Identificación de poblaciones específicas de neuronas sensoriales para el estudio de los canales iónicos expresados

Resumen

Las neuronas sensoriales aferentes envían información sensorial desde la periferia al sistema nervioso central. La identificación de neuronas aferentes específicas ayudará a comprender su fisiología. Describimos un método de marcaje retrógrado para identificar neuronas aferentes y estudiamos los canales iónicos dependientes de voltaje en estas neuronas utilizando electrofisiología e inmunocitoquímica de patch clamp.

Resumen

Las neuronas sensoriales transmiten señales desde varias partes del cuerpo al sistema nervioso central. El soma de estas neuronas se encuentra en los ganglios de la raíz dorsal que recubren la columna vertebral. La comprensión de los receptores y canales expresados por estas neuronas aferentes sensoriales podría conducir a nuevas terapias para la enfermedad. El paso inicial es identificar el subconjunto específico de neuronas sensoriales de interés. En este trabajo describimos un método para identificar las neuronas aferentes que inervan los músculos mediante marcaje retrógrado utilizando un colorante fluorescente DiI (perclorato de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina). Comprender la contribución de los canales iónicos a la excitación de las aferencias musculares podría ayudar a controlar mejor la excitabilidad excesiva inducida por ciertos estados patológicos, como la enfermedad vascular periférica o la insuficiencia cardíaca. Utilizamos dos enfoques para identificar los canales iónicos dependientes del voltaje expresados por estas neuronas, electrofisiología de pinza de parche e inmunocitoquímica. Si bien la electrofisiología más los bloqueadores farmacológicos pueden identificar tipos de canales iónicos funcionales, utilizamos la inmunocitoquímica para identificar canales para los que no había bloqueadores específicos disponibles y para comprender mejor el patrón de distribución de canales iónicos en la población celular. Estas técnicas se pueden aplicar a otras áreas del sistema nervioso para estudiar grupos neuronales específicos.

Introducción

Los ganglios de la raíz dorsal (DRG) están compuestos por somas de neuronas aferentes que inervan varias partes del cuerpo, y se pueden obtener conocimientos importantes del estudio de las neuronas sensoriales con diferentes objetivos de inervación¹. Se utilizan varios métodos indirectos o invasivos para aislar e identificar las neuronas aferentes para, por ejemplo, inyectar el nervio con marcadores como fluorogold¹, inyectar tinte en los músculos mediante el método quirúrgico². De los diferentes colorantes que se han utilizado con éxito para etiquetar neuronas y tractos neuronales, los tintes fluorescentes como DiI son amplia....

Protocolo

Nota: Todo el trabajo con animales debe realizarse de acuerdo con las pautas institucionales y de cuidado de animales.

1. Preparación del animal y etiquetado

1. Anestesiar ratas: Anestesiar a una rata (típicamente 150-400 g) usando una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (50 mg/kg de peso corporal), xilacina (5 mg/kg) y acepromazina (1 mg/kg). Verifique los reflejos pellizcando el pie, espere hasta que no haya respuesta. Dado que la respuesta a la anestesia varía de un animal a otro, es mejor determinar el efecto de los anestésicos mediante la prueba de los reflejos del dolor.
2. Solución de DiI: Pesar el pol....

Resultados

Utilizando el método descrito aquí, identificamos neuronas aferentes musculares en DRG y pasamos a determinar los canales de sodio dependientes de voltaje (NaV) expresados por estas neuronas. Las neuronas aferentes musculares marcadas con DiI (Figura 1C) comprendían una pequeña fracción de la población total de neuronas en el DRG, con un promedio del 16% de las neuronas (167/1047) marcadas. La cuantificación se realizó midiendo primero la fluorescencia con ImageJ y trazando histogramas de los datos de in.......

Discusión

Los aferentes musculares que se originan en los músculos tríceps surales (por ejemplo, gastrocnemio) se han utilizado en múltiples estudios para investigar el reflejo presor del ejercicio (EPR)¹³. Dado el interés en estudiar las neuronas sensoriales que median el EPR, se seleccionaron los músculos gastrocnemios para la inyección de tinte. Se eligió DiI debido a su naturaleza lipofílica y porque no se pierde de la neurona por difusión a través de la membrana plasmática intacta^3,14. Usando es.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NaV 1.8	Abcam	Ab93616
NaV 1.1 / 1.6/ 1.7 y 1.9	Alamone Labs, Jerusalén, Israel	ASC- 001/ 009 /008 /017
Alexa Anticuerpos secundarios contra fluor	Invitrogen
Suero
Fluoro-Gel Ciencias	de la Microscopía Electrónica 17985