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Biopelículas microbianas electroactivas derivadas de aguas residuales: crecimiento, mantenimiento y caracterización básica

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DOI:

10.3791/50800

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29 de diciembre de 2013

 , 
1Department of Environmental Microbiology, UFZ - Helmholtz-Centre for Environmental Research

En este artículo

Resumen

Se demuestra el crecimiento cronoamperométrico de biopelículas microbianas electroactivas anódicas en un reactor de lotes alimentados utilizando una configuración de tres electrodos, controlada por un potenciostato. La transferencia de electrones extracelular se caracteriza mediante voltamperometría cíclica en presencia del donante de electrones y en ausencia del donante de electrones. Se demuestra el análisis fundamental de datos.

Resumen

El crecimiento de biopelículas microbianas electroactivas anódicas a partir de inóculos de aguas residuales en un reactor de lotes alimentados se demuestra utilizando una configuración de tres electrodos controlada por un potenciostato. Por lo tanto, el uso de potenciostatos permite un ajuste exacto del potencial del electrodo y garantiza condiciones de cultivo microbiano reproducibles. Durante el crecimiento, la producción de corriente se monitorea mediante cronoamperometría (CA). Sobre la base de estos datos, se discuten la densidad de corriente máxima (jmáx.) y la eficiencia coulombica (CE) como medidas para la caracterización del rendimiento bioelectrocatalítico. La voltamperometría cíclica (CV), una voltamperometría no destructiva, es decir, El método no invasivo se utiliza para estudiar la transferencia extracelular de electrones (EET) de bacterias electroactivas. Las mediciones de CV se realizan en electrodos de biopelícula anódicos en presencia del sustrato microbiano, es decir, condiciones de rotación, y en ausencia del sustrato, es decir, condiciones de no rotación, utilizando diferentes velocidades de escaneo. Posteriormente, se ejemplifica el análisis de datos y se derivan y explican los parámetros termodinámicos fundamentales de la EET microbiana: potencial pico (Ep), densidad de corriente máxima (jp), potencial formal (Ef) y separación de picos (ΔEp). Además, se abordan los límites del método y el estado del arte del análisis de datos. Por lo tanto, este video-artículo proporcionará una guía para los pasos experimentales básicos y el análisis de datos fundamentales.

Introducción

La elucidación de los fundamentos de la transferencia microbiana de electrones extracelulares (EET) y su explotación en sistemas de ingeniería es un campo vital y en rápido crecimiento de investigación y desarrollo1-3. El estudio de estos microorganismos electroactivos (o bioelectrocatalíticos o electroquímicamente activos), incluidas las cepas puras, así como los cocultivos definidos y los consorcios complejos, requiere un complejo arsenal de técnicas, métodos y protocolos4. Estos métodos se derivan de diversas disciplinas científicas, por ejemplo, la electroquímica, la ciencia de los materiales, la microbiología, y proporcionan información sobre diferentes niveles jerárquicos, p. ej. desde toda la biopelícula microbiana hasta moléculas individuales. Por lo tanto, la electroquímica y los métodos electroquímicos representan el fundamento de todas las actividades.

Tradicionalmente, las configuraciones de tipo pila de combustible se utilizaban a menudo para el crecimiento y mantenimiento de cultivos microbianos electroactivos en el arquetipo de estos sistemas de ingeniería: pilas de combustible microbianas (MFC)5. Desafortunadamente, estos tipos de MFC a menudo no permitían monitorear o incluso controlar el potencial de un solo electrodo y, por lo tanto, solo era posible obtener información limitada sobre los procesos de los electrodos: solo se informaba el voltaje de la celda. En la actualidad, cada vez se reconoce más que la supervisión y el control individuales de los potenciales de los electrodos individuales en los MFC representan una clara ventaja, no sólo para la investigación fundamental, sino también para la ingeniería. Además, con la diversificación de las aplicaciones de las tecnologías electroquímicas microbianas que ahora incluyen, por ejemplo, la remediación, la desalinización, las síntesis e incluso la bioinformática, en los llamados sistemas bioelectroquímicos microbianos (BES)2,6,7, a menudo es sustancial un control externo de los potenciales de electrodos individuales. Este control generalmente se logra mediante el uso de fuentes de energía externas o potenciostáticos. Por lo tanto, el uso de potenciostatos permite, a diferencia de otros tipos de configuraciones, un ajuste exacto del potencial de electrodo individual. Esto es de gran importancia ya que el electrodo representa el aceptor de electrones microbiano terminal (para ánodos) o donante de electrones (para cátodos) de la transferencia de electrones extracelular. La Figura 1 muestra el estado actual del conocimiento sobre el EET microbiano en los ánodos - ver para más detalles, por ejemplo2,4,6,8,9 El EET en el cátodo todavía está principalmente sin explotar10.

Por lo tanto, el control del potencial del electrodo permite no solo el uso de condiciones de cultivo microbiano reproducibles, sino también su adaptación en términos de termodinámica EET11. En este artículo se demuestra cómo se pueden extraer los parámetros característicos de las biopelículas microbianas electroactivas a partir de experimentos con reactores alimentados por lotes utilizando cronoamperometría (CA) y voltamperometría cíclica (CV). Esto incluye los parámetros de rendimiento, la densidad de corriente máxima (jmáx.) y la eficiencia coulombica (CE), así como las características de EET. Aquí se centrará en la identificación de los potenciales formales (E, f) de los sitios de transferencia de electrones posibles y reales. La extracción de estos parámetros se muestra en el ejemplo de biopelículas de cultivo mixto derivadas de aguas residuales que están dominadas por la especificación Geobacter. 12 Estas biopelículas derivadas de aguas residuales se obtienen mediante un simple procedimiento de selección electroquímica, como lo demuestran numerosos grupos de investigación en todo el mundo13-16.

Técnicas electroquímicas dinámicas para estudiar la transferencia microbiana de electrones extracelulares

Para una caracterización termodinámica de la EET de cultivos microbianos electroactivos se necesitan técnicas electroquímicas dinámicas. En general, estas técnicas incluyen el control de potencial, es decir, voltamperométrico, y el control de corriente, es decir, el control de corriente. Galvanodinámica, Técnicas17. Por lo tanto, las técnicas de potencial controlado son más prevalentes e incluyen, por ejemplo, la voltamperometría de onda cuadrada y la voltamperometría de barrido lineal18. Sin embargo, la más popular es la voltamperometría cíclica (CV)19,20. El CV es bien conocido y está muy extendido en diferentes campos de la electroquímica, desde la investigación de baterías, pasando por la ciencia de los materiales, hasta la bioelectroquímica enzimática21. Su aplicación a las células microbianas vivas solo se remonta a más de una década22 y aumenta significativamente durante los últimos años23,24. Especialmente, la combinación de CV y métodos espectroscópicos ha proporcionado conocimientos sin precedentes sobre los mecanismos de EET y su naturaleza molecular, por ejemplo.25,26 Paralelamente, se amplió y profundizó el marco teórico para la extracción de las características termodinámicas y teóricas de la EET microbiana27-30. Por el contrario, sin embargo, el mal manejo experimental o el análisis inadecuado de los datos a menudo dificultan la aplicación adecuada de la CV en el campo de la bioelectroquímica microbiana. Por lo tanto, además de los talleres (por ejemplo, en el EU-ISMET 2012) y los tutoriales19, este videoartículo proporcionará una guía básica para la realización de experimentos voltamperométricos cíclicos en bacterias electroactivas. Por lo tanto, se centra en los pasos experimentales básicos y el análisis de datos fundamentales y no pretende proporcionar los últimos protocolos de análisis cinético. Los terminales más importantes para la siguiente discusión se resumen en el Recuadro 1 (adaptado de Harnisch y Freguía19 y modificado).

Protocolo

Dado que el procedimiento de selección en el reactor bioelectroquímico alimentado por lotes es muy específico debido a la elección del sustrato y las condiciones anóxicas, no es necesario trabajar en condiciones estériles para el ejemplo demostrado.

1. Preparación del medio de crecimiento

  1. Prepare una cantidad adecuada del medio de crecimiento utilizando un tampón de fosfato, según Kim et al.13 (véase el cuadro 1). Aquí, el acetato de sodio (10 mM) sirve como sustrato. El medio de crecimiento utilizado en este artículo es solo un ejemplo, y dependiendo del propósito experimental puede variar en sus componentes.
  2. Añadir 1 ml de aguas residuales primarias por cada 20 ml de medio de crecimiento como inóculo. La muestra de aguas residuales se toma de una planta municipal de tratamiento de aguas residuales después de la filtración mecánica (véase, por ejemplo, la Figura 2) y puede almacenarse hasta tres meses hasta su uso en un recipiente cerrado a 4 °C.
    (Nota: Dependiendo del objetivo del experimento, el recuento inicial exacto de células puede ser importante y luego debe determinarse. En el ejemplo demostrado, el recuento inicial de células no es importante, ya que la biopelícula alcanza condiciones de estado estacionario).
  3. Enjuague el medio, incluido el inóculo, con nitrógeno durante al menos 30 minutos para desairearlo, insertando una aguja en el medio y gire el chorro de nitrógeno. El chorro debe ser lo suficientemente fuerte como para que pueda observar una mezcla completa del medio.
    (Nota: Dependiendo del volumen del medio, se debería considerar incluso extender el tiempo de desaireación. Durante la configuración de la desaireación, el reactor alimentado por lotes (pasos 2.1-2.2))

2. Configuración del reactor Fed-batch

  1. Tome un recipiente de reactor adecuado: aquí se utiliza un matraz modificado de 250 ml de fondo redondo de 4 cuellos.
    (Nota: En general, el buque debe tener al menos cuatro entradas. Estos son necesarios para los tres electrodos y para el muestreo/intercambio de medios. Los volúmenes de gas producido pueden descuidarse cuando el reactor se abre regularmente debido al muestreo o al cambio de medio, alternativamente se debe instalar un contador de burbujas. Con el fin de evitar el crecimiento fototrópico no deseado, los reactores deben estar protegidos de la exposición directa a la luz).
  2. Para la configuración de tres electrodos (consulte la Figura 3 y la sección 3 para obtener más detalles), coloque el electrodo de referencia (RE) (aquí Ag/AgCl, sat. KCl, 0,197 V vs. SHE), el electrodo de trabajo (WE) y el contraelectrodo (CE) en el matraz a través de entradas individuales a través de tapones de silicona: sello hermético.
    (Nota: Como se utilizan varillas de grafito WE y CE. El cable de los electrodos se tira a través del tapón de silicona y se fija externamente. El electrodo de referencia se introduce a través del tapón de silicona a través de un orificio perforado. Para evitar cortocircuitos, asegúrese de que no haya contacto físico de los electrodos, incluso durante la agitación o la recirculación de medios. Coloque los electrodos que estén completamente cubiertos con solución media. Para sellar, envuelva el tapón de silicona de cada entrada con Parafilm).
  3. Vierta el medio de crecimiento, incluido el inóculo (aquí 250 ml) a través del puerto de muestreo en el reactor mientras se enjuaga con nitrógeno.
  4. Cierre la última entrada con un tapón de silicona y séllela herméticamente. Nota: Las trazas de oxígeno no dañarán las biopelículas de especies mixtas. Son capaces de soportar e incluso consumir bajos niveles de oxígeno, lo que a su vez puede disminuir la CE.

3. Crecimiento de biofilm cronoamperométrico

  1. Conecte los electrodos a los cables respectivos del potenciostato. Coloque el recipiente en una cámara de temperatura controlada, aquí se utiliza35 °C 31, para garantizar condiciones ambientales constantes.
  2. Abra el software para controlar el potenciostato y elija la técnica: Cronoamperometría. Establezca los parámetros, por ejemplo, de la siguiente manera: Un potencial constante EWE de 0,2 V (frente a Ag/AgCl) durante una duración t de 500 horas (≈ 20 días). La corriente se registra en pasos de tiempo dti cada minuto.
    Nota: La elección del potencial aplicado depende del sistema/microorganismo estudiado. Generalmente, los procesos anódicos se estudian a potencial positivo y los procesos catódicos a potenciales negativos. También se puede deducir un potencial adecuado a partir de los potenciales estándar del donante/aceptor de electrones y el potencial formal del sitio de transferencia de electrones microbiano esperado, aquí como punto de partida, consulte la literatura reciente.
  3. Inicie la cronoamperometría. El software traza un gráfico de la corriente medida a lo largo del tiempo, la corriente máxima observada (imax) es un parámetro en línea importante, como se discute en las secciones 4 y 5.

4. Mantenimiento de la biopelícula

  1. Dependiendo de las condiciones ambientales, por ejemplo, la temperatura, una corriente oxidativa comienza a fluir y alcanza una meseta (ver Figura 4). Después de volver a alcanzar la corriente cero, detenga la medición cronoamperométrica y reponga la solución del medio. Para un crecimiento más rápido de la biopelícula, reemplace el medio justo después de alcanzar la meseta de la corriente máxima. Abra el puerto de muestreo y descargue el medio con cuidado, sin destruir la delgada biopelícula. Mientras rellena el medio, enjuague nuevamente con nitrógeno. Cierre el puerto de muestreo y selle herméticamente.
  2. Repita el procedimiento del paso 4.1. hasta que la corriente oxidativa máxima alcance un estado estacionario (ver Figura 4).
    (Nota: Se cree que una constante imax indica una formación de biopelícula estable en estado estacionario).
  3. Tome muestras de 1 ml de las soluciones frescas y de los medios intercambiados para el análisis del sustrato, por ejemplo, por HPLC. La concentración inicial de sustrato (acetato) (c0), así como la concentración de la solución de sustrato restante (c1), son necesarias posteriormente para los cálculos de eficiencia (véase la sección Análisis de datos).
    Nota: Para obtener resultados inalterados, por ejemplo, debido a un mayor consumo de sustrato, analice las muestras de sustrato inmediatamente. Si esto no es posible, almacene las muestras en un congelador a una temperatura mínima de -18 °C durante no más de un mes.)

5. Aplicación de la voltamperometría cíclica para estudiar la EET

  1. Realice voltamperometría cíclica en los máximos y mínimos del flujo de corriente como se indica (Figura 4). Dependiendo de la pregunta de interés, el CV generalmente se realiza cuando el sistema ha alcanzado el estado estacionario para obtener resultados comparables. (Nota: La generación de corriente se denomina condiciones de rotación y se relaciona con la oxidación microbiana del sustrato y la posterior transferencia de electrones: bioelectrocatálisis microbiana; mientras que los CV sin rotación se realizan con un flujo de corriente (casi) cero en la CA).
  2. Elija en el software de control de potenciostato la técnica: voltamperometría cíclica, y establezca los parámetros apropiados, aquí por ejemplo: Un potencial inicial del EWE a Ei de -0,5 V vs. RE con una velocidad de escaneo v = dE/dt de 1 mV/seg a un potencial de vértice E1 de 0,3 V vs. RE y de vuelta al potencial inicial E2 = Ei de -0,5 V.
    Nota: Cuando se utiliza voltamperometría cíclica, el voltaje aplicado en el WE cambia linealmente con el tiempo por el potenciostato (ver Figura 5) - El recuadro 2 proporciona las reglas principales para elegir los parámetros del experimento y solucionar problemas).
  3. Inicie la voltamperometría cíclica y registre tantos ciclos como sea necesario para realizar un CV reproducible. Por lo general, se necesitan al menos 3 ciclos. El gráfico resultante se denomina voltamperograma cíclico (véase también la Figura 7). Nota: Dependiendo de las condiciones de medición, se puede obtener información diferente, como se muestra en la siguiente sección.

6. Trazado de datos

Aquí solo se discute el trazado de los datos. Un tratado más detallado sigue en la siguiente sección.

  1. Utilice un software de análisis de datos adecuado, aquí todos los datos se exportan como texto y se importan como archivo ASCII.
  2. Calcule y utilice preferentemente densidades de corriente (j) y no corrientes absolutas (i).
    (Nota: Sin embargo, como existen diferentes protocolos para calcular j, aclare cuál se utilizó. Aquí la densidad actual por geométrica, es decir, proyectado, se utiliza el área de superficie del electrodo).
  3. Cronoamperometría: Trace la densidad de corriente medida en función del tiempo.
  4. Voltamperometría cíclica: Grafique la densidad de corriente medida en función del potencial del WE Ewe.

Resultados

1. Cronoamperometría

A partir de mediciones cronopotenciométricas se pueden calcular dos características operativas: la densidad de corriente máxima (jmáx), es decir., el flujo máximo de electrones por segundo, y la eficiencia coulómbica (EC), es decir., el flujo total de corriente en relación con el sustrato consumido. Figura 4 muestra una curva típica de crecimiento de biopelícula cronopotenciométrica de varios ciclos de crecimiento utilizando un reactor por lotes alimentado. Después de la fase de latencia inicial, comienza un primer máximo de densidad de corriente. Luego, la corriente disminuye nuevamente debido al agotamiento del sustrato. Cuando el flujo de corriente es (casi) cero, se realiza un intercambio del medio, tal como se indica. Tras este reabastecimiento de sustrato, la densidad de corriente aumenta nuevamente y el siguiente máximo de densidad de corriente es mayor que el primero. Después de varios ciclos de crecimiento, jmáx se mantiene constante, lo que indica la formación de una biopelícula en estado estacionario14. Dado que el valor de jmáx en estado estacionario depende de varios parámetros, por ejemplo., material del electrodo, temperatura del reactor y composición de la biopelícula, a menudo se considera una característica de un sistema determinado de biopelícula microbiana electroactiva/electrodo. (En el caso de reactores de flujo continuo, no se utiliza jmáx, sino la densidad de corriente constante en estado estacionario). La segunda característica operativa es la eficiencia coulómbica (EC) (Ecuación 1). Esta corresponde al número de electrones registrados como flujo de corriente eléctrica, Qp, por ciclo por lotes alimentado, en relación con el número teórico máximo de electrones Qth, que se calcula a partir del consumo de sustrato durante dicho ciclo.

Fórmula de equilibrio estático CE=QP/Qth×100; cálculo de eficiencia en diagrama de proceso.

(Ecuación 1)

La carga total transferida se puede obtener mediante la integración de la curva de CA (véase también la Figura 6):

Cálculo de la carga eléctrica, ecuación, \( Q_P = \int_0^t i \, dt \), método de integración.

(Ecuación 2)

La carga eléctrica teóricamente posible se calcula mediante la ley de Faraday:

Ecuación de termodinámica Qth=ΔcVzF, análisis de potencial químico, uso educativo.

(Ecuación 3)

Donde V es el volumen del medio de crecimiento, F la constante de Faraday (F = 96,485.34 C/mol), z el número de electrones liberados por el sustrato oxidado (en el caso del acetato se liberan 8 electrones durante la oxidación a CO2) y Δc = c0-c1, que representa el consumo de sustrato (se determina mediante métodos de análisis químico, por ejemplo, mediante HPLC).

2. Voltametría cíclica:

Se registran voltamogramas cíclicos para condiciones de no rotación y para condiciones de rotación (como se indica en la Figura 4). En ambos casos se puede obtener diferentes tipos de información. A continuación, se discute cómo se pueden identificar los sitios de TTE posibles y reales.

2.1 Condiciones de no recambio: identificación de sitios de TTE posibles:

Figura 7 muestra curvas voltamétricas típicas para condiciones sin recambio, es decir., en ausencia de sustrato. Figura 7A muestra la CV de una biopelícula para altas velocidades de barrido (aquí 50 mV/s), donde solo se puede identificar un par de picos y, por lo tanto, un único potencial formal Ef. En general, el potencial formal de un par redox se puede calcular a partir del potencial del pico de oxidación EpA y del potencial del pico de reducción de la especie respectiva EpC mediante el cálculo de la media aritmética (véase también Figura 7C):

Ecuación de electroquímica: Ej = (EpA + Epc)/2, analizando el potencial redox en estudios de voltametría.

(Ecuación 4)

Cuando se aplica una velocidad de barrido suficientemente baja al biofilm idéntico (aquí 1 mV/s), se pueden identificar hasta cuatro pares redox (los respectivos potenciales formales se indican en Figura 7B). La razón es que la corriente capacitiva de fondo disminuye al utilizar velocidades de barrido más bajas, véase también Cuadro 1 y p. ej.17,21 para más detalles. Sin embargo, la CV sin transferencia solo muestra todos los compuestos redox activos en el electrodo y, por lo tanto, el Ef de los sitios de EET posibles. Solo el análisis de la CV con transferencia proporciona el Ef de los sitios de transferencia de EET reales (véase el paso 2.2).

Al analizar más a fondo los CV de no intercambio, se pueden examinar diferentes parámetros característicos adicionales, como la separación de picos ΔEp (Ecuación 5) o la corriente máxima de pico ipA y la corriente mínima de pico ipC (véase la Figura 7C).

Ecuación de equilibrio estático ΔEP=EpA-EpC; diagrama de fórmula con fines educativos.

(Ecuación 5)

Estos parámetros, especialmente cuando se registran a diferentes velocidades de barrido, pueden utilizarse para el análisis mecanicista y cinético de los procesos de transferencia de electrones en electrodos. Sin embargo, este análisis cinético, bien establecido para sistemas químicos, no es directo para biofilms microbianos electroactivos, véase e.g.19,30

  1. Condiciones de rotación – identificación de sitios EET reales:

Al realizar la medición de CV en presencia de sustrato, se obtiene una CV de turnover (véase Figura 8A). Después de graficar los datos, puede observarse la curva típica en forma de s, denominada curva bioelectrocatalítica17-19. Al analizar más a fondo los datos, el máximo de la primera derivada, es decir. el punto de inflexión de la curva CV, proporciona el potencial formal Ef del actual Sitio(s) de EET (ver Figura 8B). En el caso de un joven, es decir. delgado, Geobacteraceae-biofilm dominante, aquí a las 168 h después de iniciar CA, pueden observarse dos puntos de inflexión. Posteriormente, la derivada muestra dos máximos correspondientes al potencial formal de los sitios EET activos en bioelectrocatalisis: -0,376 V y -0,295 V frente a Ag/AgCl (KCl sat., 0,197 V frente a SHE). En Figura 7B estos sitios se denominan como Ef,2 y Ef,3, respectivamente. Este hallazgo también muestra que los procesos redox asociados con los potenciales formales Ef,1 y Ef,4 (en el CV sin recambio) no están relacionados con la bioelectrocatalisis. A medida que el biofilm crece y se vuelve más grueso, el CV muestra solo un punto de inflexión, es decir, lo que significa un máximo en la curva de la derivada. Este potencial formal Ef, aquí siendo -0,32 V frente a Ag/AgCl (KCl saturado), es (aproximadamente) igual al promedio aritmético de los dos potenciales formales asignados a la TTE de la biopelícula delgada (por ejemplo aquí Ef,2 y Ef,3) – véase Figura 9Esto demuestra que este análisis CV tan fundamental sí proporciona información sobre la termodinámica de la EET de forma rápida y no invasiva, pero es importante señalar que no permite obtener conclusiones adicionales sobre aspectos mecanicistas o cinéticos.

Es importante destacar que los biofilms obtenidos bajo las condiciones específicas de este protocolo están altamente dominados por especies de Geobacter (no demostrado aquí)12,15. La modificación de parámetros seleccionados, por ejemplo, sustrato, temperatura, etc., también influirá en la composición microbiana y, por tanto, en las propiedades electroquímicas.

Tabla 1. Medio de crecimiento según Kim et al.32

Componente(mg/L) / (ml/L)   
NaH2PO4•H2O2,690.00
Na2HPO44,330.00
NH4Cl310.00
KCl130.00
acetato de sodio820.00
solución de metales12.50
solución de vitaminas12.50
Tabla 2. Componentes de la solución de metales y vitaminas33.
Solución de elementos traza:Solución de vitaminas:
Componentemg/L   Componentemg/L   
Ácido nitriloacético1,500.0Biotina2.0
MgSO4•7H2O         3,000.0Ácido fólico2.0
MnSO4•2H2O         500.0Clorhidrato de piridoxina10.0
NaCl  1,000.0Clorhidrato de tiamina5.0
FeSO4•7H2O          100.0Riboflavina5.0
CoSO4 o CoCl2     100.0Ácido nicotínico5.0
CaCl2•2H2O            100.0DL-Pantotenato de calcio5.0
ZnSO4   130.0Vitamina B120.1
CuSO4•H2O10.0Ácido p-aminobenzoico5.0
AlK(SO4)2               10.0Ácido lipoico5.0
H3BO3 10.0
Na2MoO4•2H2O     10.0
Nota: Disuelva el ácido nitriloacético con KOH hasta pH 6,5 y luego proceda a añadir los minerales.


Diagrama de terminologías bioelectroquímicas; incluye ecuaciones y fórmulas en electroquímica.
Configuraciones de parámetros de voltametría cíclica y guía de solución de problemas, centrada en ajustes de la ventana de potencial y de la velocidad de barrido para experimentos óptimos de CV.

Diagrama de transferencia microbiana de electrones; vías MET, DET, MIET, DIET; análisis de transporte de electrones.
Figura 1. Esquema de los posibles mecanismos microbianos de transferencia extracelular de electrones. Haga clic aquí para ver la imagen ampliada.

Proceso de muestreo de agua; muestreador de cubeta recolectando muestras del flujo de tratamiento de aguas residuales.
Figura 2. Muestreo en la planta de tratamiento de aguas residuales después del colector de rejilla (planta de tratamiento de aguas residuales, Alemania). Haga clic aquí para ver la imagen ampliada.

Diagrama y foto de la celda electroquímica con potenciostato, configuración de electrodos; CE, RE, WE etiquetados.
Figura 3. Configuración de tres electrodos. (A) Esquema, (B) reactor real; CE = electrodo contraelectrodo, RE = electrodo de referencia, WE = electrodo de trabajo con biofilm microbiano electroactivo, SP = puerto de muestreo. Haga clic aquí para ver la imagen ampliada.

Gráfico electroquímico; análisis de CV; corriente vs tiempo; enfoque de estado estacionario; datos en microamperios y horas.
Figura 4. Gráfico del crecimiento de biopelícula en un inóculo de aguas residuales en modo de alimentación por lotes mediante cronoamperometría. La corriente oxidativa alcanza un estado estacionario tras tres ciclos de cambio de medio. Se indican la fase de latencia y los momentos de cambio de medio, así como la realización de voltametría cíclica con recambio (CV) y sin recambio (CV) para condiciones de biopelícula en estado estacionario (datos originales de Liu14). Haga clic aquí para ver la imagen en tamaño ampliado.

Análisis electroquímico, diagrama E-t, voltametría cíclica, potencial frente a tiempo, química analítica.
Figura 5. Curso del potencial en función del tiempo durante un ciclo de voltametría cíclica. La voltametría cíclica comienza en el potencial inicial Ei. El voltaje aplicado cambia linealmente con el tiempo a una velocidad de barrido v. En un potencial de vértice seleccionado E1, el voltaje regresa a un potencial final E2, en este caso E2 = Ei. Haga clic aquí para ver la imagen ampliada.

Gráfico de análisis electroquímico con densidad de corriente j frente al tiempo t, que ilustra el pico jmax.
Figura 6. Cronoamperograma típico de un ciclo de crecimiento de un biofilm derivado de aguas residuales; en este se indican la densidad de corriente máxima jmax, la carga eléctrica (práctica) circulada Qp, el muestreo de la concentración inicial de sustrato c0 y la concentración de sustrato tras un ciclo de crecimiento c1 . Haga clic aquí para ver la imagen ampliada.

Gráfico de análisis electroquímico; diagramas de voltametría cíclica que muestran los resultados de corriente frente a voltaje.
Figura 7. Voltagramas cíclicos sin transformación de un biofilm de G. sulfurreducens. Velocidad de barrido: (A) 50 mV/s, (B) 1 mV/s 23; (C) ampliación de B, que muestra la densidad de corriente máxima (jpA) y el potencial máximo correspondiente (EpA) del ánodo en los máximos. De manera correspondiente, en los mínimos se muestran la densidad de corriente máxima (jpC) y el potencial máximo correspondiente (EpC) del cátodo. El potencial formal Ef y la separación entre picos ΔEp se obtienen de la Ecuación 4 y la Ecuación 5, respectivamente (para más detalles, véase el texto a continuación). Haga clic aquí para ver la imagen en tamaño mayor.

Análisis electroquímico; gráfico de voltametría; corriente frente a potencial; detección de picos; análisis de datos.
Figura 8. (A) Voltamograma cíclico de actividad catalítica de una biopelícula metabolizante de G. sulfurreducens. La velocidad de barrido fue de 5 mV/s. (B) Derivadas primeras de la curva voltamétrica23. Se indican los potenciales formales de los sitios reales de TET: Ef,2 y Ef,3. Haga clic aquí para ver la imagen ampliada.

Cyclic voltammetry graph; current vs. potential; electrochemical analysis; data results.
Figura 9. (A) Voltamograma cíclico de renovación y (B) derivadas primeras de un metabolizador más grueso G. sulfurreducens biofilm. La velocidad de barrido fue de 5 mV/s (comparar Figura 8). Haga clic aquí para ver la imagen en tamaño ampliado.

Discusión

El protocolo presentado muestra una forma fácil y directa de cultivar biopelículas microbianas electroactivas a partir de inoculación de aguas residuales utilizando una configuración de tres electrodos en un reactor alimentado por lotes. La cronoamperometría permite el crecimiento y la selección de biopelículas microbianas electroactivas a partir de diversos inóculos, así como la caracterización fundamental de las biopelículas en términos de densidad de corriente máxima y eficiencia culombiana. La voltametría cíclica, al ser una técnica no invasiva, permite realizar estudios fundamentales sobre la termodinámica de EET de la biopelícula microbiana y, por lo tanto, identificar sitios de transferencia de EET posibles y reales. Juntos, estos parámetros permiten i) caracterizar y comparar diferentes biopelículas microbianas para condiciones idénticas, así como ii) estudiar el impacto de diferentes condiciones operativas en biopelículas microbianas electroactivas idénticas. Sin embargo, estos experimentos solo pueden ser un punto de partida. Por un lado, el campo multifacético de la bioelectroquímica microbiana requiere una explotación más profunda de los métodos y protocolos electroquímicos. Esto incluye, por ejemplo, modelos para extraer datos cinéticos y mecanicistas, así como otros métodos como la espectroscopia de impedancia electroquímica34,35. Por otro lado, los métodos electroquímicos no pueden proporcionar información sobre la naturaleza molecular, la composición microbiana, la organización microbiana espacial, etc. Aquí se necesitan otras técnicas que no sean invasivas y estén acopladas a la electroquímica o invasivas4. El recuadro 2 proporciona una breve discusión sobre los pasos críticos al realizar los experimentos, así como sobre la resolución inicial de problemas.

Desde la perspectiva de la ingeniería, debe tenerse en cuenta que el ánodo de biopelícula electroactiva es solo un componente de los sistemas bioelectroquímicos microbianos actuales y se deben analizar una multitud de otros factores para sistemas completos36. Sin embargo, esperamos que este video-artículo ayude a comprender y adaptar los elementos centrales de BES, es decir , los electrodos microbianos, en el futuro.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

F.H. agradece el apoyo del BMBF (Premio de Investigación "Procesos biotecnológicos de próxima generación - Biotecnología 2020+") y de la Asociación Helmholtz (Grupo de Jóvenes Investigadores).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aguas residuales primariasPlantaTomado después de la filtración mecánica
250 ml Matraces de fondo redondo con tres entradas adicionalesTh.Geyer Berlin GmbH, Alemania9.011 845conectaron entradas adicionales con nuestro electrodo de
referencia de Ag/AgCl (sat. KCl, 0,195 V vs. SHE) con diafragma cerámicoSensortechnik Meinsberg, AlemaniaSE 11
Varillas de grafito (Ø=1 cm, l=3 y 5 cm)CP-Handels-GmbH, Wachtberg, AlemaniaUtilizado como material de electrodo
Acero inoxidable, n.º 1.4301, alambre Fe/Cr18/Ni10Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Alemania155-923-05
Tapones de siliconaTh.Geyer Berlin GmbH, Alemania9.230 512 y
ParafilmneoLab, Heidelberg, Alemania3-1011Para el sellado para mantener las condiciones anaeróbicas
Potenciostato/ Galvanostato Modelo MPG2BioLogic Science Instruments, Francia
EC-LabBioLogic Science Instruments, FranciaSoftware para realizar mediciones electroquímicas
Origin 8.6Software de análisis de datosOriginLab
de tratamiento de aguas residuales Se

Referencias

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