Registro electrofisiológico simultáneo e imágenes de calcio de neuronas del núcleo supraquiasmático

Resumen

Se describen procedimientos para realizar registros simultáneos del potencial o corriente de membrana y los cambios en la concentración de calcio intracelular. Las neuronas del núcleo supraquiasmático se llenan con el indicador de calcio bis-fura-2 mediante un electrodo de pinza de parche en la configuración de pinza de parche de toda la célula.

Resumen

Se utilizaron métodos simultáneos de registro de imágenes electrofisiológicas y fluorescentes para estudiar el papel de los cambios de potencial o corriente de membrana en la regulación de la concentración de calcio intracelular. Las condiciones ambientales cambiantes, como el ciclo de luz-oscuridad, pueden modificar la actividad neuronal y de la red neuronal y la expresión de una familia de genes del reloj circadiano dentro del núcleo supraquiasmático (SCN), la ubicación del reloj circadiano maestro en el cerebro de los mamíferos. La transmisión sináptica excitatoria conduce a un aumento en la concentración postsináptica de Ca²⁺ que se cree que activa las vías de señalización que cambian la expresión rítmica de los genes del reloj circadiano. Los cortes hipotalámicos que contenían el SCN se sujetaron con microelectrodos rellenos con una solución interna que contenía el indicador de calcio bis-fura-2. Después de que se formó un sello entre el microelectrodo y la membrana neuronal SCN, la membrana se rompió mediante una succión suave y la sonda de calcio se difundió en la neurona llenando tanto el soma como las dendritas. Las mediciones cuantitativas radiométricas de la concentración de calcio intracelular se registraron simultáneamente con el potencial de membrana o la corriente. Utilizando estos métodos, es posible estudiar el papel de los cambios en la concentración de calcio intracelular producidos por la actividad sináptica y la activación del potencial de acción de las neuronas individuales. En esta presentación demostramos los métodos para registrar simultáneamente la actividad electrofisiológica junto con el calcio intracelular de las neuronas SCN individuales mantenidas en cortes de cerebro.

Introducción

Se sabe que los cambios en la expresión génica ocurren en las neuronas como consecuencia de la señalización sináptica. La señalización por el neurotransmisor excitador glutamato puede despolarizar el potencial de la membrana neuronal, lo que finalmente conduce a la transcripción y traducción de genes^1,2. La activación de los receptores ionotrópicos por el glutamato permite que los iones de calcio extracelulares entren en la célula, que se cree que desempeña un papel fundamental como segundo mensajero en la activación de la transcripción de genes. La evaluación de la relación entre la actividad eléctrica de la membrana, como la frecuencia de disparo del potencial de acción, y los cambios en la concentración de calcio intracelular requiere la combinación de dos métodos: el pinzamiento de parches de células completas y la obtención de imágenes cuantitativas de sondas de calcio fluorescentes^3-5, lo que permite estudiar la relación en neuronas individuales. La técnica de registro de una sola célula permite registrar la actividad de las neuronas individuales en partes identificables del cerebro. La técnica de registro de toda la celda permite controlar el voltaje o la corriente de la membrana, lo que permite la manipulación experimental de corrientes específicas de canales iónicos. El uso de micropipetas llenas de sondas de calcio fluorescentes también asegura que la neurona esté bien llena de sonda de calcio. Esta técnica tiene una clara ventaja cuando se trabaja con preparaciones de cortes de cerebro a partir de preparaciones de cortes adultos, ya que estas neuronas son particularmente difíciles de cargar utilizando las sondas de permeabilidad celular más comunes y reduce los posibles problemas de fluorescencia de fondo^6-8.

La luz es la principal forma en que los mamíferos ajustan su reloj circadiano, que se encuentra en el núcleo supraquiasmático hipotalámico (SCN). La información lumínica transducida en la retina ^{se transmite 9-11} a través del tracto retinohipotalámico (RHT) donde se libera glutamato en el NSQ^12,13. El glutamato abre los receptores ionotrópicos NMDA y AMPA ubicados en las neuronas SCN produciendo una afluencia de calcio y sodio, e iniciando una cascada de señalización intracelular que finalmente conduce a la alteración de la expresión de una familia de genes reloj^14-17 y cambia de fase del reloj circadiano^18-20. Sin embargo, el calcio puede entrar en las neuronas directamente a través de los receptores ionotrópicos de glutamato o a través de la despolarización de la membrana y la activación de los canales de calcio dependientes de voltaje (VDCC)²¹. Por lo tanto, desarrollamos un protocolo experimental para investigar la relación entre la concentración de calcio intracelular y la actividad eléctrica de membrana en las neuronas SCN, tal como ocurre con el disparo de potencial de acción y a partir de la entrada sináptica²².

Protocolo

1. Preparación de cortes de cerebro hipotalámico

1. Obtener, por adelantado, la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) para cualquier procedimiento que involucre animales. Los procedimientos con animales descritos aquí son consistentes con las Directrices de AVMA para la Eutanasia de Animales 2013 y fueron aprobados previamente por la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón IACUC.
2. Preparar 500 ml del tampón de corte sin el MgCl₂ y el CaCl₂ (Tabla 1). Burbujee la solución con 95% de_O2 y 5% de CO₂ a temperatura ambiente, luego agregue el MgCl₂ y el CaCl₂ mientras continúa aireando. Ajustar la osmolaridad a 300 mOsm con sacarosa. La osmolaridad se mide con un osmómetro de presión de vapor.
3. Prepare 1 L del soporte de grabación sin el MgCl₂ y el CaCl₂ (Tabla 2). Burbujee la solución con 95% de_O2 y 5% de CO₂, luego agregue el MgCl₂ y el CaCl₂ mientras continúa aireando. Ajustar el pH a 7,2-7,4 con NaOH (10 N) y la osmolaridad a 300 mOsm con sacarosa. La adición de tampón HEPES es opcional y se utilizó para estabilizar aún más el pH.
4. Las soluciones de corte y registro pueden almacenarse en el refrigerador durante varios días antes de su uso.
5. Preparar agarosa al 3% y verter en una placa de Petri estéril (6 mm de profundidad) y refrigerar.
6. Corta tres cubos de agarosa de unos 6 mm x 6 mm x 6 mm.
7. Anestesia profundamente a una rata Sprague-Dawley de cuatro a ocho semanas de edad con isoflurano. Pruebe la profundidad de la anestesia. La profundidad de la anestesia se considera apropiada cuando no hay reflejo de retirada de la extremidad posterior después de pellizcar la almohadilla del pie. Una vez anestesiada adecuadamente, la rata es sacrificada mediante una decapitación rápida.
8. Retire rápidamente el cerebro teniendo cuidado de cortar primero los nervios ópticos y colóquelo en una solución de corte helada saturada con 5% de CO₂ y 95% de O₂ y deje enfriar durante 2-3 minutos.
9. Recorta el cerebro. Coloque el cerebro con pinzas en un papel de filtro circular humedecido (con solución para cortar) colocado sobre una placa de Petri de vidrio que descansa sobre hielo.
10. Cortar el cerebro coronalmente para eliminar el cerebelo y el tronco encefálico restantes, luego la corteza rostral y los lados, para dejar un bloque de cerebro que contenga el hipotálamo preservando cuidadosamente el lado que contiene el SCN, los nervios ópticos y el quiasma óptico.
11. Extienda una capa delgada de pegamento cianoacrílico lo suficientemente grande como para unir los bloques de cerebro y agarosa en una cámara de corte de micrótomo helada pero seca.
12. Transfiera el bloque de cerebro helado con el lado caudal hacia abajo sobre el pegamento con el lado que contiene el SCN posicionado para cortar primero con los nervios ópticos formando una "V" apuntando hacia arriba.
13. Coloque los bloques de agarosa en los otros 3 lados. Llene la cámara con tampón de corte helado burbujeado continuamente con 5% de CO₂ y 95% de O₂. El pegamento cianoacrílico se solidificará con la humedad, manteniendo el cerebro y los bloques de agarosa en su lugar.
14. Corte cortes hipotalámicos coronales (220-250 μm de grosor) que contengan el SCN con el micrótomo de la cuchilla vibratoria. Por lo general, se elige un corte donde el quiasma óptico mide aproximadamente 2-4 mm de ancho, apareciendo como una banda blanca con SCN solo dorsal que aparece como dos pequeñas "hendiduras" en el quiasma óptico a cada lado del tercer ventrículo (Figura 1A).
15. Coloque los cortes en la cámara de registro (36 °C) montada en la platina de un microscopio Leica DMLFS. La cámara se llena con una solución de registro de flujo continuo (2 ml/min) aireada con un 95% de_O2 y un 5% de CO₂ y precalentada con un calentador en línea.
16. Realice registros de imágenes de calcio y pinza de parche de células enteras en neuronas SCN de 0,5 a 8 horas después de la preparación del corte.

2. Grabación de la abrazadera de parche

1. Prepare la solución de electrodos (intracelular) en la mitad del volumen final total de agua.
2. Ajuste la solución a pH 7.3 con KOH (1 N).
3. Agrega el agua restante. La osmolaridad final de la solución debe estar en el rango de 280-290 mOsm.
4. Pase la solución de electrodo a través de un filtro de 0,2 μm, alícuota (0,5 ml) a tubos de microfuga y almacene a -20 °C.
5. Prepare la solución caluaria de sal de hexapotasio bis-fura-2 (10 mM) mezclando 1 mg de sal de hexapotasio bis-fura-2 con 99,29 μl de agua filtrada de 0,2 μm.
6. Alícuota en tubos separados (2-5 μl cada uno) y congelar (-20 °C).
7. Descongele una alícuota de solución interna y la sonda de Ca²⁺ poco antes de usar. Añadir 2 μl de la solución madre de bis-fura-2 a 400 μl de la solución interna para obtener una concentración final de 50 μM de sonda de calcio. Triturar brevemente para mezclar las soluciones. La concentración de la sonda de calcio (10-250 μM) varía según el diseño experimental y el sistema de imagen. Tenga en cuenta que bis-fura-2 se compone de dos moléculas de fura-2 vinculadas.
8. Tire de los electrodos de parche de celda completa, en dos etapas, hasta un diámetro de punta exterior de aproximadamente 1 μm y resistencias de 7-10 MΩ cuando se llenan con la solución intracelular.
9. Rellene el electrodo con unos pocos μl de la solución interna que contiene la sonda de calcio filtrada con un filtro de jeringa de 4 mm (0,2 μm) para muestras de bajo volumen a través de un tubo Microfil.
10. Aplique una pequeña cantidad de presión positiva al electrodo a medida que se guía hacia la cámara de grabación bajo la iluminación de luz roja mientras se visualiza en un monitor de video.
11. Coloque el microelectrodo sobre el SCN utilizando un objetivo de baja potencia (4X). El NSQ se identifica como las dos áreas translúcidas a ambos lados del tercer ventrículo y dorsales al quiasma óptico (Figura 1A).
12. Cambie el microscopio a un aumento de alta potencia (40X o 63X). Las subregiones del SCN y las neuronas SCN individuales se pueden seleccionar para el registro con el mayor aumento.
13. Aplique una suave presión positiva al microelectrodo a medida que avanza sobre la superficie de una neurona.
14. Aplique una suave presión negativa al microelectrodo para formar un sello con resistencias de 3-10 GΩ.
15. Ajuste el voltaje de membrana a -60 mV con el amplificador controlado con software de adquisición.
16. Aplique presión negativa adicional al electrodo para romper la membrana de la celda al modo de celda completa.
17. Al entrar en el modo de célula completa, el soma y las dendritas de la neurona SCN se llenan de sonda fluorescente.
18. El voltaje de la membrana se mide en modo de pinza de corriente o corriente en modo de pinza de voltaje mientras se monitorean y almacenan los datos de la imagen de la sonda de calcio (descritos a continuación). Vea las imágenes adquiridas junto con un gráfico de datos de fluorescencia de relación de 340 nm/380 nm durante el experimento.

3. Medición de Ca²⁺ intracelular

1. Las mediciones cuantitativas de Ca²⁺ se obtienen registrando un par de imágenes excitando rápidamente el tejido con luz ultravioleta a 340 nm y 380 nm a través de un monocronómetro con un ancho de banda de 10 nm y pasado a través de un filtro óptico UG11 para restringir longitudes de onda armónicas por encima de 400 nm, un DCLP dicroico de 400 nm y la luz emitida a través de un filtro de emisión de 510±40 nm.
2. Las imágenes se adquieren utilizando una cámara CCD refrigerada con tiempo de adquisición y agrupación ajustados para minimizar el fotoblanqueo y maximizar la velocidad de grabación.
3. El software de imágenes cuantitativas se utiliza para adquirir y mostrar las imágenes.
4. Seleccione las regiones de interés de la imagen inicial para convertirlas en datos de unidades de intensidad de fluorescencia relativa (es decir, soma, dendrita, etc.). Seleccione también una región para la medición de la fluorescencia de fondo (Figura 1B).
5. Las imágenes en bruto y los datos ópticos cuantificados se guardan continuamente durante el experimento. Después del experimento, las imágenes guardadas generalmente se vuelven a analizar cuando se puede tomar más tiempo para seleccionar con mayor precisión las regiones de interés que se van a cuantificar.
6. Los datos se pueden presentar como la concentración estimada de calcio intracelular (Est[Ca²⁺]i). Para calcular^{la concentración de} calcio se utiliza la relación (R) de la luz emitida tras la excitación y la sustracción de fondo a 340 nm dividida por 380 nm junto con la fluorescencia máxima y mínima a 340 nm y 380 nm. La sustracción de fondo y otros cálculos se realizan mediante software de análisis de datos.
7. Se puede realizar una determinación in vitro de la fluorescencia máxima y mínima de bis-fura-2 utilizando 10 mM de CaCl₂ para condiciones unidas a Ca²⁺ y 10 mM de EGTA para condiciones libres de Ca²⁺. La constante de disociación de Ca²⁺, Kd de la sonda, se considera de 370 nM para bis-fura-2 (Invitrogen).

Resultados

Utilizando cortes de cerebro hipotalámicos, registramos simultáneamente los cambios en el calcio intracelular en modo de célula completa en condiciones de pinza de voltaje y corriente. El microelectrodo que se muestra en la Figura 1A se baja a su posición bajo un gran aumento (objetivos UV de 40X o 63X) con una pequeña cantidad de presión positiva aplicada. Después de tocar la neurona, se forma un sello de gigaohmios con una succión suave. En el modo de pinza de voltaje, después de establecer el potencia...

Discusión

Los métodos descritos anteriormente proporcionan una herramienta poderosa para registrar simultáneamente el vínculo entre la actividad eléctrica de la membrana neuronal y la concentración de calcio intracelular. El método tiene una serie de fortalezas en el sentido de que combina dos métodos muy bien caracterizados: registro de pinza de parche de células completas y medición de calcio intracelular utilizando tintes fluorescentes. Nuestro enfoque es similar a los descritos por otros investigadores^_6,23

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NaCl	Fisher Scientific Co.	S271-3
KCl	Fisher Scientific Co.	P217-500
NaH2PO4• H2O	Sigma Chemical Co.	S-9638
MgCl2• 6H2O	Fisher Scientific Co.	M33-500
CaCl2• 2H2O	Fisher Scientific Co.	C79-500
D-glucosa	Fisher Scientific Co.	D16-500
NaHCO3	Fisher Scientific Co.	S233-500
Sacarosa	Fisher Scientific Co.	S5-500
D-gluconato de potasio	Sigma-Aldrich	G4500
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Adenosina 5′-trifosfato sal dipotásica dihidratada	Sigma-Aldrich	A8937
Guanosina 5′-trifosfato sal tris	Sigma-Aldrich	G9002
Agarosa (ultrapura)	Vida Tecnologías	15510-027	Gel poroso en placa de Petri estéril Capa de 6 mm de espesor
KOH	Sigma-Aldrich	P-6310
NaOH	Sigma-Aldrich	S-5881
Bis-fura-2, sal de hexapotasio	Invitrogen	B6810	Célula impermeada
Nombre del equipo		Empresa Número de catálogo	Comentarios
Microtomo	Leica	VT1000S	Cortar tejidos
Pegamento cianoacrílico (Roti-Coll1)	Carl Roth GmbH+Co	Art-Nr. 0258.1
Extractor de microelectrodos	Narshige International USA	PP-83
Tubos capilares de microelectrodos	World Precision Instruments	1B150F-4
Microfil 34 g	World Precision Instruments	MF34G-5
Filtro de jeringa	Corning	#431212
Microscopio	Leica	DM LFS	Con objetivos 4X, 40X UV y 63X UV, y epifluorescencia
Cámara CCD	Hamamatsu	ORCA ER	12 bits CCD
Fura-2 Filter Cube	Chroma	71500A	Set con filtro UG11
Polychrome IV	Till Photonics GmBH		Monocronómetro
Gafas de seguridad con bloqueo ultravioleta	Productos ultravioleta
Amplificador EPC-9	HEKA Eletronik
Metafluor	Molecular Devices		Software de imagen
Patchmaster	HEKA Eletronik		Software de adquisición de datos
Igor versión 6	Wavemetrics		Electrofisiología & Ca2+ Análisis de datos VAPRO
5520	Westcor		Osmómetro de presión de vapor