrio en un extractor de electrodos y pula con calor las puntas con una microforja. La resistencia de los electrodos suele ser de 2-3 MΩ
    2. Identifique las neuronas DRG marcadas con DiI utilizando un microscopio con epifluorescencia y un cubo TRITC. DiI tiene una longitud de onda de excitación de 550 nm y una longitud de onda de emisión de 570 nm.
    3. Llene el electrodo de vidrio con solución interna (solo limando ~ 1 cm de la punta del electrodo) y golpee suavemente para eliminar las burbujas atrapadas. Coloque en el soporte de electrodos y muévalo a la celda usando un micromanipulador.
    4. Una vez que el electrodo toque la celda, aplique una succión suave a través del tubo de succión, hasta que se forme un sello hermético (determinado por el aumento de la resistencia del electrodo).
    5. Fije el voltaje de la membrana al potencial de retención deseado (generalmente de -60 a -120 mV).
    6. Obtenga la configuración de abrazadera de parche de celda completa aplicando una succión más fuerte para eliminar el parche de membrana en la punta del electrodo. La transición a la configuración de celda completa se observa eléctricamente como un aumento en la corriente capacitiva8-10.
    7. Compense la resistencia en serie utilizando los circuitos de compensación del amplificador de abrazadera de parche (use al menos un 80% de compensación)8,10.

4. Inmunocitoquímica

  1. Fije las neuronas en los cubreobjetos con paraformaldehído al 4% durante 1 hora y luego permeabilice con Tween 20 al 2% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 10 min.
  2. Incubar las células fijas O/N en una solución de bloqueo (suero normal o albúmina sérica bovina) más el anticuerpo primario, que es un anticuerpo desarrollado para unirse a un antígeno específico de interés.
  3. Incubar un conjunto de control de neuronas O/N en una solución de bloqueo que carece de los anticuerpos primarios.
  4. Lave los cubreobjetos con tampón PBS 3 veces durante 5 minutos, seguido de 2 lavados de 5 minutos cada uno con 1% de Tween 20 para eliminar el anticuerpo primario no unido.
  5. Incubar los cubreobjetos de prueba y control con el anticuerpo secundario marcado con fluorescente adecuado, que se une al anticuerpo primario para permitir la visualización.
  6. Lave los cubreobjetos con PBS 3x durante 5 minutos para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios.
  7. Monte los cubreobjetos en un portaobjetos de vidrio limpio utilizando medios de montaje.
  8. Aplique esmalte de uñas transparente en el borde del cubreobjetos para fijarlo en su lugar. Una vez secas, visualice las neuronas y capture imágenes utilizando el software que acompaña al microscopio de fluorescencia.
    Nota: En este trabajo se utilizó un microscopio Nikon con el software NIS-elements BR 3.2. El tiempo de exposición se optimizó y se mantuvo igual para los portaobjetos de control y de prueba.
  9. Mida la intensidad de la fluorescencia y el tamaño de las células de las neuronas individuales utilizando un software de imágenes como ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij/index.html).

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Resultados

Mediante el método descrito aquí, identificamos neuronas aferentes musculares en los ganglios de la raíz dorsal y procedimos a determinar los canales de sodio activados por voltaje (NaV) expresados por estas neuronas. Las neuronas aferentes musculares marcadas con DiI (Figura 1C) representaron una pequeña fracción de la población total de neuronas en el ganglio de la raíz dorsal, con un promedio del 16 % de las neuronas (167/1047) marcadas. La cuantificación se realizó midiendo primero la fluorescencia m...

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Discusión

Los aferentes musculares que se originan en los músculos tríceps surales (por ejemplo, gastrocnemio) se han utilizado en múltiples estudios para investigar el reflejo presor del ejercicio (EPR)13. Dado el interés en estudiar las neuronas sensoriales que median el EPR, se seleccionaron los músculos gastrocnemios para la inyección de tinte. Se eligió DiI debido a su naturaleza lipofílica y porque no se pierde de la neurona por difusión a través de la membrana plasmática intacta3,14. Usando es...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Grant AR059397 (KSE).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
NaV 1.8AbcamAb93616
NaV 1.1 / 1.6/ 1.7 y 1.9Alamone Labs, Jerusalén, IsraelASC- 001/ 009 /008 /017
Alexa Anticuerpos secundarios contra fluorInvitrogen
Suero
Fluoro-Gel Cienciasde la Microscopía Electrónica 17985
normal de cabra

Referencias

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